一种人脐带来源Muse细胞的筛选与鉴定方法

技术领域

本发明涉及一种人脐带来源Muse细胞的筛选与鉴定方法，具体为一种人脐带来源Muse细胞的筛选与鉴定方法，属于细胞研究技术领域。

背景技术

随着干细胞技术在治疗疾病中的发展，人们越来越认识到干细胞技术对于人类健康的促进作用。近年来发现来源于间充质干细胞的Muse细胞，在干细胞移植方面具有抗应激能力强，归巢效果好，成瘤性低等特点，为干细胞治疗技术的进一步提高打开了新的方向。脐带间充质干细胞本身具有来源丰富，取材方便，对供者无创伤，易于分离培养和体外扩增，伦理限制较少，细胞更为原始等优点,使得Muse细胞的提取、纯化、扩增更加方面有效。目前对脐带源间充质干细胞中Muse细胞的培养的相关报道并不多见，其细胞的筛选、鉴定等的研究也鲜有报道。从脐带组织中分离培养Muse细胞的前景广阔，因此本项目拟通过实验建立一套完备而稳定的操作工艺，以获得较高纯度的Muse细胞。对今后Muse细胞在间充质干细胞治疗组织再生，免疫调节等临床应用提供一定参考。

发明内容

本发明的目的就在于为了解决问题而提供一种人脐带来源Muse细胞的筛选与鉴定方法。

本发明通过以下技术方案来实现上述目的：一种人脐带来源Muse细胞的筛选与鉴定方法，包括以下步骤：

步骤一、确定参与人员。

步骤二、确定实验仪器和试剂。

步骤三、Muse细胞的分选，通过流式细胞仪分选原代培养的真皮成纤维细胞SSEA-3阳性的细胞，并在MC培养基、poly-HEMA包被板条件下培养Muse细胞簇，观察其悬浮-贴壁-悬浮、增殖扩增这一自我更新的能力。

步骤四、Muse细胞的体外扩增，对分选获得的 Muse 细胞，采用悬浮培养-贴壁培养-悬浮培养的方式进行扩增。

步骤五、Muse细胞的鉴定，采用 FACS，从培养的脐带来源的间充质细胞，分选出抗SSEA-3 抗体阳性的细胞（Muse细胞）；进行碱性磷酸酶染色，用免疫荧光染色、逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）及 Western-blot 检测其多能性。

作为本发明再进一步的方案：所述步骤二中，实验仪器和试剂包括以下：

流式细胞仪、CO2培养箱、台式离心机、生物安全柜、显微镜、荧光显微镜及照相系统、酶标仪间充质干细胞无血清条件培养基（杭州百通）、0.25%胰酶（吉诺生物），anti-CD29、anti-CD45、anti-CD90、anti-CD105 （BD Biosciences），anti-CD34 （SantaCruzBiotechnology），anti-CD44 （Abcam），细胞周期即时检测试剂盒（凯基生物），成骨及成脂诱导分化培养液、茜素红、油红 O （Cyagen）、Anti-SSEA3、高糖 DMEM、胎牛血清。

作为本发明再进一步的方案：所述步骤四中，Muse细胞的体外扩增包括以下步骤：

（1）、将获得的MSC细胞通过200目细胞过滤器。在振荡器上，用SSEA3–FITC结合的抗体孵育，室温20分钟；

（2）、人Ig G-FITC用作同型对照，PI染色排除FACS分析中的死亡细胞，分选获得的单个细胞；

（3）、用MC培养基悬浮培养在Poly-HEMA包被6孔板里，每两天加入500ul MC培养基，四天后以1000转/分3分钟、800转/分5分钟、600转/分5分钟低速离心去除死亡的单个细胞；

（4）、随后继续悬浮培养，7天后将不再长大的Muse细胞簇离心重种到基质胶包被6孔板，观察其贴壁后生长情况，待细胞达90%融合后，以胰酶消化，再重新接种到Poly-HEMA包被6孔板用MC培养基悬浮培养。

