一种小儿肺咳颗粒HPLC指纹图谱的构建方法

技术领域

本发明属于医药技术领域，具体涉及一种小儿肺咳颗粒HPLC指纹图谱的构建方法。

背景技术

中药指纹图谱运用现代分析技术，可以通过分析比较中药或中成药的色谱图，反映样品中的化学成分，临床常用于中药的成分分析和质量评价。正如每个人特有的指纹一样，每种药材也都有自己独特的药性和有效成分。借助现代计算机和软件分析技术，这样每种药材都能够像指纹一样被鉴定出来，以及明确特有的有效成分，监控中药内在质量，从根本上解决质量标准化问题。

目前，指纹图谱已成为国际公认的控制中药或天然药物质量的最有效手段。在我国中药注射剂现已强制实行中药指纹图谱质量标准的指标，银杏叶注射剂、清开灵注射剂、广炎灵注射剂、红景天注射剂、青银注射剂、鱼金注射剂、肿节风注射剂等已相继建立了指纹图谱的质量标准用于控制产品的质量。

小儿肺咳颗粒是《中国药典》2020版收录品种，由人参、白术、鸡内金、鳖甲、北沙参、青蒿、桂枝、淡附片、款冬花、桑白皮、黄芪、茯苓、陈皮、酒大黄、地骨皮、炙甘草、麦冬、干姜、瓜蒌、紫菀、胆南星、枸杞子制备而成，是长春人民药业集团有限公司多年来重点培育的中药大品种，具有健脾益肺，止咳平喘的功效，用于肺脾不足，痰湿内壅所致咳嗽或痰多稠黄，咳吐不爽，气短，喘促，动辄汗出，食少纳呆，周身乏力，舌红苔厚；小儿支气管炎见以上证候者。由于其组方清楚合理，临床疗效良好，市场需求量大。

正由于小儿肺咳颗粒组方多，配伍合理等特点，更需要建立指纹图谱技术进行内控质量把关。有关学者也做了一些研究，如李微等采用HPLC法测定小儿肺咳口服液中橙皮苷含量(李威，小儿肺咳口服液的药学研究，成都中医药大学，2016年)；也有采用化学反应、薄层色谱法(TLC)和高效液相色谱法分别进行小儿肺咳糖浆的定性、定量检测(唐立海等，小儿肺咳糖浆质量标准研究，亚太传统医药，2016年，第12卷，第18期，27页)；中国药典2020年版对其小儿肺咳颗粒处方中人参、白术、青蒿、大黄、款冬花、枸杞子进行了薄层鉴别研究，对处方中陈皮含有的橙皮苷进行了含量测定研究(《中国药典》2020年版一部)。

目前，关于小儿肺咳颗粒，多为联合消炎、抗过敏等药物的临床治疗的研究，其药品质量研究方面也仅限于口服液和糖浆等，含量测定方法都是用一味或两味成分来说明小儿肺咳颗粒的内在质量，具有一定的片面性。要控制小儿肺咳颗粒的质量，只针对其中一两个化学成分进行表征和控制是不够的，必须对它的物质群整体予以控制。因此，建立小儿肺咳颗粒指纹图谱的检测方法及其应用就显得尤为重要，需要对其物质群整体进行控制，有效表征质量标准。在本发明完成前，以小儿肺咳颗粒含有的化成分为指标建立指纹图谱的方法未见报道。

发明内容

本发明的目的是提供一种小儿肺咳颗粒HPLC指纹图谱的构建方法。通过本发明的构建方法可以较为全面地控制小儿肺咳颗粒的质量，从而更好地保证小儿肺咳颗粒的质量稳定性、一致性和可控性，从而确保小儿肺咳颗粒的安全性和有效性。本发明经过系统的成分指认和药品不同批次共有峰的单味药材归属，较全面的分析了小儿肺咳颗粒中各成分的现状，能够为小儿肺咳颗粒的质量控制提供重要的参考依据。

本发明为解决技术问题所采用的技术方案如下：

本发明的一种小儿肺咳颗粒HPLC指纹图谱的构建方法，包括以下步骤：

a、供试品溶液的制备

称取小儿肺咳颗粒，研细，称取1～3g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇20～50ml，称取重量，超声处理20～40分钟，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得供试品溶液；

b、对照品溶液的制备

分别称取芦丁、甘草苷、橙皮苷、槲皮素、大黄酚、大黄素甲醚对照品，精密称定，以甲醇为溶剂，配制成不同质量浓度的混合对照品溶液，过微孔滤膜，取续滤液作为对照品溶液；

c、测定

分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各5～15μl，注入高效液相色谱仪，记录100分钟内的色谱图，用指纹图谱软件对图谱进行处理，即得小儿肺咳颗粒的HPLC指纹图谱。

