糖皮质激素在制备治疗和/或预防呼吸道病毒感染的药物中的用途

技术领域

本发明涉及呼吸道病毒感染的治疗领域。具体地，本发明涉及糖皮质激素在制备用于治疗和/或预防呼吸道病毒感染的药物中的用途。

背景技术

病毒性肺炎是由上呼吸道病毒感染、向下蔓延所致的肺部炎症。一年四季均可发生，但大多见于冬春季节，可暴发或散发流行。临床主要表现为发热、头痛、全身酸痛、干咳及肺浸润等。病毒性肺炎的发生与病毒的毒力、感染途径以及宿主的年龄、免疫功能状态等有关。呼吸道感染是全球最主要的死亡原因之一，尤其是重症肺炎患者出现高死亡率和严重的后遗症。引起病毒性肺炎的主要病毒包括呼吸道合胞病毒、流感病毒、冠状病毒等。

2019年12月以来，出现了新型冠状病毒肺炎疫情，随着疫情的蔓延，引发全球大流行。新型冠状病毒是一种可引起人新型冠状病毒肺炎(COVID-19)的新发呼吸道病原体，与重症急性呼吸道综合征冠状病毒(SARS-CoV)和中东呼吸综合征冠状病毒(MERS-CoV)同属于β-冠状病毒，具有较高的传染性和一定的致死率。

自2020年起，不断出现的新冠病毒变异株使得新冠毒株的传染性和致病性发生了变化。最早在英国流行的Alpha株使得传染性增加56％左右。其后发现的Beta病毒株(南非流行的变异株)也存在传染性增加。Gamma病毒株(南美流行变异株)则可能增加1.4～2.2倍的传播性。Delta新冠变异株(原称B.1.617.2)具有传播力强、感染潜伏期短、致病性强、发病进程快等特点，成为印度乃至全球主要的流行毒株，并导致多个国家和地区的疫情反弹。

多项研究证实，超级炎症反应是新冠肺炎严重程度死亡的主要原因。

单核-巨噬细胞是固有免疫细胞群，通过吞噬或释放炎性分子清除病原体并促进组织的修复。然而，单核-巨噬细胞功能过度激活形成的超级炎症，却可导致新冠肺炎患者器官损害甚至死亡。研究发现，重症患者支气管肺泡灌洗液(bronchoalveolar fluid,BALF)中，单核-巨噬细胞可占BALF细胞的80.0％,而轻症患者或健康对照组单核-巨噬细胞分别占BALF细胞的60.0％和40.0％。重症患者肺组织中的巨噬细胞产生的大量细胞因子，还可促进肺的纤维化。

因此，如何降低新冠病毒传染性、有效限制病毒的传播和扩散，缓解新冠病毒引起的严重炎症成为当前亟待解决的问题。

发明内容

本发明人意想不到地发现，鼻腔施用地塞米松能够显著降低SARS-CoV-2Delta毒株感染小鼠的病毒载量、减轻小鼠肺组织的炎性细胞浸润以及病理损伤。

因此，在本发明的第一方面，提供了糖皮质激素在制备用于预防和/或治疗哺乳动物受试者中呼吸道病毒感染的药物中的用途，其中所述药物用于经鼻施用或吸入施用。

在本发明的一个实施方案中，所述哺乳动物受试者是人。

在本发明的一个实施方案中，所述糖皮质激素包括但不限于地塞米松、利美索龙、泼尼松龙、氟米龙、氢化可的松、莫米松、氟替卡松、倍氯米松、氟尼缩松、去炎松、丙酸氟替卡松(FP)、二丙酸倍氯松(BDP)、布地奈德(BUD)和糠酸莫米松。

在本发明的一个实施方案中，所述糖皮质激素被配置成气雾剂、干粉剂、或溶液剂的形式。

本发明提供的经鼻施用或吸入施用的糖皮质激素可有效抑制呼吸道感染的病毒在宿主细胞内的复制，有效防止带病毒的飞沫传播，有效的起到预防呼吸道性病毒传播和扩散的作用，有效缓解呼吸道性病毒引起的肺部炎症，有很好的临床应用前景。

在本发明的一个实施方案中，所述呼吸道感染的病毒包括但不限于SARS-CoV病毒、SARS-CoV-2病毒、中东呼吸综合征冠状病毒(MERS-CoV)、流感病毒、麻疹病毒、腮腺炎病毒、呼吸道合胞病毒、副流感病毒、人偏肺病毒、亨德拉病毒、尼派病毒、风疹病毒、鼻病毒、腺病毒、呼肠病毒、柯萨奇病毒、ECHO病毒。