作为本发明再进一步的方案：所述步骤五中，Muse细胞的的鉴定包括以下步骤：

（1）、取生长状态良好的第3代细胞分别进行以下鉴定：

（2）、CCK-8 法检测细胞活性；

（3）、流式细胞仪检测细胞周期；

（4）、流式细胞仪检测细胞表面CD29、CD34、CD44、CD45、CD90 、 CD105及SSEA3抗原；

（5）、加入成脂、成骨诱导分化液检测成脂、成骨诱导分化能力。

本发明的有益效果是：该人脐带来源Muse细胞的筛选与鉴定方法设计合理，通过流式细胞仪分选原代培养的真皮成纤维细胞SSEA-3阳性的细胞，并在MC培养基、poly-HEMA包被板条件下培养Muse细胞簇，观察其悬浮-贴壁-悬浮、增殖扩增这一自我更新的能力。通过对第3代Muse细胞的骨、成脂诱导，可使细胞分化为脂肪细胞和成骨细胞。证明本项目成功建立了一种人脐带来源Muse细胞培养方案。

附图说明

图1为本发明流程示意图。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

请参阅图1，一种人脐带来源Muse细胞的筛选与鉴定方法，包括以下步骤：

步骤一、确定参与人员。

步骤二、确定实验仪器和试剂。

步骤三、Muse细胞的分选，通过流式细胞仪分选原代培养的真皮成纤维细胞SSEA-3阳性的细胞，并在MC培养基、poly-HEMA包被板条件下培养Muse细胞簇，观察其悬浮-贴壁-悬浮、增殖扩增这一自我更新的能力。

步骤四、Muse细胞的体外扩增，对分选获得的 Muse 细胞，采用悬浮培养-贴壁培养-悬浮培养的方式进行扩增。

步骤五、Muse细胞的鉴定，采用 FACS，从培养的脐带来源的间充质细胞，分选出抗SSEA-3 抗体阳性的细胞（Muse细胞）；进行碱性磷酸酶染色，用免疫荧光染色、逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）及 Western-blot 检测其多能性。

进一步的，在本发明实施例中，所述步骤二中，实验仪器和试剂包括以下：

流式细胞仪、CO2培养箱、台式离心机、生物安全柜、显微镜、荧光显微镜及照相系统、酶标仪间充质干细胞无血清条件培养基（杭州百通）、0.25%胰酶（吉诺生物），anti-CD29、anti-CD45、anti-CD90、anti-CD105 （BD Biosciences），anti-CD34 （SantaCruzBiotechnology），anti-CD44 （Abcam），细胞周期即时检测试剂盒（凯基生物），成骨及成脂诱导分化培养液、茜素红、油红 O （Cyagen）、Anti-SSEA3、高糖 DMEM、胎牛血清。

进一步的，在本发明实施例中，所述步骤四中，Muse细胞的体外扩增包括以下步骤：

（1）、将获得的MSC细胞通过200目细胞过滤器。在振荡器上，用SSEA3–FITC结合的抗体孵育，室温20分钟；

（2）、人Ig G-FITC用作同型对照，PI染色排除FACS分析中的死亡细胞，分选获得的单个细胞；

（3）、用MC培养基悬浮培养在Poly-HEMA包被6孔板里，每两天加入500ul MC培养基，四天后以1000转/分3分钟、800转/分5分钟、600转/分5分钟低速离心去除死亡的单个细胞；

（4）、随后继续悬浮培养，7天后将不再长大的Muse细胞簇离心重种到基质胶包被6孔板，观察其贴壁后生长情况，待细胞达90%融合后，以胰酶消化，再重新接种到Poly-HEMA包被6孔板用MC培养基悬浮培养。

进一步的，在本发明实施例中，所述步骤五中，Muse细胞的的鉴定包括以下步骤：

（1）、取生长状态良好的第3代细胞分别进行以下鉴定：

（2）、CCK-8 法检测细胞活性；

（3）、流式细胞仪检测细胞周期；

（4）、流式细胞仪检测细胞表面CD29、CD34、CD44、CD45、CD90 、 CD105及SSEA3抗原；

（5）、加入成脂、成骨诱导分化液检测成脂、成骨诱导分化能力。

对于本领域技术人员而言，显然本发明不限于上述示范性实施例的细节，而且在不背离本发明的精神或基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现本发明。因此，无论从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本发明的范围由所附权利要求而不是上述说明限定，因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有变化囊括在本发明内。不应将权利要求中的任何附图标记视为限制所涉及的权利要求。

此外，应当理解，虽然本说明书按照实施方式加以描述，但并非每个实施方式仅包含一个独立的技术方案，说明书的这种叙述方式仅仅是为清楚起见，本领域技术人员应当将说明书作为一个整体，各实施例中的技术方案也可以经适当组合，形成本领域技术人员可以理解的其他实施方式。