一种表达大口黑鲈弹状病毒G蛋白的重组乳酸乳球菌

技术领域

本发明涉及水产养殖领域，尤其涉及一种表达大口黑鲈弹状病毒G蛋白的重组乳酸乳球菌。

技术背景

大口黑鲈是我国重要的经济养殖鱼类，具有生长快、适应性强、无肌间刺、肉质鲜美等优点，深受消费者的喜爱。近年来，我国的大口黑鲈养殖业发展迅速，随着养殖不断向大规模、集约化方向发展，导致养殖环境和养殖水域的水质日趋恶化，导致疾病频发，尤其是肠炎病、烂鳃病、弹状病毒病等疾病的爆发，使得大口黑鲈养殖业损失惨重。大口黑鲈弹状病毒主要感染大口黑鲈稚鱼，死亡率极高。目前水产养殖疾病的防控主要依赖于抗生素，但抗生素防治对病毒病基本没有效果，且抗生素滥用已经导致细菌耐药性、药物残留和环境中扩散等问题。

应用疫苗防控不仅可有效控制病毒性疾病发生，而且避免了药物长期使用导致的病原微生物耐药性问题。此外，针对大口黑鲈弹状病毒的感染特征，疫苗注射接种操作难度较大，因此口服接种和浸泡接种是较为理想的方式。但是，目前对于大口黑鲈弹状病毒，尚无相关疫苗研制的报道，严重制约了大口黑鲈弹状病毒病的防治。

发明内容

针对上述需求，申请人开发出了一种表达大口黑鲈弹状病毒G蛋白的重组乳酸乳球菌来解决以上问题。

为了实现上述目的，本发明提供了如下的技术方案：

一种表达大口黑鲈弹状病毒G蛋白的重组乳酸乳球菌，所述的重组乳酸乳球菌为转化了pMG36e-His-G蛋白重组质粒的乳酸乳球菌。

进一步的，上述一种表达大口黑鲈弹状病毒G蛋白的重组乳酸乳球菌，所述，所述的大口黑鲈弹状病毒G蛋白序列来源于Genebank，序列号为MK397811.2。

进一步的，上述一种表达大口黑鲈弹状病毒G蛋白的重组乳酸乳球菌的制备方法，包括以下步骤：

S1：重组质粒的构建；

S2：重组乳酸乳球菌的构建；

S3：重组乳酸乳球菌表达G蛋白的验证。

进一步的，上述一种表达大口黑鲈弹状病毒G蛋白的重组乳酸乳球菌的制备方法，所述步骤S1具体包括如下步骤：

从Genebank中获得大口黑鲈弹状病毒G蛋白的序列信息，然后通过全基因合成大口黑鲈弹状病毒G蛋白序列，并添加His标签和Sac I、Hind III酶切位点，然后连接至pMG36e重组质粒，然后转入DH5α感受态细胞，送上海生工测序验证pMG36e-His-G蛋白重组质粒是否构建成功。

进一步的，上述一种表达大口黑鲈弹状病毒G蛋白的重组乳酸乳球菌的制备方法，所述步骤S2具体包括如下步骤：

采用质粒大提试剂盒提取重组质粒，然后通过电转化的方式将pMG36e-His-G蛋白表达质粒转化至乳酸乳球菌，电转化的条件为2.0kV，电阻为400Ω，pMG36e质粒替代pMG36e-His-G蛋白表达质粒作为阴性对照。然后将乳酸乳球菌涂布于含有红霉素的M17培养基上，进行抗性筛选。

经抗性筛选后，通过试剂盒提取乳酸乳球菌DNA，然后通过PCR检测抗性阳性的乳酸乳球菌是否含有验证pMG36e-His-G蛋白重组质粒，筛选出阳性克隆的重组乳酸乳球菌。

进一步的，上述一种表达大口黑鲈弹状病毒G蛋白的重组乳酸乳球菌的制备方法，所述步骤S3具体包括如下步骤：

挑选阳性克隆的重组乳酸乳球菌，经红霉素抗性的M17培养基培养后，用抗His标签抗体通过western blotting分析G蛋白的表达情况，验证是否成功构建表达弹状病毒G蛋白的乳酸乳球菌；具体操作如下：

(1)取60μL重组乳酸乳球菌，加入15μL 5×Loading Buffer混合均匀，金属浴煮20min后，加入上样孔中，进行SDS-PAGE凝胶电泳；

(2)电泳结束后，通过电转移的方式将重组乳酸乳球菌全菌蛋白转移到PVDF膜上，并将PVDF膜置于5％BSA中，37℃条件下封闭2h；

(3)PVDF膜经PBS-T洗涤3次(每次5min)后，置于鼠抗His标签抗体(PBS稀释，1:1000)中，37℃孵育1h，无关鼠源抗体替代抗His标签抗体作为对照；

