一种牛轮状病毒感染动物模型及其建立方法和应用

技术领域

本发明属于反刍家畜流行病领域，具体涉及一种牛轮状病毒感染动物模型及其建立方法和应用。

背景技术

轮状病毒引起的腹泻对于畜牧业发展影响不可忽视，在全球已经成为了一项重要的公共卫生问题。轮状病毒是通过粪口传播，感染率非常高，尤其对幼龄动物损害非常大，主要引其幼畜腹泻、脱水和死亡，其中对于犊牛，腹泻发生率高达60％-80％，死亡率高达30％，是引起犊牛腹泻的主要原因。然而目前对于该病毒对犊牛的致病性和致病机制还未见报道。

发明内容

针对现有技术中存在的一个或多个问题，本发明的一个方面提供一种牛轮状病毒感染动物模型的建立方法，其包括使10日龄内的犊牛感染牛轮状病毒，建立所述牛轮状病毒感染动物模型。

在一些实施方式中，所述犊牛为3-10日龄内的犊牛。

在一些实施方式中，使所述犊牛感染牛轮状病毒为通过口服途径向所述犊牛接种牛轮状病毒的病毒液。

在一些实施方式中，所述牛轮状病毒的病毒液为使用MA104细胞培养所述牛轮状病毒所获得病毒液。

在一些实施方式中，所述牛轮状病毒的病毒液的病毒滴度为10

在一些实施方式中，在使所述犊牛感染牛轮状病毒后还包括验证的步骤：每天观察犊牛腹泻程度，通过荧光定量PCR方法检测粪便排毒情况和犊牛肠道组织的病毒载量，以及观察犊牛肠道病理变化并进行免疫组化分析。

在一些实施方式中，在所述荧光定量PCR方法中使用的引物和探针序列分别如序列表中SEQ ID NO:1-3所示。

在一些实施方式中，所述观察犊牛肠道病理变化包括：将犊牛病变组织使用石蜡包埋后切片，再使用苏木精-伊红(H-E)染色，再用显微镜进一步检查组织病变，确定病理变化。

在一些实施方式中，所述进行免疫组化分析包括：将犊牛病变组织使用石蜡包埋后切片，进行免疫组化分析；其中在所述免疫组化分析中，一抗使用兔抗BRV多克隆血清孵育后，使用PBS清洗切片表面，再使用二抗(Gote Anti-Mouse IgG Antibody HPR)孵育，清洗细胞表面后，观察肠道细胞颜色。

本发明另一方面还提供一种牛轮状病毒感染动物模型，其由上述的方法建立得到。

上述的牛轮状病毒感染动物模型在研究轮状病毒腹泻的发病后临床症状、发病机制及规律、在建立牛轮状病毒发病相关评价方法和标准、以及在筛选用于治疗轮状病毒腹泻的药物和评价牛轮状病毒疫苗的免疫保护效果中的应用也属于本发明的内容。

基于以上技术方案提供的牛轮状病毒感染动物模型通过口服途径使10日龄以内的犊牛感染牛轮状病毒建立获得，并通过每天观察感染BRV的犊牛腹泻程度，通过荧光定量PCR方法检测粪便排毒情况和犊牛肠道组织的病毒载量，以及观察犊牛肠道病理变化并进行免疫组化分析等多项指标综合评价，证实该牛轮状病毒感染动物模型成功构建。本发明提供的牛轮状病毒感染动物模型能够模拟临床上BRV感染牛的真实临床症状，可以用于研究牛轮状病毒腹泻的发病机制及规律，并可用于建立牛轮状病毒发病相关评价方法和标准，以及用于筛选治疗牛轮状病毒腹泻的药物，还可以用于评价牛轮状病毒疫苗的免疫保护效果。