在另一方面，本发明提供了一种药物组合物，其包含治疗有效量的糖皮质激素以及药学上可接受的载体、赋形剂和/或佐剂，其通过经鼻施用或吸入施用用于预防和/或治疗哺乳动物受试者中呼吸道病毒感染。

优选地，根据本发明的药物组合物通过经鼻施用或吸入施用用于预防和/或治疗SARS-CoV-2感染，优选地，用于预防和/或治疗SARS-CoV-2Delta毒株感染。

如本文所用，术语“治疗和/或预防”是指治疗性和/或预防性措施，以预防、治愈、减轻、延迟所述呼吸道感染性疾病、减轻其严重性、或减轻其一个或多个症状、或者降低所述感染性疾病引起的死亡率。

呼吸道病毒感染，尤其是，SARS-CoV-2感染，能够在一部分人群中引起重症感染，表现为血氧含量显著下降、呼吸困难、增加的死亡率等。本发明的提供的药物组合物能够通过降低感染者呼吸道的病毒载量以及炎症浸润，而降低受试者发展为重症的可能性。

因而，本文中使用的术语“预防”，涵盖降低SARS-CoV-2感染的受试者转为重症的可能性。

如本文所用，SARS-CoV-2感染的“重症”患者指的是，根据国家卫健委制定的《新型冠状病毒肺炎诊疗方案(试行第八版)》中对于新冠肺炎重症患者的定义，如下

成人符合下列任何一条:

1.出现气促，RR≥30次/分；

2.静息状态下，吸空气时指氧饱和度≤93；

3.动脉血氧分压(PaO2)/吸氧浓度(FiO2)≤300mmHg(1mmHg＝0.133kPa)；高海拔(海拔超过1000米)地区应根据以下公式对PaO2/FiO2进行校正:PaO2/FiO2×[760/大气压(mmHg)]。

4.临床症状进行性加重，肺部影像学显示24～48小时内病灶明显进展>50者。

儿童符合下列任何一条:

1.持续高热超过3天；

2.出现气促(＜2月龄，RR≥60次/分；2～12月龄，RR≥50次/分；1～5岁，RR≥40次/分；>5岁，RR≥30次/分)，除外发热和哭闹的影响；

3.静息状态下，吸空气时指氧饱和度≤93；

4.辅助呼吸(鼻翼扇动、三凹征)；

5.出现嗜睡、惊厥；

6.拒食或喂养困难，有脱水征。

其中，危重症指的是：

符合以下情况之一者:

1.出现呼吸衰竭，且需要机械通气；

2.出现休克；

3.合并其他器官功能衰竭需ICU监护治疗。

由于本发明的经鼻施用或吸入施用的药物组合物可有效降低呼吸道的病毒载量，因而，可用于有效阻断呼吸道病毒的传播。

因而，在另一方面，本发明提供了糖皮质激素在制备用于阻断呼吸道病毒在哺乳动物中传播的药物中的用途，其中所述药物用于经鼻施用或吸入施用，优选地，所述哺乳动物为人。

在优选的实施方案中，本发明提供了糖皮质激素在制备用于阻断SARS-CoV-2病毒在哺乳动物中传播的药物中的用途，其中所述药物用于经鼻施用或吸入施用。

在优选的实施方案中，本发明的药物组合物可用于阻断和/或延缓SARS-CoV-2大流行。

如本文所用，“大流行(pandemic)”指某疾病的发病蔓延迅速，涉及地域广，人口比例大，在短时间内可以越过省界国界甚至洲界形成世界性流行。

在另一方面，本发明提供了一种治疗和/或预防呼吸道病毒感染的方法，所述方法包括：向诊断为呼吸道病毒感染的受试者经鼻施用或吸入施用治疗有效量的糖皮质激素，优选地，所述糖皮质激素包括但不限于地塞米松、利美索龙、泼尼松龙、氟米龙、氢化可的松、莫米松、氟替卡松、倍氯米松、氟尼缩松、去炎松、丙酸氟替卡松(FP)、二丙酸倍氯松(BDP)、布地奈德(BUD)和糠酸莫米松。

本发明的方案具有以下效果：

1、本发明提供的经鼻施用或吸入施用的糖皮质激素，能够有效抑制病毒在巨噬细胞内的复制，有效在早期防范新冠病毒感染者向重症方向发展的效果，有效降低新冠病人的死亡率，有效提高呼吸道病毒性肺炎病人的生存率，有很好的临床应用前景。