作为优选的实施方式，步骤a的具体步骤如下：

称取小儿肺咳颗粒，研细，称取2.0g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇25ml，称取重量，超声处理30分钟，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得供试品溶液。

作为优选的实施方式，步骤b的具体步骤如下：

分别称取芦丁、甘草苷、橙皮苷、槲皮素、大黄酚、大黄素甲醚对照品，精密称定，置于同一10ml量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，再精密吸取1ml置于同一10ml量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，制成质量浓度分别为0.0058mg/ml、0.0125mg/ml、0.0136mg/ml、0.0122mg/ml、0.0222mg/ml、0.0051mg/ml的混合对照品溶液，过0.45μm的微孔滤膜，取续滤液作为对照品溶液。

作为优选的实施方式，步骤c的具体步骤如下：

分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl，注入高效液相色谱仪，记录100分钟内的色谱图，用指纹图谱软件对图谱进行处理，即得小儿肺咳颗粒的HPLC指纹图谱。

作为优选的实施方式，步骤c中，测定的高效液相色谱条件为：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以乙腈为流动相A，以0.05～0.5％磷酸溶液为流动相B，梯度洗脱，流速0.5～1.5ml/min，柱温25～45℃，检测波长210～360nm；理论塔板数按橙皮苷峰计算应不低于4000。

作为优选的实施方式，步骤c中，测定的高效液相色谱条件为：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，色谱柱为：ACE 5 C18-AR 250×4.60mm；以乙腈为流动相A，以0.1％磷酸溶液为流动相B，梯度洗脱，流速1.0ml/min，柱温30℃，检测波长280nm；理论塔板数按橙皮苷峰计算应不低于4000。

作为优选的实施方式，步骤c中，梯度洗脱过程中，流动相A、B的比例变化为：0～30min，5～15％A；30～45min，15～30％A；45～60min，30～35％A；60～80min，35～60％A；80～92min，60～80％A；92～100min，80～5％A。

作为优选的实施方式，步骤c中，所得小儿肺咳颗粒的HPLC指纹图谱共有24个共有峰，共有峰中8、9、13、19、23、24号色谱峰分别被指认为芦丁、甘草苷、橙皮苷、槲皮素、大黄酚、大黄素甲醚。

作为优选的实施方式，步骤c中，按照标准指纹图谱条件对所得小儿肺咳颗粒的HPLC指纹图谱进行色谱峰归属，24个共有峰分别归属于黄芪、地骨皮、北沙参、麦冬、炙甘草、青蒿、桂枝、瓜蒌、紫菀、桑白皮、款冬花、陈皮、酒大黄、干姜、枸杞子等十五味药材；1号峰归属于地骨皮、北沙参、麦冬、炙甘草、瓜蒌、桑白皮、紫菀、酒大黄、枸杞子，2号峰归属于麦冬、炙甘草、瓜蒌、枸杞子，3号峰归属于酒大黄，4号峰归属于枸杞子，5号峰归属于桑白皮、款冬花，6号峰归属于款冬花、枸杞子，7号峰归属于桑白皮，8号峰归属于黄芪、炙甘草，9号峰归属于炙甘草、酒大黄，10号峰归属于炙甘草，11号峰归属于桑白皮、陈皮，12号峰归属于款冬花，13号峰归属于陈皮，14号峰归属于黄芪、青蒿、桑白皮、款冬花，15号峰归属于款冬花，16号峰归属于酒大黄，17号峰归属于陈皮，18号峰归属于桑白皮、酒大黄，19号峰归属于黄芪、桂枝、酒大黄，20号峰归属于枸杞子、21号峰归属于酒大黄，22号峰归属于酒大黄，23号峰归属于酒大黄，24号峰归属于酒大黄。