附图说明

图1为不同年龄段的犊牛腹泻临床症状观察照片。

图2为不同年龄段犊牛在攻毒后的粪便中BRV排毒情况随时间的变化曲线。

图3为不同年龄段犊牛在攻毒后肠道器官病变情况。

图4为3-10日龄犊牛的肠道病变情况。

图5为20-30日龄犊牛的十二指肠和空肠的病变情况。

图6为3-10日龄犊牛的十二指肠病理切片的HE染色结果。

图7为3-10日龄犊牛的空肠段病理切片的HE染色结果。

图8为3-10日龄犊牛的回肠段病理切片的HE染色结果。

图9为3-10日龄犊牛的肠道肠绒毛上皮细胞和肠腺细胞的免疫组化结果。

具体实施方式

以下结合具体实施例，对本发明进一步阐述。应当理解的是，具体实施例仅用于进一步说明本发明，而不是用于限制本发明的内容。

实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法。具体步骤可参见：《分子克隆实验指南》(《Molecular Cloning:A Laboratory Manual》Sambrook，J.，Russell，David W.，Molecular Cloning:A Laboratory Manual，3rd edition，2001，NY，Cold SpringHarbor)。

实施例中描述到的各种生物材料的取得途径仅是提供一种实验获取的途径以达到具体公开的目的，不应成为对本发明生物材料来源的限制。事实上，所用到的生物材料的来源是广泛的，任何不违反法律和道德伦理能够获取的生物材料都可以按照实施例中的提示替换使用。

实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，实施例将有助于理解本发明，但不应作为对本发明内容的限制。

实施例中的引物序列可通过已有技术合成。

实施例1：牛轮状病毒(BRV)的分离培养、鉴定和传代

该实施例使用的BRV毒株为专利文献CN113552336A的实施例1中采集、鉴定和培养获得的BRV毒株的F6代次。

该BRV毒株的病毒液的制备方法如下：将临床采集的犊牛腹泻病料，按照1mg粪便加入1mL的DMEM溶液，反复冻融3次，离心取上清，于0.22μM滤膜过滤，将滤液接种于MA104细胞中，培养纯化后得到BRV病毒液(经实时荧光PCR证实确实为BRV病毒液，其中用于PCR检测的引物探针序列如下所示：上游引物：GGCTTTAAAAGMGAGAAT(SEQ ID NO:1)，下游引物：RTTAGAAYTGTGGTATATTC(SEQ ID NO:2)，探针：FAM-CGTTTGGCTAGCGGTTAGCTCCTT-TAMRA(SEQID NO:3))。经检测，该病毒液的病毒滴度为2×10

实施例2：牛轮状病毒感染动物模型的建立

2.1、实验设计：

选用10日龄内(3-10日龄)犊牛10头，20-30日龄内犊牛10头，和30-50日龄内犊牛10头，不同年龄段的10头犊牛随机分为对照组和攻毒组，每组5头犊牛，使用实施例1获得的BRV病毒液10mL，通过口服途径进行灌服感染犊牛。另外对照组使用10mL未接种BRV毒株的MA104细胞培养液同时灌服。攻毒后每天观察犊牛精神状态、食欲、腹泻临床症状，并且每天采集每头犊牛肛拭子和粪便，通过实时荧光PCR检测肛拭子和粪便中BRV的排毒情况，在攻毒后5天的犊牛进行剖解，观察其消化道的病变情况，并对病变较为明显的肠道组织进行病理组织切片和免疫组化切片制作，同时将不同段的肠道研磨后使用荧光定量PCR检测不同组织内的病毒载量。

2.2、犊牛腹泻临床症状评分：

按照上述步骤2.1进行犊牛攻毒后，每天检测各犊牛的体重，并做好记录，根据相应腹泻程度，制定评分标准，评分如下所示：1级粪便成型，落地不散，表面完整；2级粪便呈粘稠状，落地散开但不飞溅，有组织脱落物；3级粪便呈稠状，落地散开并四处飞溅，飞溅范围基本在方圆1米之内；4级便呈水样，落地四处飞溅，飞溅范围在方圆1米之外。每天根据犊牛腹泻严重程度进行评分，评分越高说明发病程度越严重，之后统计所有的攻毒数据，分析数据。

