一种基于高通量测序的泡型包虫高灵敏度检测方法及应用

技术领域

本发明涉及微生物检测技术领域，涉及一种通过高通量测序方法进行泡型包虫高灵敏度检测的方法，具体涉及一种通过检测受试者的外周血检测来自泡型包虫的特征性游离DNA的方法、试剂盒及其应用。

背景技术

泡型包虫病(echinococcosis)又称多房棘球蚴病，是由多房棘球绦虫(AlveolarEchinoccosis，AE)幼虫引起的一种严重危害人畜共患寄生虫病。该病在北半球广泛分布，我国主要分布在甘肃、青海、西藏、新疆和四川等西部牧区和半农牧区。据报道，在泡型包虫病流行区，每10万居民中就有0.03到1.2人发病，在重流行区发病人数更高。

泡型包虫病起病隐匿，发病迅速，类似恶性肿瘤，可从肝脏经血液、淋巴循环转移或扩张至其他重要器官，故有“虫癌”之称。泡型包虫病潜伏期无临床症状，患者一旦发现再行就诊时多属晚期。泡型包虫病的诊断目前主要依赖临床症状、使用B超、CT、X射线等影像学技术与血清学检测等，然而对于部分患者常规影像学检查使一些非典型和体积较小的病灶与肝癌和肝脓肿等相混淆，术前难以进行明确诊断，而血清学检测使用的粗抗原则缺乏敏感性和特异性，对疾病的诊断特异性较差。目前，尚未有一项成熟的技术可对早期泡型包虫病进行检测。

2018年，法国学者Alice Baraquin等首次发现泡型包虫病患者外周血血浆中含有AE游离核酸该团队指出该方法创面小，检测便捷，为泡型包虫病早期筛查与病程持续监测提出可行性。但该研究结论认为AE-C-cfDNA在AE患者中的检出阳性率过低，无法作为AE检测和诊断的生物标志物。我们推测这可能与文章所应用的qPCR或ddPCR技术本身的局限性相关。文章通过细胞核及线粒体中共两个靶向区域进行PCR靶向检测，检测靶区域范围极小，而死亡的AE虫体向循环系统释放破碎的基因片段是随机的，无法通过PCR检测特定的序列确定AE-C-cfDNA在外周血中是否存在，这就限制了通过PCR技术检测外周血中AE游离核酸的灵敏度。因此需要多靶向片段甚至虫体全基因组的扫描，但检测位点有限的PCR技术是很难完成的。

近年来发展的高通量测序手段，检测灵敏度高，可通过人体外周血中总游离核酸检测的方式，进行泡型包虫核酸的筛查。但人体外周血中存在大量宿主细胞游离核酸，与包虫游离核酸片段大小相近，难以通过核酸序列以外的方式进行区分。通过高通量测序技术对外周血总游离核酸扫描的方式进行泡型包虫病的筛查，可通过两种形式进行：①超高深度测序筛查，会造成极大程度检测数据的冗余，对患者造成极大经济负担；②常规深度筛查，可能导致无法捕获或检测目标reads数极少，很大程度降低了泡型包虫病的检测灵敏度。

因此，亟需开发一种基于高通量测序技术检测AE疑似患者外周血中泡型包虫游离核酸的方法。

发明内容

本发明的主要目的在于提供一种基于高通量测序的泡型包虫高灵敏度检测方法及应用，该方法可以有效判断宿主是否存在泡型包虫感染，即便是在未出现临床症状的早期感染时，宿主外周血中也能通过本发明方法灵敏地检测到泡型包虫来源的游离DNA；检测灵敏度高、特异性好，检测结果准确可靠，实现了对患者血液中AE-C-cfDNA的高灵敏度检测，进而达到泡型包虫病的早期预警的目的。

为达到以上目的，本发明采用的技术方案为：一种基于高通量测序的泡型包虫高灵敏度检测方法，其特征在于，包括一种检测受试者样品中泡型包虫特征性游离核酸(AE-C-cfDNA)的高通量测序检测方法，一种探针组合，可特异性结合外周血中泡型包虫游离DNA，一种用于高通量测序的泡型包虫诊断受试者是否正经受泡型包虫感染的方法。