本发明的有益效果是：

1、本发明建立了10个批次小儿肺咳颗粒的HPLC指纹图谱，相似度均大于0.90，可以更加全面的反应小儿肺咳颗粒所含有的化学信息，更好的表征小儿肺咳颗粒的质量。

2、本发明标定了24个共有峰，共有峰中8、9、13、19、23、24号色谱峰分别被指认为芦丁、甘草苷、橙皮苷、槲皮素、大黄酚、大黄素甲醚。

3、由于指纹图谱不是为了测定某个成分的精确含量，而是要充分反映化学成分的信息，因此，本发明选择在280nm波长处进行测定，其出峰较多，反映的信息较完全；各个峰吸收值良好，基线平稳，也避免了近紫外杂质峰较大吸收情况。

4、本发明建立的高效液相指纹图谱方法首次实现了对小儿肺咳颗粒全方的质量控制，不是对单一化合物或药材进行鉴别，能更加有效地指导投料，严格规范生产操作，确保临床用药安全、有效。

5、本发明中，按照标准指纹图谱条件进行色谱峰归属，24个共有峰分别归属于黄芪、地骨皮、北沙参、麦冬、炙甘草、青蒿、桂枝、瓜蒌、紫菀、桑白皮、款冬花、陈皮、酒大黄、干姜、枸杞子等十五味药材；1号峰归属于地骨皮、北沙参、麦冬、炙甘草、瓜蒌、桑白皮、紫菀、酒大黄、枸杞子，2号峰归属于麦冬、炙甘草、瓜蒌、枸杞子，3号峰归属于酒大黄，4号峰归属于枸杞子，5号峰归属于桑白皮、款冬花，6号峰归属于款冬花、枸杞子，7号峰归属于桑白皮，8号峰归属于黄芪、炙甘草，9号峰归属于炙甘草、酒大黄，10号峰归属于炙甘草，11号峰归属于桑白皮、陈皮，12号峰归属于款冬花，13号峰归属于陈皮，14号峰归属于黄芪、青蒿、桑白皮、款冬花，15号峰归属于款冬花，16号峰归属于酒大黄，17号峰归属于陈皮，18号峰归属于桑白皮、酒大黄，19号峰归属于黄芪、桂枝、酒大黄，20号峰归属于枸杞子、21号峰归属于酒大黄，22号峰归属于酒大黄，23号峰归属于酒大黄，24号峰归属于酒大黄。

6、本发明能更加有效的表征小儿肺咳颗粒的质量，克服了原质量控制方法的单一性和片面性，更好的监控和评价小儿肺咳颗粒质量，指导规范化生产，具有较高的应用价值。

附图说明

图1为实施例2中所测得的小儿肺咳颗粒混标HPLC色谱图。

图2为实施例2中所测得的小儿肺咳颗粒共有模式图谱。

图3为实施例3中10个批次小儿肺咳颗粒指纹图谱叠加图。

图4为实施例3中样品指纹图谱与各药材色谱图对比归属图。

图5为360nm波长下小儿肺咳颗粒HPLC指纹图谱。

图6为320nm波长下小儿肺咳颗粒HPLC指纹图谱。

图7为254nm波长下小儿肺咳颗粒HPLC指纹图谱。

图8为280nm波长下小儿肺咳颗粒HPLC指纹图谱。

图9为210nm波长下小儿肺咳颗粒HPLC指纹图谱。

图10为203nm波长下小儿肺咳颗粒HPLC指纹图谱。

具体实施方式

本发明的一种小儿肺咳颗粒HPLC指纹图谱的构建方法，采用高效液相色谱法测定小儿肺咳颗粒的指纹图谱，主要包括以下步骤：

a、供试品溶液的制备

称取小儿肺咳颗粒，研细，称取1～3g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇20～50ml，称取重量，超声处理20～40分钟，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得供试品溶液；

b、对照品溶液的制备

分别称取芦丁、甘草苷、橙皮苷、槲皮素、大黄酚、大黄素甲醚对照品，精密称定，以甲醇为溶剂，配制成不同质量浓度的混合对照品溶液，过微孔滤膜，取续滤液作为对照品溶液；

c、测定

分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各5～15μl，注入高效液相色谱仪，记录100分钟内的色谱图，用指纹图谱软件对图谱进行处理，即得小儿肺咳颗粒的HPLC指纹图谱。

优选的，测定的高效液相色谱条件为：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以乙腈为流动相A，以0.05～0.5％磷酸溶液为流动相B，梯度洗脱，流速0.5～1.5ml/min，柱温25～45℃，检测波长210～360nm；理论塔板数按橙皮苷峰计算应不低于4000。

