FRS2–FGFR相互作用的小分子抑制剂

技术领域

本发明涉及FRS2–FGFR相互作用的小分子抑制剂。本发明涉及用作药物和用于癌症治疗或预防的小分子抑制剂。

背景技术

瘤细胞在远离它们起源的器官中转移、传播和生长，引起高达90％的癌症相关死亡率。有效的癌症治疗主要取决于特异性预防转移的能力，迫切需要毒性较小的靶向抗转移治疗。在所有实体瘤的大多数中，转移的重要和基本原因是癌细胞的失控的活动行为。微环境使细胞行为成形并决定肿瘤的转移结果。Kumar等人(Cell Reports,2018,vol.23,issue 13,P3798–3812)阐述了微环境线索如何控制儿科脑肿瘤、髓母细胞瘤(MB)中的肿瘤细胞侵袭。它们显示bFGF促进MB肿瘤细胞通过FGF受体(FGFR)体外侵袭，并且FGFR的阻断抑制体内脑组织浸润。TGF-β以依赖环境的方式调节促迁移bFGF的功能。在低bFGF下，非经典TGF-β通路引起ROCK的激活和ERK1/2的皮质易位，其通过失活FGFR底物2(FRS2)拮抗FGFR信号传导，并促进收缩的、非运动的表型。在高bFGF下，bFGF诱导的ERK1/2对FRS2的负反馈调节导致FGFR通路的抑制。在这些条件下，TGF-β抵消FRS2的失活并恢复促迁移信号传导。这些发现指出了通过FRS2同时检测bFGF和TGF-β信号传导作为控制肿瘤细胞侵入的机制。因此，靶向FRS2代表消除异常FGFR信号传导的新兴策略。

基于上述现有技术，本发明的目的是提供FRS2–FGFR相互作用的小分子抑制剂的手段和方法。该目的通过本说明书的独立权利要求的主题来实现。

发明内容

本发明的第一方面涉及用于治疗或预防转移的具有通式(500)的化合物

其中

-X

-R

特别是R

-R

-n为0、1、2、或3，特别是n为1；

-m为0、1、2、3、或4，特别是m为1或2。

本发明的第二方面涉及用作血管生成拮抗剂的如第一方面所述的化合物。在某些实施方式中，在癌症的治疗或预防中提供血管生成拮抗剂。在某些实施方式中，所述癌症选自膀胱癌、肝细胞癌和前列腺癌。

本发明的第三方面涉及用于预防或治疗FGFR驱动的疾病的如第一方面所述的化合物，其中短暂或慢性病理状况是FGFR信号传导诱导的。FGFR是受体酪氨酸激酶，涉及细胞增殖、细胞分化、细胞迁移和细胞存活。遗传改变，如FGFR信号传导通路中的基因扩增、活化突变和染色体易位，涉及多种肿瘤类型、发育和骨骼疾病。

本发明的第四方面涉及通式(700)的化合物

其中

-R

-R

或

-R

-X

-条件是所述化合物非特征在于式(001)，

本发明的第五方面涉及用作药物的根据第四方面所述的化合物，条件是所述化合物包含特征在于式(001)的化合物，

本发明的第六方面涉及用于治疗或预防癌症的根据第四方面的化合物，条件是所述化合物包含特征在于式(001)的化合物。

在另一个实施方式中，本发明涉及一种药物组合物，其包括至少一个本发明的化合物或其药学上可接受的盐和至少一个药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。

来自活化的成纤维细胞生长因子受体(FGFR)酪氨酸激酶的信号的传递促进肿瘤细胞中的致癌功能，包含增殖、存活和细胞迁移和侵袭。通过针对FGFR设计的激酶抑制剂中断从活化的FGFR至下游信号转导级联的信号传递是减弱这些致癌功能的已建立的手段。除了在许多恶性肿瘤中FGFR的异常活化之外，还观察到FGFR活化在接受激酶抑制剂靶向治疗的患者癌症中作为逃避机制，这导致肿瘤再生长和进展。本申请中描述的小分子化合物将阻止信号从活化的FGFR传递至下游效应分子，特别是传递至有丝分裂原活化的蛋白激酶(MAPK)，其是肿瘤发生的关键驱动剂。