进一步地，所述一种检测受试者样品中泡型包虫特征性游离核酸(AE-C-cfDNA)的高通量测序检测方法，包括如下步骤：

步骤S1：提取受试者样品中的游离DNA(cfDNA)；

步骤S2：将经过步骤S1所得cfDNA进行泡型包虫特异性游离核酸(AE-C-cfDNA)靶向富集文库构建并进行测序；

步骤S3：对步骤S2的测序数据进行特定数据库中的生物信息学分析，得到AE-C-cfDNA是否存在，从而判断患者是否感染泡型包虫病。

进一步地，步骤S1中所述的提取受试者样品中的游离DNA由商品化的试剂盒QIAamp MinElute ccfDNAMini Kit或其它有相同/似功能的试剂盒完成。

进一步地，步骤S2中所述的AE-C-cfDNA靶向富集文库构建与测序，具体包括如下步骤：

1)进行游离核酸的文库构建(Illumina平台、Ion torrent平台或其它具有相同/似功能的高通量测序平台均可)；

2)进行泡型包虫特征性游离DNA(AE-C-cfDNA)探针库搭建与生物素标记；

3)进行探针库2)与文库1)进行杂交；

4)通过包被链霉亲和素的磁珠捕获AE-C-cfDNA。

进一步地，所述用于高通量测序的泡型包虫诊断受试者是否正经受泡型包虫感染的方法，包括如下步骤：

步骤C1：提供来自受试者的外周血样品；

步骤C2：使用所述检测受试者样品中泡型包虫特征性游离核酸(AE-C-cfDNA)的高通量测序检测方法检测所述样品是否存在AE-C-cfDNA，如果存在AE-C-cfDNA，则指示所述受试者正经受泡型包虫感染；

步骤C3：如果所述受试者正经受泡型包虫感染，对其实施泡型包虫感染的治疗。

本发明的另一个目的，在于提供一种所述用于高通量测序的泡型包虫诊断受试者是否正经受泡型包虫感染的试剂盒，其特征在于，其包含上述探针库；用于检测受试者样品中泡型包虫特征性游离核酸(AE-C-cfDNA)的试剂为用于提取受试者样品中的游离DNA的试剂，用于DNA文库构建及靶向富集的试剂，用于高通量测序的试剂中的至少一种。

本发明的另一个目的，在于提供一种所述用于高通量测序的泡型包虫诊断受试者是否具有泡型包虫感染的系统，其特征在于，包括：

a)从受试者获得的外周血样品；

b)用于提取受试者样品中的游离核酸(cfDNA)的工具；

c)用于将泡型包虫特征性游离核酸(AE-C-cfDNA)进行文库构建并进行泡型包虫特征性游离核酸的富集(包括探针库)与测序的工具；

d)用于执行测序数据分析的工具。

由于上述技术方案运用，本发明与现有技术相比具有下列优点：

(1)本发明的一种基于高通量测序的泡型包虫高灵敏度检测方法，该检测对象为泡型包虫特征性游离DNA(AE-C-cfDNA)，在泡型包虫感染人类宿主后，其自身降解的DNA片段会进入到人体外周血中，本方法结合高通量测序及探针库的优势，通过多种泡型包虫特征性游离DNA，可实现简便灵敏对病原富集的目的。

(2)本发明的一种基于高通量测序的泡型包虫高灵敏度检测方法，与现有技术中已知的泡型包虫病检测方法相比，本发明的技术方案无需从泡型包虫虫体提取DNA，只需要提取受试者外周血样品中的游离DNA，即可检测出泡型包虫来源的游离DNA，使得检测时样本收集无创便捷。

(3)本发明的一种基于高通量测序的泡型包虫高灵敏度检测方法，克服了高通量测序中大量宿主信息冗余导致泡型包虫检测灵敏度大幅下降的缺陷，检测灵敏度高、特异性好，检测结果准确可靠，实现了对患者血液中AE-C-cfDNA的高灵敏度检测，有利于泡型包虫病的早期预警。

(4)本发明的一种基于高通量测序的泡型包虫高灵敏度检测方法，由此可以判断宿主是否存在泡型包虫感染。即便是在未出现临床症状的早期感染时，宿主外周血中也能通过本发明方法灵敏地检测到泡型包虫来源的游离DNA。因此，可以在感染早期就发现泡型包虫感染，进而针对泡型包虫感染实施早期治疗性介入与监测泡型包虫病治疗的效果。