结果表明：不同年龄段的犊牛(10日龄内，20-30日龄，和30-50日龄)在感染轮状病毒后腹泻程度及临床症状均不一样，10日龄内犊牛在感染后第二天出现轻微的腹泻，粪便呈粘稠状(2级腹泻)，到3-7天后粪便变为水样稀便并呈现喷射状(4级腹泻)，排泄物中还夹杂出现了肠道粘膜脱落物，感染8-10天后症状缓解，腹泻程度减轻。在整个感染过程中，部分犊牛在发病后能够逐渐恢复，部分牛腹泻严重，出现肌肉颤栗、精神沉郁和脱水最终死亡。20-30日龄犊牛在感染后第2天也出现轻微的腹泻，攻毒后3-5天腹泻加重甚至呈现喷射状，但未发现粘膜脱落物(2-3级腹泻)，全部犊牛在感染后第4天腹泻减轻并恢复。30-50日龄内犊牛感染后第3天部分个体出现轻微腹泻(1级腹泻)，并且持续2-3天后，腹泻减轻病恢复。各组犊牛的腹泻临床症状观察照片如图1所示。

综上所述，日龄越小犊牛在感染BRV后，症状越明显，所以为了显著观察到发病犊牛腹泻临床症状，在攻毒模型建立方面，最好选择在10日龄内的新生犊牛建立动物感染模型。

2.3、实时荧光PCR检测肛拭子和粪便中BRV的排毒情况以及肠道组织的病毒载量：

均首先使用Trizol提取法提取肛拭子(加入2ml PBS液体，反复冻融3次)、粪便和肠道组织(粪便和肠道组织样品加入等量的PBS液研磨离心取上清液)样品中的RNA，通过反转录和实时荧光PCR方法检测样品中轮状病毒的含量，其中定量检测使用的引物和探针序列分别如序列表中SEQ ID NO:1-3所示，探针5’端连接有FAM荧光报告基团，3’端连接有TAMRA荧光淬灭基团。该检测方法对于轮状病毒最低检测线为10

通过实时荧光PCR检测攻毒后第1-7天各组犊牛粪便中的BRV病毒RNA含量，结果如图2所示，可见10日龄内新生犊牛在攻毒后第2天排毒量直线上升而且持续5-6天后出现下降趋势，结合上述2.2中观察的腹泻临床症状情况，排毒高峰期间新生犊牛腹泻程度剧烈，期间部分犊牛由于腹泻严重出现了脱水和死亡的情况；10-20日龄新生犊牛攻毒第2天也出现了轻微程度的排毒，持续时间较短，之后未检测到排毒；通过排毒情况可以看出10-20日龄犊牛在攻毒后对BRV的易感性下降，该病毒没有在肠道中大量增殖。30-50日龄新生犊牛攻毒后检测的排毒量均为零，说明该日龄段犊牛对BRV没有易感性。

2.4、肠道病理切片和临床病灶的观察：

将发病严重的犊牛剖解后，观察各器官的病理变化，尤其是肠道病理变化，取病变和未病变的组织的交接处，放于10％的甲醛溶液中固定，制备石蜡切片，使用HE染色，通过显微镜观察肠道组织切片，进行病理分析。

将不同日龄段的犊牛口服BRV病毒液后，七天后对攻毒犊牛进行解剖，观察脏器变化，结果如图3-5所示，其中图3表示各组犊牛的肠道器官的病理变化情况，其中饲养第10天表示空白对照组；图4表示3-10日龄犊牛(攻毒组和对照组)的各类型肠道的病理变化情况；图5表示20-30日龄犊牛在攻毒后的十二指肠和空肠的病理变化情况。可见3-10日龄犊牛感染BRV后肠道变化明显，肠道变薄明显，肠道内壁充血明显，并且十二指肠和全部的空肠段均为深红色，肠粘膜出现脱落。20-30日龄犊牛感染BRV后肠道空肠段外部观察未明显变薄，解剖内部发现十二指肠和空肠段有部分肠段出现红肿，但是肠道粘膜未出现脱落，其他肠段未出现太严重的病变。30-50日龄犊牛感染BRV后肠道几乎没有异常变化。