这些化合物结合FRS2。FGFR底物2(FRS2)是主要特异于FGF信号通路的关键衔接蛋白。它是FGFR的唯一下游效应物。FRS2通过C末端磷酸–酪氨酸结合(PTB)结构域与FGFR相互作用，并通过装配阳性和阴性信号传导蛋白以介导重要的FGF诱导的细胞功能而用作分子中枢。它将信号从FGFR(细胞外)传递到细胞内。因此，靶向FGF信号通路非常上游的FRS2有效地关闭FGFR信号的下游效应物，尤其是MAPK。

该化合物特异性结合FRS2蛋白的磷酸酪氨酸结合(PTB)结构域(图7)。化合物结合诱导PTB结构域中的构象转变，其阻止FGFR诱导的信号通过FRS2传递。最初选择二个潜在的结合位点：结合位点1不参与FGFR结合，位于FGFR的N末端与FRS2相互作用位点的下方。结合位点2是与FGFR的C末端相互作用的延伸的表面区域。

化合物–靶相互作用、靶结构域中的构象变化和传递阻断的机制是独特的，并且不依赖于受体酪氨酸激酶抑制。此外，与FGFR不同，FRS2与其他衔接蛋白不具有任何共有的蛋白结构域。因此，与现有的激酶抑制剂相比，预期脱靶活性要低得多。与现有FGFR靶向策略相反，所述化合物还特异性干扰与肿瘤发生和肿瘤进展特别相关的那些FGFR功能。

与现有FGFR靶向策略相反，所述化合物还特异性干扰那些与肿瘤发生和肿瘤进展，如增殖、迁移和侵袭和血管发生特别相关的FGFR功能。有证据表明FRS2–FGFR相互作用在许多类型的癌症中发生改变，例如在前列腺癌(Yang,F.et al.Cancer Res 73,3716–3724,2013、Liu J et al.Oncogene.2016Apr 7；35(14):1750–9)、食管癌(Nemoto,T.,Ohashi,K.,Akashi,T.,Johnson,J.D.&Hirokawa,K.Pathobiology 65,195–203,1997)、甲状腺癌(St Bernard,R.et al.Endocrinology 146,1145–1153,2005)、肝细胞癌(Zheng,N.,Wei,W.Y.&Wang,Z.W.Transl Cancer Res 5,1–6,2016、Matsuki M et al.CancerMed.2018Jun；7(6):2641–2653)、睾丸癌(Jiang,X.et al.J Diabetes Res,2013)、髓母细胞瘤(Santhana Kumar,K.et al.Cell Rep 23,3798–3812e3798,2018)、横纹肌肉瘤(Goldstein,M.,Meller,I.&Orr-Urtreger,A.Gene Chromosome Canc 46,1028–1038,2007)、胃癌(Kunii,K.et al.Cancer Res 68,3549–3549,2008)、肺多形性癌(Lee,S.etal.J Cancer Res Clin 137,1203–1211,2011)、乳腺癌(Penaultllorca,F.et al.Int JCancer 61,170–176,1995)、非小细胞肺癌(Dutt,A.et al.Plos One 6,2011)、脂肪肉瘤(Zhang,K.Q.et al.Cancer Res 73,1298–1307,2013)、宫颈癌(Jang,J.H.,Shin,K.H.&Park,J.G.Cancer Res 61,3541–3543,2001)、结直肠癌(Sato,T.et al.Oncol Rep 21,211–216,2009)、黑素瘤(Becker,D.,Lee,P.L.,Rodeck,U.&Herlyn,M.Oncogene 7,2303–2313,1992)、多发性骨髓瘤(Kalff,A.&Spencer,A.Blood Cancer J,2,2012)、子宫内膜癌(Konecny,G.E.et al.Mol Cancer Ther 12,632–642,2013)、膀胱癌(Cappellen,D.etal.Nat Genet 23,18–20,1999、Wu S et al.Nat Commun.2019Feb 12；10(1):720)、胶质母细胞瘤(Morrison,R.S.et al.Cancer Res 54,2794–2799,1994)、肺鳞状细胞癌(Weiss,J.et al.Sci Transl Med 4,2012)、卵巢癌(Cole,C.et al.Cancer Biol Ther 10,2010)、头颈癌(Koole,K.et al.Virchows Arch 469,S31–S31,2016)和胰腺癌(Ishiwata,T.etal.Am J Pathol 180,1928–1941,2012)。