(5)本发明的一种基于高通量测序的泡型包虫高灵敏度检测方法及应用，提供了对受试者外周血中游离核酸进行提取、文库构建、靶向富集、高通量测序和生物信息学分析的方法，实现了患者外周血中性泡型包虫特异性游离核酸(AE-C-cfDNA)的检测。AE-C-cfDNA可作为临床AE诊断的分子标记物。本发明的方法检测灵敏度高、特异性好，临床样本检测结果准确可靠。

具体实施方式

以下描述用于揭露本发明以使本领域技术人员能够实现本发明。以下描述中的优选实施例只作为举例，本领域技术人员可以想到其他显而易见的变型。

除非特别指明，本说明书所用术语具有所属技术领域一般技术人员理解的通常含义。以下列出了本文所用一些术语的解释，除非特别指明，这些术语的解释以本文定义为准。

术语“游离DNA”，又称循环无细胞DNA(Circulating Cell-free DNA,cfDNA)是一种无细胞状态的胞外DNA，广泛存在于人体体液中，通常是脱离其天然存在状态的片段化的DNA。在本发明的实施方案中，使用怀疑感染了多房棘球绦虫的受试者的血浆样品的循环无细胞DNA。

术语“AE-C-cfDNA”指从受试者的血浆样品中分离的来自多房棘球绦虫(其引起泡型包虫病(Alveolar Echinococcosis,AE))的特征性循环无细胞DNA，特指本发明中可与探针库有同源区(可杂交)的DNA。

本发明中，所述所有临床样品均为外周血样品，特别地是血浆样品。所述样品可以来自棘球绦虫感染的宿主，例如牛、羊、猪、人等，优选为人。

本发明中，样本游离核酸的提取采用QIAamp MinElute ccfDNAMini Kit或其它有相同/似功能的试剂盒完成。

本发明中，样本文库构建试剂盒针对不同高通量测序平台可采用相应建库试剂盒完成，本文实施例中提供方法为KAPALibrary Preparation Kits(Illumina平台)。

本发明中，可以通过本领域已知的任何高通量测序技术进行测序(需配备相应平台的文库构建及上机测序试剂盒等)，本发明的实施例提供方法为例如Illumina测序平台(Nextseq550等)。

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

由于在外周血样本中存在极大量的宿主游离DNA，严重干扰了包虫游离DNA检测的灵敏度，因此在本发明中，采用5’端标记有生物素的探针库，探针库针对大量包虫特异性核酸片段，可通过与包被链霉亲和素的磁珠杂交得到富集，从而大大提高包虫在宿主外周血中的检测灵敏度。

在本发明的方法中流程如下：分离并提取外周血血浆样本；构建文库(采用本领域已知的方法进行，流程包括，末端修复、加接头、进行PCR文库富集等)；文库与标记生物素的包虫特异性探针库进行杂交，并通过磁珠捕获富集；通过Qubit和Agilent2100对文库质量和浓度进行检测和鉴定；测序并完成数据分析。

实施例1

本实施例提供一种基于高通量测序平台进行外周血中泡型包虫游离核酸的检测方法，具体地，包括如下步骤：

1.外周血中游离核酸的提取，通过QIAamp MinElute ccfDNAMini Kit完成。

(1)取1-4mL血浆样本，加入相应量的磁珠、Proteinase K和结合缓冲液，混合均匀；将其置于样本混匀仪上，混匀10min，瞬时离心；将管置于磁力架上，静置2min，至溶液变澄清，移除上清；

(2)向管中加入200μL清洗缓冲液，旋涡混匀，将混合液转至一新的1.5mL离心管中，室温孵育5min；将管置于磁力架上，静置2min，至溶液变澄清，将上清转至一新的1.5mL离心管中；向上述上清液中加入300μL缓冲液ACB，混匀；

(3)将上述混合液转至MinElute吸附柱中，6000g离心1min，将吸附柱转至一新的收集管中；向吸附柱中加入500μLACW2，6000g离心1min，将吸附柱转至一新的收集管中14000g离心3min，将吸附柱转至一新的1.5mL洗脱管中，打开盖子，56℃孵育5min；

(4)向吸附柱中加入60μL无核酸酶水，室温孵育1min，14000g离心1min，丢弃吸附柱，回收溶液即为提取的游离核酸(包含大量宿主游离核酸及微量包虫游离核酸)。