将3-10日龄犊牛解剖后的病变肠道使用10％甲醛固定后，制备组织切片，由于牛轮状病毒对犊牛的十二指肠、空肠和回肠侵染性严重，所以该组织切片观察主要集中在十二指肠、空肠和回肠。图6-8分别示出了3-10日龄犊牛(攻毒组和对照组)的十二指肠、空肠、回肠病理切片的HE染色结果，可见十二指肠出现局部轻度坏死性肠炎，肠壁各层界限清晰，肠绒毛上皮细胞多数脱落，局部见绒毛顶部固有层轻度坏死，核浓缩和核破碎。固有层淋巴细胞和嗜酸性粒细胞明显浸润；空肠肠壁结构完整，1/2左右肠绒毛顶部上皮细胞完全脱落，固有层淋巴细胞密集，淋巴滤泡多见，固有层充血，绒毛顶部固有层疏松；回肠部分黏膜上皮细胞脱落，未脱落上皮细胞轻度到明显的肿胀，多处固有层水肿明显，淋巴细胞、浆细胞和嗜酸性粒细胞明显浸润，部分李氏陷窝上皮肿胀明显，核肿胀明显。

2.5、肠道病理切片的免疫组化试验：

将石蜡切片加热脱蜡，再使用胰酶修复细胞，使用兔抗BRV多克隆血清作为一抗孵育1h后，使用1×TBST清洗切片表面后，再使用二抗(Gote Anti-Mouse IgG Antibody HPR)孵育1h后，清洗细胞表面后，可以看到被BRV感染后的肠道细胞呈现粉色，而呈现蓝色是正常未感染的细胞。

通过对3-10日龄犊牛(攻毒组和对照组)的肠道病理切片进行免疫组化染色后，其免疫组化切片见图9所示，为肠道肠绒毛上皮细胞和肠腺细胞的免疫组化结果，可见在攻毒组细胞组织切片中均出现了阳性信号(呈现粉色)，提示为BRV成功侵染。所以通过组化切片显示，牛轮状病毒主要是通过感染宿主肠道绒毛上皮细胞和肠腺细胞，使宿主出现牛轮状病毒发病症状。

综上实施例结果，本发明通过使用BRV病毒液经口服途径感染不同年龄段(10日龄内、10-20日龄、30-50日龄)的犊牛，并从实验室的临床腹泻症状、病理解剖变化、病理组织学变化、免疫组化和粪便排毒情况等多项指标，对其致病性进行多方位评价，最终确定了以10日龄内(例如3-10日龄)的犊牛作为建立牛轮状病毒感染模型的实验动物，基于该牛轮病毒感染动物模型可研究该病的发病后临床症状、发病机制及规律，结果显示：10日龄内犊牛在感染BRV后第2天出现轻微的腹泻，并且发病严重，持续时间大约为5天左右，发病牛只出现死亡、有部分牛只出现恢复，但愈后状态非常差。通过PCR检测排毒情况发现10日龄内犊牛感染BRV后第2天排毒量直线上升而且持续5-6天后出现下降趋势，这与观察到的犊牛临床腹泻情况一致，即排毒高峰期间新生犊牛腹泻程度剧烈，期间部分牛只由于腹泻严重出现了脱水和死亡的情况。通过病理解剖后发现10日龄内犊牛感染BRV后肠道变化明显，肠道变薄明显，而且肠道内壁充血明显，十二指肠和全部的空肠段均为深红色，肠粘膜出现脱落。通过对患病犊牛的肠道组织切片发现，轮状病毒对主要损害犊牛的十二指肠、空肠和回肠，通过免疫组化切片来看，牛轮状病毒主要侵染的位置为肠道绒毛上皮细胞和肠腺细胞。不同肠段的组织切片也显示，肠绒毛上皮细胞多数脱落，固有层充血，绒毛顶部固有层出现坏死，期间淋巴细胞、浆细胞和嗜酸性粒细胞明显浸润。因此，本发明成功建立了牛轮状病毒感染动物模型，该模型可以为深入研究该病的发病后临床症状、发病机制及规律，为建立牛轮状病毒发病相关评价方法和标准奠定基础，并可用于筛选治疗牛轮状病毒腹泻的药物和评价牛轮状病毒疫苗的免疫保护效果。

最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。