具体实施方式

术语和定义

除非另有定义，本文所用的所有技术和科学术语具有与本领域(例如，在细胞培养、分子遗传学、核酸化学、杂交技术和生物化学中)普通技术人员通常理解的相同的含义。分子、遗传和生物化学方法使用标准技术(一般见Sambrook et al.,Molecular Cloning:ALaboratory Manual,2

在本说明书的上下文中，C

在本说明书的上下文中，术语C

在本说明书的上下文中，术语碳环涉及仅由碳和氢原子组成的环部分。芳族碳环也称为芳基。非芳族碳环也称为环烷基。

在本说明书的上下文中，术语杂环涉及环部分，其中至少一个环原子或几个环原子被氮、氧和/或硫原子替代。芳族杂环也称为杂芳基。非芳族杂环为环烷基，其中至少一个环原子或几个环原子被氮、氧和/或硫原子代替。

在本说明书的上下文中，术语杂双环涉及二个直接连接的环，其中至少一个环原子或几个环原子被氮、氧和/或硫原子替代。杂双环由二个杂环或由一个杂环和一个碳环组成。

术语未被取代的C

术语未被取代的C

当用于化学式的上下文中时，可以使用以下缩写：Me是甲基CH

术语被取代的烷基在其最宽泛的意义上是指最宽泛的意义上如上定义的烷基，其与不是碳或氢的原子，特别是选自N、O、F、B、Si、P、S、Cl、Br和I的原子，共价连接，其本身可以——如果适用的话——与该基团的一个或几个其他原子连接、或与氢连接、或与不饱和或饱和的烃(烷基或芳基，在其最宽泛的意义上)连接。在较窄的意义上，被取代的烷基是指在最宽泛的意义上如上定义的烷基，其在一个或几个碳原子上被选自氨基NH

术语被羟基取代的基团是指被一个或几个羟基OH修饰的基团。

术语被氨基取代的基团是指被一个或几个氨基NH

术语被羧基取代的基团是指被一个或几个羧基COOH修饰的基团。

被氨基取代的烷基的非限制性实例包含：作为末端部分的–CH

被羟基取代的烷基的非限制性实例包含作为端基部分的–CH

术语被磺酰基取代的基团是指被一个或几个磺酰基–SO

术语被氨基取代的基团是指被一个或几个氨基–NHR或–NR

术语被羰基取代的基团是指被一个或几个羰基–COR、或其衍生物修饰的基团，其中R具有如前一段中所述的含义，并与本说明书中赋予R的其他含义不同。

酯是指被一个或几个酯基–CO

酰胺是指被一个或几个酰氨基–CONHR修饰的基团，其中R在说明书中进一步定义。

术语被卤素取代的基团是指被一个或几个(独立地)选自F、Cl、Br、I的卤素原子修饰的基团。

术语被氟取代的烷基是指被一个或几个氟基团F修饰的根据上述定义的烷基。被氟取代的烷基的非限制性实例包含–CH

被羟基和氟取代的烷基的非限制性实例包含–CHFCH

在本说明书的上下文中，术语芳基表示环状芳族C

杂芳基是包括一个或几个氮、氧和/或硫原子的芳基。杂芳基的实例包含，但不限于，吡咯、噻吩、呋喃、咪唑、吡唑、噻唑、

本文所用的术语药物组合物是指本发明的化合物或其药学上可接受的盐，以及至少一种药学上可接受的载体。在某些实施方式中，根据本发明的药物组合物以适于局部、肠胃外或可注射的施用的形式提供。