优选的，梯度洗脱过程中，流动相A、B的比例变化为：0～30min，5～15％A；30～45min，15～30％A；45～60min，30～35％A；60～80min，35～60％A；80～92min，60～80％A；92～100min，80～5％A。

所得小儿肺咳颗粒的HPLC指纹图谱共有24个共有峰，共有峰中8、9、13、19、23、24号色谱峰分别被指认为芦丁、甘草苷、橙皮苷、槲皮素、大黄酚、大黄素甲醚。

按照标准指纹图谱条件对所得小儿肺咳颗粒的HPLC指纹图谱进行色谱峰归属，24个共有峰分别归属于黄芪、地骨皮、北沙参、麦冬、炙甘草、青蒿、桂枝、瓜蒌、紫菀、桑白皮、款冬花、陈皮、酒大黄、干姜、枸杞子等十五味药材；1号峰归属于地骨皮、北沙参、麦冬、炙甘草、瓜蒌、桑白皮、紫菀、酒大黄、枸杞子，2号峰归属于麦冬、炙甘草、瓜蒌、枸杞子，3号峰归属于酒大黄，4号峰归属于枸杞子，5号峰归属于桑白皮、款冬花，6号峰归属于款冬花、枸杞子，7号峰归属于桑白皮，8号峰归属于黄芪、炙甘草，9号峰归属于炙甘草、酒大黄，10号峰归属于炙甘草，11号峰归属于桑白皮、陈皮，12号峰归属于款冬花，13号峰归属于陈皮，14号峰归属于黄芪、青蒿、桑白皮、款冬花，15号峰归属于款冬花，16号峰归属于酒大黄，17号峰归属于陈皮，18号峰归属于桑白皮、酒大黄，19号峰归属于黄芪、桂枝、酒大黄，20号峰归属于枸杞子、21号峰归属于酒大黄，22号峰归属于酒大黄，23号峰归属于酒大黄，24号峰归属于酒大黄。

下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1：小儿肺咳颗粒的制备

小儿肺咳颗粒是由人参20g、白术8g、鸡内金20g、鳖甲20g、北沙参39g、青蒿29g、桂枝8g、淡附片8g、款冬花20g、桑白皮23g、黄芪20g、茯苓20g、陈皮20g、酒大黄12g、地骨皮23g、炙甘草12g、麦冬39g、干姜8g、瓜蒌29g、紫菀20g、胆南星8g、枸杞子20g制备而成。

具体的制备方法为：以上二十二味中的黄芪、地骨皮、北沙参、麦冬、炙甘草、青蒿、桂枝、瓜蒌、紫菀、桑白皮加水煎煮二次，每次2小时，合并煎液，滤过，滤液浓缩成相对密度为1.26～1.30(80℃)的清膏；其余人参等十二味粉碎成细粉，与上述清膏、蔗糖适量混均，制成颗粒，干燥，制成1000g，即得小儿肺咳颗粒。

实施例2：不同批次小儿肺咳颗粒指纹图谱的检测

1、仪器与试药

1.1Agilent 1220型高效液相色谱仪(美国安捷伦)；KQ-100型超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)；124S电子天平(北京赛多利斯天平有限公司)。

1.2纯净水(娃哈哈)，乙腈(色谱纯)，其他试剂均为分析纯。甘草苷、槲皮素、大黄素甲醚、橙皮苷、大黄酚、芦丁对照品(批号111610-201908、100081-201610、110758-200610、110721-201818、110796-201922、100080-201811，中国食品药品检定研究院)。小儿肺咳颗粒(批号：20180328、20180707、20181105、20190203、20192406、20191105、20190904、20200302、20200405、20201110，长春人民药业集团有限公司)。

2、指纹图谱测定

2.1色谱条件：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，色谱柱为：ACE 5C18-AR250×4.60mm，以乙腈为流动相A，以0.1％磷酸溶液为流动相B，梯度洗脱，流速1.0ml/min，柱温30℃，检测波长280nm，流动相梯度洗脱程序如下：0～30min，5～15％A；30～45min，15～30％A；45～60min，30～35％A；60～80min，35～60％A；80～92min，60～80％A；92～100min，80～5％A。

2.2供试品溶液的制备：称取小儿肺咳颗粒，研细，取约2.0006g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇25ml，称取重量，超声处理(功率80W，频率250kHz)30分钟，放冷再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得，单味药材供试品溶液按上述方法进行制备。