2.文库构建

所用试剂盒为KAPALibrary Preparation Kits。文库构建流程包括末端修复、末端加A、加接头、文库扩增四步。

A)末端修复

(1)取富集提取的游离核酸DNA 50μL，加入8μL无核酸酶水，7μL末端修复缓冲液，5μL末端修复酶，混合均匀；

(2)将反应管置于PCR仪，按下述程序进行反应：20℃，30min；

(3)向反应结束的反应管中加入120μL(1.7×)KAPA纯化磁珠，旋涡混匀，室温放置5min；将反应管置于磁力板上，静置3min，至溶液澄清，移除上清；向管中加入200μL新鲜配制的80％乙醇，室温孵育30s，移除上清；重复步骤5一次；室温干燥3-5min，将管从磁力板上取下；

B)末端加A

(1)配制末端加A混合液：取一200μLPCR管，按顺序加入42μL无核酸酶水、5μL末端加A缓冲液、3μL末端加A酶，混合均匀，瞬时离心；

(2)将配制好的上述反应液加入到第一步中，经室温干燥含有磁珠的管中，旋涡混匀；将反应管置于PCR仪，运行下述程序：30℃，30min；反应结束后，向反应液中加入90μLPEG/NaCl溶液，旋涡混匀，室温孵育10-15min；将反应管置于磁力板上，静置3min，至溶液澄清，移除上清；向管中加入200μL新鲜配制的80％乙醇，室温孵育30s，移除上清；重复步骤6一次；

(3)室温干燥3-5min，将管从磁力板上取下。

C)加接头

(1)配制接头连接混合液：取一200μLPCR管，按顺序加入30μL无核酸酶水、10μL连接缓冲液、5μLDNA连接酶，旋涡混匀；

(2)将上述配制的接头连接混合液加入到第二步干燥的磁珠中，加入5μL相应的接头储存液；

(3)将反应管置于PCR仪汇总，按下述程序进行反应，20℃，15min；反应结束后，向反应液中加入50μLPEG/NaCl溶液，旋涡混匀，室温孵育10-15min；

(4)将反应管置于磁力板上，静置3min，至溶液澄清，移除上清；向管中加入200μL新鲜配制的80％乙醇，室温孵育30s，移除上清；重复步骤6一次；室温干燥3-5min，将管从磁力板上取下；

(5)用50μL洗脱缓冲液重悬磁珠，室温孵育2min；向上述磁珠溶液汇中加入50μL的PEG/NaCl溶液；旋涡混匀，室温孵育5-15min，瞬时离心，将管置于磁力架上，静置2min至溶液澄清，移除上清；向管中加入200μL新鲜配制的80％乙醇，室温孵育30s，移除上清；重复步骤13一次；

(6)将管置于磁力架上，室温干燥3-5min，向管汇总啊计入25μL洗脱缓冲液，重悬磁珠，室温孵育2min；将管置于磁力架上，静置2min，至溶液澄清，转移20μL上清液于一新的200μL管中，备用。

D)文库扩增

(1)向上述步骤三制得的20μL核酸溶液中加入25μL扩增缓冲液、5μL引物混合液，混合均匀；

(2)将反应管置于PCR仪中，按下述程序进行反应98℃，45s，1个循环；98℃，15s→60℃，30s→72℃，1min，8-10个循环；72℃，1min，1个循环，4℃，hold

(3)反应结束后，向反应管中加入50μL(1×)KAPA纯化磁珠，旋涡混匀，室温放置5min；

(4)将反应管置于磁力板上，静置3min，至溶液澄清，移除上清；

(5)向管中加入200μL新鲜配制的80％乙醇，室温孵育30s，移除上清；

(6)重复步骤5)一次；

(7)室温干燥3-5min，将管从磁力板上取下；

(8)加入30μL洗脱缓冲液，混匀，室温孵育2min；

(9)将管置于磁力架上，静置2min至溶液变澄清，将上清转至200μL PCR管中，进行Qubit定量和Agilent2100文库质量鉴定。

3.包虫特异性引物探针的制备与靶向杂交

泡型包虫游离DNA特异性捕获探针库的制备需要考虑如下几方面：包括捕获探针库的特异性，覆盖位点的全面性及检测的灵敏度等。由于外周血中泡型包虫游离DNA的多位点特异性检测为创新性活动，因此针对其特异性及覆盖位点全面性，需进行大量文献的调研及基因组序列的比对；检测灵敏度等则需进行探针性质(序列及长度等)、杂交条件(温度及时间等)等充分摸索，由于外周血中包虫游离DNA片段长度大多在150bp左右，因此需结合常规探针设计原则与游离DNA的特殊性进行设计。