如本文所用，术语药学上可接受的载体包含本领域技术人员已知的任何溶剂、分散介质、包衣、表面活性剂、抗氧化剂、防腐剂(例如抗菌剂、抗真菌剂)、等渗剂、吸收延迟剂、盐、防腐剂、药物、药物稳定剂、粘合剂、赋形剂、崩解剂、润滑剂、甜味剂、调味剂、染料等及其组合(参见例如Remington:the Science and Practice of Pharmacy,ISBN0857110624)。

如本文所用，术语治疗或治疗任何疾病或病症(例如癌症)在一个实施方式中是指改善疾病或病症(例如减缓或阻止或减少疾病或其至少一种临床症状的发展)。在另一个实施方式中，“治疗”或“治疗”是指减轻或改善至少一种身体参数，包含患者可能无法辨别的那些。在另一个实施方式中，“治疗”或“治疗”是指调节疾病或病症，在身体上(例如，可辨别症状的稳定化)、在生理上(例如，身体参数的稳定化)、或在二者上。用于评估疾病的治疗和/或预防的方法。

在本说明书的上下文中，术语转移涉及瘤细胞在同一器官或远离其起源的器官中的原始瘤床外的传播和生长。在具体实施方式中，使用所公开的化合物的治疗或预防用于与异常FGFR信号传导相关的转移。本发明的化合物特别地降低转移细胞的能动行为并降低传播。在具体的实施方式中，本发明的化合物用于预防或治疗癌细胞的运动和扩散。

FGFR驱动的肿瘤发生

全人类的约7％肿瘤具有FGFR改变(66％基因扩增，26％突变，8％基因重排)(Helsten,T.et al.,Clin Cancer Res.,259–268(2016)doi:10.1158/1078-0432.CCR-14-3212)。FGFR1在20–25％的鳞状非小细胞肺癌(Weiss,J.et al.,Science TranslationalMedicine(2010)doi:10.1126/scitranslmed.3001451)和15％的乳腺癌(Andre,F.etal.,Clin Cancer Res.,15,441–452(2009))中频繁扩增，并在18％的中线神经胶质瘤中突变(Di Stefano,A.L.et al.,Journal of Clinical Oncology 36,2005(2018))。FGFR2主要由肝内胆管癌(iCCA，15％)中的基因融合激活，并且还描述了10％的子宫内膜肿瘤中的突变(Konecny,G.E.et al.,The Lancet Oncology 16,686–694(2015)；Verlingue,L.etal.,European Journal of Cancer 87,122–130(2017))。FGFR3受尿路上皮癌突变的影响(在转移环境中高达20％

选择性(例如AZD4547、NVP-BGJ398和JNJ-42756493)和非选择性(例如多韦替尼或普纳替尼)FGFR抑制剂已经被研究用于癌症治疗(Facchinetti,F.et al.,Clin CancerRes,(2020)doi:10.1158/1078-0432.CCR-19-2035；Yamaoka,T.et al.,Int.J.Mol.Sci.19,1–35(2018))。对FGFR抑制剂的抗性可与其他RTK抑制剂类似地发展，要么是通过在催化结构域中形成守门员突变要么是激活备选的RTK，这使得旁路机制能够用于下游信号传导激活(Yamaoka,T.,et al.,Int.J.Mol.Sci.19,1–35(2018))。FGFR中的这种突变可发生在ATP结合裂缝中，并可产生空间冲突以限制药物结合功效。实例包含FGFR3_V555M、FGFR1_V561和FGFR2_V564，其在体外诱导对FGFR抑制剂的抗性(Chell,V.et al.,Oncogene 32,3059–3070(2013)；Byron S.A.et al.,Neoplasia 15,975–988(2013))。