2.3对照品溶液的制备：分别精密称取芦丁、甘草苷、橙皮苷、槲皮素、大黄酚、大黄素甲醚对照品适量，精密称定，置于同一10ml量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，再精密吸取1ml置于同一10ml量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，制成质量浓度分别为0.0058、0.0125、0.0136、0.0122、0.0222、0.0051mg/ml的混合对照品溶液，过0.45μm的微孔滤膜，取续滤液作为对照品溶液。

2.4测定：分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl，注入高效液相色谱仪，记录100分钟内的色谱图，分别见图1、图2。

实施例3：10批次小儿肺咳颗粒指纹图谱分析

1、指纹图谱相似度分析

取10批次小儿肺咳颗粒，按供试品制备方法制备，色谱条件进样分析，记录小儿肺咳颗粒指纹图谱，采用国家药典委员会发行的《中药色谱指纹图谱相似度评价系统2012A版》对10批次小儿肺咳颗粒指纹图谱进行相似度分析，设定S5为参照图谱，利用中位数法，时间窗宽度设置0.1min，共标定24个共有峰，10批次小儿肺咳颗粒的相似度均大于0.90，标准指纹图谱数据见表1。24个共有峰相对保留时间基本一致，而相对峰面积存在较大差别，见表2。10批次小儿肺咳颗粒指纹图谱见图3(图3中S1-S10分别对应批号20180328、20180707、20181105、20190203、20192406、20191105、20190904、20200302、20200405、20201110)。

表1 10批小儿肺咳颗粒样品相似度评价结果

表2标准指纹图谱数据

2、共有峰指认：将对照品所测得的色谱图与样品指纹图谱进行对比，在与各对照品相同保留时间处的色谱峰即得到了指认，对照品色谱图见图1。结果显示，共有峰中8、9、13、19、23、24号色谱峰分别被指认为芦丁、甘草苷、橙皮苷、槲皮素、大黄酚、大黄素甲醚。

3、药材归属：按照标准指纹图谱条件进行色谱峰归属，如图4所示。24个共有峰分别归属于黄芪、地骨皮、北沙参、麦冬、炙甘草、青蒿、桂枝、瓜蒌、紫菀、桑白皮、款冬花、陈皮、酒大黄、干姜、枸杞子等十五味药材；1号峰归属于地骨皮、北沙参、麦冬、炙甘草、瓜蒌、桑白皮、紫菀、酒大黄、枸杞子，2号峰归属于麦冬、炙甘草、瓜蒌、枸杞子，3号峰归属于酒大黄，4号峰归属于枸杞子，5号峰归属于桑白皮、款冬花，6号峰归属于款冬花、枸杞子，7号峰归属于桑白皮，8号峰归属于黄芪、炙甘草，9号峰归属于炙甘草、酒大黄，10号峰归属于炙甘草，11号峰归属于桑白皮、陈皮，12号峰归属于款冬花，13号峰归属于陈皮，14号峰归属于黄芪、青蒿、桑白皮、款冬花，15号峰归属于款冬花，16号峰归属于酒大黄，17号峰归属于陈皮，18号峰归属于桑白皮、酒大黄，19号峰归属于黄芪、桂枝、酒大黄，20号峰归属于枸杞子、21号峰归属于酒大黄，22号峰归属于酒大黄，23号峰归属于酒大黄，24号峰归属于酒大黄。

实施例4波长的选择

取20201110批样品进行试验，分别考察了203、210、254、280、320、360等不同波长下的色谱图的整体效果，其它色谱条件与实施例1相同，结果见图5、6、7、8、9、10。由所测色谱图可知，波长为280nm时，峰形较佳，如图8所示。波长为360nm时，峰值很小，响应值低且峰的数量很少，如图5所示。波长为320nm时，较360nm好些，但峰的响应值仍较低，如图6所示。波长为254nm时，色谱图基线较平，峰形较佳，且组分响应值均较低，如图7所示。波长为210时，色谱图基线不平，且保留时间在65-90时，色谱峰的波动巨大，如图9所示。波长为203nm时，色谱图基线没有处于标准位置，如图10所示。综合来看，以280nm为检测波长的指纹图谱最能全面反映制剂的成分，而且峰形最好，所以优选280nm为最佳检测波长。

本发明公开了一种小儿肺咳颗粒HPLC指纹图谱的构建方法，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的产品已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的产品进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。