(5)PVDF膜经PBS-T洗涤3次(每次5min)后，置于HRP标记的山羊抗鼠IgG抗体(PBS稀释，1:10000)，37℃条件下孵育1h；

(6)PVDF膜经PBS-T洗涤3次(每次5min)后，使用DAB显色试剂盒进行显色，避光发色5-10min，用蒸馏水洗涤，终止发色，然后拍照、记录。

进一步的，所述的表达大口黑鲈弹状病毒G蛋白的重组乳酸乳球菌在制备大口黑鲈弹状病毒口服疫苗中的用途。

进一步的，所述的一种表达大口黑鲈弹状病毒G蛋白的重组乳酸乳球菌的制备方法在制备大口黑鲈弹状病毒口服疫苗中的用途。

本发明至少具有以下有益效果：本发明制备的重组乳酸乳球菌成功表达大口黑鲈弹状病毒G蛋白。大量研究已经表明弹状病毒G蛋白是与宿主互作，介导弹状病毒入胞的关键蛋白，是诱导宿主产生中和抗体的重要病毒蛋白，也是可以作为弹状病毒亚单位疫苗的效应成分的重要蛋白。本发明成功构建表达大口黑鲈弹状病毒G蛋白的乳酸乳球菌，因乳酸乳球菌的保护，可以递送大口黑鲈弹状病毒G蛋白进入鱼体肠道，为大口黑鲈弹状病毒口服疫苗的研制提供重要基础。

附图说明

附图1为Western blotting分析重组乳酸乳球菌表达大口黑鲈G蛋白的情况。泳道M：蛋白Marker；泳道1：SDS-PAGE分析含pMG36e-His-G蛋白重组质粒的重组乳酸乳球菌；泳道2：SDS-PAGE分析含pMG36e空质粒的重组乳酸乳球菌；泳道3：含pMG36e-His-G蛋白重组质粒的重组乳酸乳球菌与抗His标签抗体的免疫印迹结果；泳道4：含pMG36e空质粒的重组乳酸乳球菌与抗His标签抗体的免疫印迹结果。

具体实施方式

下面将通过几个具体实施例，进一步阐明本发明，这些实施例只是为了说明问题，并不是一种限制，所述试剂无说明均通过商业渠道取得。

实施例

一种表达大口黑鲈弹状病毒G蛋白的重组乳酸乳球菌，所述的重组乳酸乳球菌：转化了pMG36e-His-G蛋白重组质粒的乳酸乳球菌。

所述的大口黑鲈弹状病毒G蛋白序列来源于Genebank，序列号为MK397811.2。

上述表达大口黑鲈弹状病毒G蛋白的重组乳酸乳球菌的制备方法，包括以下步骤：

S1：重组质粒的构建。

从Genebank中获得大口黑鲈弹状病毒G蛋白的序列信息，然后通过全基因合成大口黑鲈弹状病毒G蛋白序列，并添加His标签和Sac I、Hind III酶切位点，然后连接至pMG36e重组质粒，然后转入DH5α感受态细胞，送上海生工测序验证pMG36e-His-G蛋白重组质粒是否构建成功。

S2：重组乳酸乳球菌的构建

采用质粒大提试剂盒提取重组质粒，然后通过电转化的方式将pMG36e-His-G蛋白表达质粒转化至乳酸乳球菌，电转化的条件为2.0kV，电阻为400Ω，pMG36e质粒替代pMG36e-His-G蛋白表达质粒作为阴性对照。然后将乳酸乳球菌涂布于含有红霉素的M17培养基上，进行抗性筛选。

经抗性筛选后，通过试剂盒提取乳酸乳球菌DNA，然后通过PCR检测抗性阳性的乳酸乳球菌是否含有验证pMG36e-His-G蛋白重组质粒，筛选出阳性克隆的重组乳酸乳球菌。

S3：重组乳酸乳球菌表达G蛋白的验证

挑选阳性克隆的重组乳酸乳球菌，经红霉素抗性的M17培养基培养后，用抗His标签抗体通过western blotting分析G蛋白的表达情况，验证是否成功构建表达弹状病毒G蛋白的乳酸乳球菌。具体操作如下：

(1)取60μL重组乳酸乳球菌，加入15μL 5×Loading Buffer混合均匀，金属浴煮20min后，加入上样孔中，进行SDS-PAGE凝胶电泳；

(2)电泳结束后，通过电转移的方式将重组乳酸乳球菌全菌蛋白转移到PVDF膜上，并将PVDF膜置于5％BSA中，37℃条件下封闭2h；

(3)PVDF膜经PBS-T洗涤3次(每次5min)后，置于鼠抗His标签抗体(PBS稀释，1:1000)中，37℃孵育1h，无关鼠源抗体替代抗His标签抗体作为对照；

(5)PVDF膜经PBS-T洗涤3次(每次5min)后，置于HRP标记的山羊抗鼠IgG抗体(PBS稀释，1:10000)，37℃条件下孵育1h；

(6)PVDF膜经PBS-T洗涤3次(每次5min)后，使用DAB显色试剂盒进行显色，避光发色5-10min，用蒸馏水洗涤，终止发色，然后拍照、记录。

如附图1所示，Western blotting分析显示，本发明制备的重组乳酸乳球菌成功表达大口黑鲈弹状病毒G蛋白。大量研究已经表明弹状病毒G蛋白是与宿主互作，介导弹状病毒入胞的关键蛋白，是诱导宿主产生中和抗体的重要病毒蛋白，也是可以作为弹状病毒亚单位疫苗的效应成分的重要蛋白。本发明成功构建表达大口黑鲈弹状病毒G蛋白的乳酸乳球菌，因乳酸乳球菌的保护，可以递送大口黑鲈弹状病毒G蛋白进入鱼体肠道，为大口黑鲈弹状病毒口服疫苗的研制提供重要基础。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进，这些改进也应视为本发明的保护范围。