发明人的靶向非酶促活性FGFR接头蛋白FRS2的方法可通过阻断RTK下游的信号传导来防止FGFR守门员突变的进化或帮助克服守门员FGFR驱动的肿瘤的抗性。靶向FRS2可能也有效对抗由FGFR3–TACC3融合驱动的肿瘤，其中FRS2被磷酸化并将信号传导至致癌MAP激酶通路(Chew,N.J.et al.,Cell Communication and Signaling 18,1–17(2020))。此外，与FGFR抑制剂治疗相关的毒性已有报道，包含高磷血症、疲劳、皮肤干燥和口腔炎、手足综合征和胃肠功能障碍(Facchinetti,F.et al.,Clin Cancer Res,(2020)doi:10.1158/1078-0432.CCR-19-2035)。特异性靶向具有有限脱靶化合物活性的FRS2的方法可降低目前与FGFR抑制相关的毒性的严重程度。

本发明的第一方面涉及用于治疗或预防转移的具有通式(500)的化合物

其中

-X

-R

特别是R

-R

-n为0、1、2、或3，特别是n为1；

-m为0、1、2、3、或4，特别是m为1或2。

在某些实施方式中，R

-R

或

-R

在某些实施方式中，所述化合物具有通式(700)

其中

-R

-R

-X

在某些实施方式中，R

在某些实施方式中，R

在某些实施方式中，R

在某些实施方式中，R

在某些实施方式中，R

在某些实施方式中，R

在某些实施方式中，X

在某些实施方式中，转移由选自膀胱癌、小儿脑瘤、髓母细胞瘤、多发性骨髓瘤、结直肠癌和胃癌的癌症引起。

本发明的第二方面涉及用作血管生成拮抗剂的如第一方面所述的化合物。在某些实施方式中，在癌症的治疗或预防中提供血管生成拮抗剂。在某些实施方式中，所述癌症选自膀胱癌、肝细胞癌和前列腺癌。

本发明的第三方面涉及用于预防或治疗FGFR驱动的疾病的如第一方面所述的化合物。

本发明的第四方面涉及通式(700)的化合物

其中

-R

-R

或

-R

-X

-条件是所述化合物非特征在于式(001)，

双环结构与靶蛋白上富含甘氨酸和精氨酸的区域相互作用。双环结构与R152、R153、R137、G157、G159和G151特异性相互作用。

X

在某些实施方式中，R

电负性部分R

在某些实施方式中，R

在某些实施方式中，R

在某些实施方式中，R

在某些实施方式中，X

本发明的第五方面涉及用作药物的根据第四方面所述的化合物，条件是所述化合物包含特征在于式(001)的化合物，

本发明的第六方面涉及用于治疗或预防癌症的根据第四方面的化合物，条件是所述化合物包含特征在于式(001)的化合物。在某些实施方式中，所述癌症选自室管膜瘤(ependymoma)、前列腺癌、食管癌、甲状腺癌、肝细胞癌、睾丸癌、小儿脑瘤、髓母细胞瘤、横纹肌肉瘤、胃癌、肺多形性癌、乳腺癌、非小细胞肺癌、脂肪肉瘤、宫颈癌、结直肠癌、黑素瘤、多发性骨髓瘤、子宫内膜癌、膀胱癌、胶质母细胞瘤、肺鳞状细胞癌、卵巢癌、头颈癌、和胰腺癌、肉瘤。在某些实施方式中，癌症选自膀胱癌、多发性骨髓瘤、胃癌、小儿脑瘤、髓母细胞瘤、胶质母细胞瘤、室管膜瘤、结直肠癌和肉瘤。在某些实施方式中，癌症选自膀胱癌、小儿脑瘤、髓母细胞瘤、多发性骨髓瘤、结直肠癌和胃癌。