2、本发明提供的经鼻施用或吸入施用的糖皮质激素是临床上常规用药，具有安全性高、无毒副作用的优点。

附图说明

图1A和图1B显示SARS-CoV-2Delta毒株感染小鼠肺泡巨噬细胞2h后，加入地塞米松继续培养22h和46h后进行病毒基因NP(图1A)和ORF1ab(图1B)的qPCR结果；表明地塞米松在体外可以促进巨噬细胞清除SARS-CoV-2Delta毒株；

图2显示地塞米松体外可以下调SARS-CoV-2Delta毒株感染的巨噬细胞表达炎性细胞因子IL-6；

图3显示地塞米松体外可以下调SARS-CoV-2Delta毒株感染的巨噬细胞表达组织蛋白酶L；

图4A和4B分别显示SARS-CoV-2Delta毒株感染小鼠2h后，连续5天经鼻给药地塞米松后，hACE2过表达小鼠肺的H&E染色结果(图4A)，和免疫组化结果(图4B)；其中mock表示空白对照；

图5A和5B分别显示SARS-CoV-2Delta毒株感染小鼠2h后，连续5天经鼻给药地塞米松后，hACE2过表达小鼠肺中病毒基因NP(图5A)和ORF1ab(图5B)的qPCR结果；其中mock表示空白对照；

图6A至图6C分别显示SARS-CoV-2Delta毒株感染小鼠2h后，连续5天经鼻给药地塞米松后，hACE2过表达小鼠肺中IL-1(图6A)、IL-6(图6B)和TNFα(图6C)的qPCR结果；其中mock表示空白对照；PBS表示SARS-CoV-2Delta毒株后，连续5天经鼻给药PBS小鼠组；Dex表示SARS-CoV-2Delta毒株后，连续5天经鼻给药地塞米松小鼠组。

具体实施方式

实施例中使用的各种细胞系、药物及实验动物：

A549人肺腺癌细胞系购自中国典型物保藏中心CCTCC；

雌性ICR，hACE2转基因小鼠，6至8周龄，购自中国医学科学院医学实验动物中心(北京)，没有病毒感染的小鼠研究得到了中国医学科学院动物保护与利用委员会的批准。

涉及病毒的操作获得中国医学科学院医学实验动物研究所批准，在中国医学科学院医学实验动物研究所P3实验室进行。

1.实验步骤

取正常ICR小鼠肺泡巨噬细胞，按照每孔5x10^4的细胞铺到24孔板里，第二天按照2.5×10^4TCID50，感染SARS-CoV-2Delta毒株病毒(所述病毒获自中国医学科学院医学实验动物研究所)，感染2h后，弃去培养基，用PBS洗两遍，最后一遍将PBS弃干净，每孔加入1mL地塞米松，使其终浓度分别为0.2uM和1uM，继续培养22h或46h，然后用PBS洗两遍，最后一遍将PBS弃干净，每孔加入1mL TRIZOL(Invitrogen公司,目录号15596026)，按试剂盒的说明书提取RNA，并使用High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit with RNaseInhibitor试剂盒(Applied Biosystems公司,4374967)，进行逆转录。利用qPCR分析病毒基因ORF1ab和核蛋白壳(NP,Nucleocapsid)拷贝数。所使用的引物如下表所示：

2.实验结果

qPCR分析显示地塞米松体外可以降低巨噬细胞SARS-CoV-2Delta毒株的病毒载量，NP和ORF的量降低(参见图1A和图1B)。图1A和图1B的横坐标分别代表病毒感染2h后，加入地塞米松继续培养22h和46h后进行病毒基因NP(图1A)和ORF1ab(图1B)的qPCR，纵坐标代表基因的相对表达量；Dex0.2和Dex1分别代表添加药物地塞米松0.2uM和1uM。

1.实验步骤

如实施例1所述取小鼠肺泡巨噬细胞，按照每孔5x10^4的细胞铺到24孔板里，第二天按照2.5x10^4TCID50感染SARS-CoV-2Delta毒株病毒，感染2h后，弃去培养基，用PBS洗两遍，最后一遍将PBS弃干净，每孔加入1mL地塞米松，使其终浓度分别为0.2uM和1uM，继续培养22h或46h，然后用PBS洗两遍，最后一遍将PBS弃干净，每孔加入1mL TRIZOL(Invitrogen公司,15596026)，按试剂盒的说明书提取RNA，并使用High-Capacity cDNA ReverseTranscription Kit with RNase Inhibitor试剂盒(Applied Biosystems公司,4374967)，试剂盒进行逆转录。利用qPCR分析IL-6的表达。所使用的引物如下表所示：