最终优选了针对6个泡型包虫基因中特异性序列的77个长度为50nt左右的探针(详见表1)，并通过专业探针分析软件明确其GC含量、退火温度等，并通过泡型包虫基因组及游离DNA进行了每个探针的性能筛选，最终确定特异性及灵敏度高且覆盖全面的探针库，进行5’端生物素标记，完成探针库的构建。

表1泡型包虫探针

(1)捕获探针库杂交与靶序列的富集

A.捕获探针库杂交：将外周血中游离DNA与泡型包虫特异性游离DNA探针库进行杂交。

a)将游离DNA与杂交缓冲液混合，PCR或金属浴95℃3-10min解链，优选5min。

b)将a)与捕获探针库混合并置于PCR仪或金属浴中进行孵育，测试孵育温度50℃，55℃，60℃与65℃；测试杂交时间为4h，6h，8h，12h与16h，优选60℃，6h。

B.靶序列的富集：将商品化包被链霉亲和素的磁珠50μL与杂交反应完成的混合液100μL进行孵育，并通过商品化链霉亲和素磁珠使用说明书进行富集。

4.上机测序：可采用Nextseq550等Illumina平台仪器，按照商品化说明书进行测序。

5.生物信息学分析

测序完成，对测序数据进行分析，分析流程如下：

测序数据质量评估：通过计算测序数据的质量，去除低质量的序列数据，所述的低质量的序列包括：碱基质量均值小于10的序列、接头序列、重复序列、长度小于60bp的序列。

与包虫特征性数据库进行比对：将数据与所构建的包虫特征性数据库进行比对，得到可与包虫成功匹配的序列，并获得比对序列数、覆盖度、置信指数在内的多项参数的检测结果。所述包虫数据库包括包虫的参考序列，参考序列是从NCBI、JGI、PATRIC等公共数据库中下载的基因组序列，并通过分析去冗余和聚类分析，选取最优质的代表性序列构成该数据库。

阳性判读：指根据与包虫数据库比对结果得出的各项参数，进行判断。

二对比方法：对比方法与本发明方式流程类似，进行核酸提取-文库构建-上机测序-数据分析，不进行包虫特异性游离核酸靶向富集。

三对比测试结果

对10例AE阳性患者的外周血样本进行检测，检测结果如下表2和表3所示，由表2各样本产出数据量可以看出，各样本产出数据量在1000万条reads以上，采用常规试剂盒宿主序列数占比在68.55％～95.62％不等，采用本发明宿主序列数占比在0％～1.3％之间。通过表3结果表明，游离核酸中包虫特异性片段得到极大程度的富集，提升了数据质量，更有利于微生物的检出与判读。

表2.10例外周血样本产出数据及宿主reads占比情况

表3.10例外周血样本多房棘球绦虫检出特异性reads数对比

实施例2

基于高通量测序平台进行泡型包虫核酸检测方法的特异性验证

按照上述实施例1的发明方式对常见细菌、病毒、真菌及寄生虫的基因组进行检测，其中包括常见细菌10种，常见真菌5种，常见病毒5种，常见寄生虫3种及人基因组1种。具体如表4所示。本检测方法特异性良好，均未检测到非特异序列。

表4.特异性检测用核酸指标列表

实施例3

基于高通量测序平台进行外周血中泡型包虫游离核酸的检测方法的临床应用

按实施例1的方法对143例临床样本进行外周血检测，其中包括37例阴性样本及106例确诊AE的阳性样本(包括AE早期43例，AE中期27例，AE晚期36例)。本发明检测结果及院方检测结果(包括血清学检测结果及影像学结果等)如表5所示；检测结果统计如表6所示。其中敏感度计算公式是：真阳性/(真阳性+假阴性)×100％。本发明敏感度为100％。特异性计算公式为：真阴性/(真阴性+假阳性)×100％。本发明特异性为89.1％。

其中四例院方检测阴性，但本发明检测阳性的结果，通过采用院方检测方式进行复测，该四例均为阳性(AE早期)。推测本发明可以通过靶向富集，大幅度提高检测灵敏度，尤其提高临床样本中AE早期的一次性检出率。

表5.样本检测结果

表6.检测结果统计表

以上所述仅是本发明的部分实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进，这些改进应视为本发明的保护范围。