医学治疗、剂型和盐

类似地，在本发明的范围内的是一种治疗有需要的患者的癌症或转移的方法，其包括向所述患者施用根据以上描述的化合物。

类似地，提供了用于预防或治疗癌症的剂型，其包括根据本发明的任何上述方面或实施方式的非激动剂配体或反义分子。

技术人员知道任何具体提及的药物可以作为所述药物的药学上可接受的盐存在。药学上可接受的盐包括离子化的药物和带相反电荷的抗衡离子。药学上可接受的阴离子盐形式的非限制性实例包含乙酸盐、苯甲酸盐、苯磺酸盐、酒石酸氢盐、溴盐、碳酸盐、氯盐、柠檬酸盐、乙二胺四乙酸盐、乙二磺酸盐、双羟萘酸盐、依托酸盐、富马酸盐、葡庚糖酸盐、葡糖酸盐、氢溴酸盐、盐酸盐、碘盐、乳酸盐、乳糖酸盐、苹果酸盐、马来酸盐、扁桃酸盐、甲磺酸盐、甲基溴盐、甲基硫酸盐、黏酸盐、萘磺酸盐、硝酸盐、双羟萘酸盐、磷酸盐、焦磷酸盐、水杨酸盐、水杨酸氢盐、硬脂酸盐、琥珀酸盐、硫酸盐、酒石酸盐、甲苯磺酸盐、三乙碘盐和戊酸盐。药学上可接受的阳离子盐形式的非限制性实例包含铝盐、苄星盐、钙盐、乙二胺盐、赖氨酸盐、镁盐、葡甲胺盐、钾盐、普鲁卡因盐、钠盐、氨丁三醇盐和锌盐。

剂型可以是用于肠内施用，例如鼻、颊、直肠、经皮或口服施用，或作为吸入形式或栓剂。或者，可以使用肠胃外给药，例如皮下、静脉内、肝内或肌内注射形式。任选地，可以存在药学上可接受的载体和/或赋形剂。

局部给药也在本发明的有利用途的范围内。本领域技术人员知道用于提供局部制剂的宽范围的可能配方，例如Benson and Watkinson(Eds.),Topical and TransdermalDrug Delivery:Principles and Practice(1st Edition,Wiley 2011,ISBN-13:978-0470450291)；和Guy and Handcraft:Transdermal Drug Delivery Systems:Revised andExpanded(2

药物组合物和给药

本发明的另一方面涉及包括本发明化合物、或其药学上可接受的盐、和药学上可接受的载体，的药物组合物。在进一步的实施方式中，组合物包括至少二种药学上可接受的载体，例如本文所述的那些。

在本发明的某些实施方式中，本发明的化合物通常被配制成药物剂型以提供药物的容易控制的剂量并给予患者简洁的且容易操作的产品。

在涉及本发明化合物的局部用途的本发明实施方式中，以适于局部给药的方式配制药物组合物，例如水溶液、悬浮液、软膏、乳膏、凝胶或可喷雾制剂，例如用于通过气雾剂等递送，包括活性成分以及本领域技术人员已知的增溶剂、稳定剂、张力增强剂、缓冲剂和防腐剂中的一或更多个一起。

该药物组合物可以配制成用于口服给药、肠胃外给药或直肠给药。此外，本发明的药物组合物可以制成固体形式(包含但不限于胶囊、片剂、丸剂、颗粒剂、粉剂或栓剂)，或液体形式(包含但不限于溶液、悬浮液或乳液)。

本发明化合物的剂量方案将根据已知因素而变化，例如特定药剂的药效学特征及其施用模式和途径；接受者的物种、年龄、性别、健康、医学状况、和体重；症状的性质和程度；并行治疗的种类；治疗频率；给药途径、患者的肾和肝功能、以及所需的效果。在某些实施方式中，本发明的化合物可以以单次日剂量施用，或者总日剂量可以以每日二次、三次或四次的分剂量施用。