2.实验结果

qPCR分析显示地塞米松体外可以下调SARS-CoV-2Delta毒株感染的巨噬细胞表达的IL-6水平(图2)。病毒感染2h后，加入地塞米松继续培养22h和46h后，IL-6的表达水平降低，图2的纵坐标代表基因的相对表达量；Dex0.2和Dex1分别代表添加药物地塞米松0.2uM和1uM。

1.实验步骤

如实施例1所述取小鼠肺泡巨噬细胞，按照每孔5x10^4的细胞铺到24孔板里，第二天按照2.5x10^4TCID50感染SARS-CoV-2Delta毒株病毒，感染30min后，弃去培养基，用PBS洗两遍，最后一遍将PBS弃干净，每孔加入1mL地塞米松，使其终浓度分别为0.2uM和1uM，，继续培养30min或4h，然后用PBS洗两遍，最后一遍将PBS弃干净，每孔加入1mL TRIZOL(Invitrogen公司,15596026)，按试剂盒的说明书提取RNA，并使用High-Capacity cDNAReverse Transcription Kit with RNase Inhibitor试剂盒(Applied Biosystems公司,4374967)，进行逆转录。利用qPCR分析组织蛋白酶L的表达。所使用的引物如下表所示：

2.实验结果

qPCR分析显示地塞米松体外可以下调SARS-CoV-2Delta毒株感染的巨噬细胞表达的组织蛋白酶L水平(图3)。病毒感染2h后，加入地塞米松继续培养30min和4h后，组织蛋白酶L的表达水平降低，图3的纵坐标代表基因的相对表达量；Dex0.2和Dex1分别代表添加药物地塞米松0.2uM和1uM。

1.实验步骤

用SARS-CoV-2Delta毒株(1×10^5TCID50)气管内感染hACE2转基因小鼠2小时，然后用对照组(PBS)或地塞米松(150μg/只鼠)治疗。每日1次，连续5天(n＝4只/组)。治疗5天后处死小鼠，取肺组织固定进行HE染色或者取肺组织放入TRIZOL裂解，如前面的实施例所示进行qPCR。

2.实验结果

(1)地塞米松治疗组小鼠H&E染色结果显示病毒导致的肺组织损伤较轻(图4A)，TNFa的免疫组化结果显示炎症因子表达较少(图4B)。在图4A和4B中，mock表示仅感染空白对照病毒的小鼠，PBS为用PBS处理组；Dex表示地塞米松治疗组；

(2)地塞米松治疗组小鼠qPCR结果显示肺组织病毒载量减少(图5A和图5B)。图5A和图5B分别表示地塞米松治疗后的小鼠肺中病毒基因NP(图5A)和ORF1ab(图5B)的qPCR结果，表明地塞米松显著降低肺组织病毒载量。

(3)地塞米松治疗组小鼠qPCR结果显示炎症因子IL-1(图6A)、IL-6(图6B)和TNFα(图6C)的表达也显著下降。

序列表

<110> 中国医学科学院基础医学研究所

<120> 糖皮质激素在制备治疗和/或预防呼吸道病毒感染的药物中的用途

<130> 310320CG

<160> 8

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> primer_bind

<223> ORF1ab上游引物

<400> 1

ccctgtgggt tttacactta a 21

<210> 2

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> primer_bind

<223> ORF1ab下游引物

<400> 2

acgattgtgc atcagctga 19

<210> 3

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> primer_bind

<223> NP上游引物

<400> 3

ggggaacttc tcctgctaga at 22

<210> 4

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> primer_bind

<223> NP下游引物

<400> 4

cagacatttt gctctcaagc tg 22

<210> 5

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> primer_bind

<223> IL-6上游引物

<400> 5

tagtccttcc taccccaatt tcc 23

<210> 6

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> primer_bind

<223> IL-6下游引物

<400> 6

ttggtcctta gccactcctt c 21

<210> 7

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> primer_bind

<223> 组织蛋白酶 L上游引物

<400> 7

acagaagact gtatggcacg a 21

<210> 8

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> primer_bind

<223> 组织蛋白酶 L下游引物

<400> 8

gtattccccg ttgtgtagct g 21