在某些实施方式中，本发明的药物组合物或组合可以是约1–1000mg活性成分的单位剂量，用于约50–70kg的受试者。化合物、药物组合物、或其组合的治疗有效剂量取决于所治疗的受试者的物种、体重、年龄和个体状况、病症或疾病或其严重性。普通的内科医生、临床医生或兽医可以容易地确定预防、治疗或抑制病症或疾病进展所需的每种活性成分的有效量。

本发明的药物组合物可以进行常规的制药操作，例如灭菌和/或可以含有常规的惰性稀释剂、润滑剂、或缓冲剂，以及佐剂，例如防腐剂、稳定剂、润湿剂、乳化剂和缓冲剂等。它们可以通过标准方法生产，例如通过常规的混合、制粒、溶解或冻干方法。许多制备药物组合物的程序和方法是本领域已知的，参见例如L.Lachman et al.The Theory andPractice of Industrial Pharmacy,4

根据本发明的制造方法和治疗方法

作为另外的方面，本发明还包括如本文辨认出的化合物或如上文详细说明的其药学上可接受的盐在制备用于治疗或预防癌症或转移的药物的方法中的用途。

类似地，本发明包括治疗已被诊断患有与癌症或转移相关的疾病的患者的方法。该方法需要向患者施用有效量的如本文详细说明的如本文辨认出的化合物或其药学上可接受的盐。

凡是单一可分离特征的替代物，例如配体类型或医学适应症，在此被列为“实施方式”，应理解为这些替代方案可自由组合以形成本文所公开的本发明的离散实施方式。因此，配体类型的任何备选实施方式可以与本文提及的任何医学适应症组合。

本发明还包括以下项。

项

1.一种化合物，具有通式(100)

R

其中

-L为由C

-R

特别是R

-BC为芳族或非芳族杂双环或碳环，其未被取代或被1–7个独立地选自C

-条件是所述化合物非特征在于式(001)，

2.根据项1所述的化合物，具有通式(201)、(202)、或(203)

其中

-L和R

-n为0、1、2、或3，特别是n为1；

-m为0、1、2、3、或4，特别是m为1或2；

-R

-X

特别是X

更特别是X

3.根据项1或2所述的化合物，具有通式(300)

其中

-X

4.根据前述项任一所述的化合物，具有通式(400)

其中

-X

5.根据前述项1–3任一所述的化合物，具有通式(500)

其中

-X

6.根据前述项1–3任一所述的化合物，具有通式(600)

其中

-X

-R

或

R

7.根据前述项任一所述的化合物，具有通式(700)

其中

-X

8.根据前述项1–4或6任一所述的化合物，其中L具有1–6个原子的长度，更特别是L具有2–4个原子的长度，最特别是L具有2个原子的长度。

9.根据前述项6或7任一所述的化合物，其中R

特别是R

10.根据前述项任一所述的化合物，其中R

特别是R

11.根据前述项任一所述的化合物，其中R

特别是R

12.根据前述项任一所述的化合物，其中X1为N。

13.根据前述项任一所述的化合物，用作药物，条件是所述化合物包含特征在于式(001)的化合物，

14.前述项任一所述的化合物，用于治疗或预防癌症，特别是其中所述癌症选自室管膜瘤、前列腺癌、食管癌、甲状腺癌、肝细胞癌、睾丸癌、小儿脑瘤、髓母细胞瘤、横纹肌肉瘤、胃癌、肺多形性癌、乳腺癌、非小细胞肺癌、脂肪肉瘤、宫颈癌、结直肠癌、黑素瘤、多发性骨髓瘤、子宫内膜癌、膀胱癌、胶质母细胞瘤、肺鳞状细胞癌、卵巢癌、头颈癌、和胰腺癌、肉瘤，更特别是所述癌症选自膀胱癌、多发性骨髓瘤、胃癌、小儿脑瘤、髓母细胞瘤、胶质母细胞瘤、室管膜瘤、结直肠癌和肉瘤，最特别是所述癌症选自膀胱癌、小儿脑瘤、髓母细胞瘤、多发性骨髓瘤、结直肠癌和胃癌，条件是所述化合物包含特征在于式(001)的化合物。

15.前述项1至12任一所述的化合物，用于治疗或预防转移，特别是其中所述转移由选自膀胱癌、小儿脑瘤、髓母细胞瘤、多发性骨髓瘤、结直肠癌和胃癌的癌症引起，条件是所述化合物包含特征在于式(001)的化合物。

16.前述项1至12任一所述的化合物，用作血管生成拮抗剂，特别是在癌症的治疗或预防中的血管生成拮抗剂，更特别是其中所述癌症选自膀胱癌、肝细胞癌、和前列腺癌，条件是所述化合物包含特征在于式(001)的化合物。

通过以下实施例和附图进一步说明本发明，从这些实施例和附图中可以得到进一步的实施方式和优点。这些实施例用于说明本发明，而不是限制其范围。

附图说明

图1显示了化合物F3.14抑制癌细胞侵袭能力的功效。该图表示在3种不同浓度——1μM、5μM和10μM下，F3.14的效力。

图2显示F3.14在10μM时的效力。

图3显示F3.14的结合亲和力和解离常数(Kd)。纳米衍射扫描荧光测定法(nanoDSF)和微量热泳(MST)是用于评估化合物与靶蛋白的结合的生物物理测定。任何高于1.5℃的温度变化被认为是显著结合的指示。

图4显示F3.14的有效抑制浓度——EC50(μM)。

图5显示了F3.14的生化特异性，其决定了化合物抑制FGF信号通路而不影响其他信号通路的能力。泳道1：对照——DAOY LA-EGFP细胞未刺激，血清饥饿过夜，然后裂解。泳道2：bFGF(100ng/ml)——过夜血清饥饿的DAOY LA-EGFP细胞，用bFGF刺激10分钟，然后裂解。泳道3：F3.14(10μM)——过夜血清饥饿的DAOY LA-EGFP细胞用F3.14处理四小时，用bFGF刺激细胞10分钟，然后裂解。

图6A)结合位点1不参与FGFR结合，位于FGFR的N末端与FRS2相互作用位点的下方。B)结合位点2是与FGFR的C末端相互作用的延伸的表面区域。

图7使用用bFGF+/-BGJ398或F3-14刺激的DAOY细胞的球状体侵入分析，以测定F3.14的EC50。

图8用BGJ398或F3.14处理的DAOY细胞进行CellTiter-Glo测定。

图9用BGJ398或F3.14处理的AGS细胞进行CellTiter-Glo测定。

图10用BGJ398或F3.14处理的M059K细胞进行CellTiter-Glo测定。

图11用BGJ398或F3.14处理的RT112细胞进行CellTiter-Glo测定。

图12用BGJ398或F3.14处理的DMS114细胞进行CellTiter-Glo测定。

图13用BGJ398或F3.14处理的HCT116细胞进行CellTiter-Glo测定。

图14用BGJ398或F3.14处理的SKOV3细胞进行CellTiter-Glo测定。

图15用BGJ398或F3.14处理的SNU16细胞进行CellTiter-Glo测定。

图16表格显示F3.14的体外吸收、分布、代谢、消除和毒性(ADMET)特性。流出比代表F3.14的渗透性，半热力学溶解度表示F3.14在水溶液中的溶解度。固有清除率和t

图17体内药代动力学，每治疗3只小鼠，化合物的血清浓度以μM表示。表格中显示了F3.14的体内药代动力学(PK)特性。

图18使用BGJ398或F3.14处理的各种FGFR驱动细胞系的免疫印迹，显示该处理对FGF信号传导的下游效应物的影响。

实施例

发明人通过筛选小分子的大片段文库设计了FRS2–FGFR相互作用的抑制剂。发明人辨认出了F3.14作为推定的FRS2–FGFR相互作用的小分子抑制剂。发明人使用生物物理测定——nanoDSF、MST和NMR分析，证实了F3.14与FRS2的结合。发明人使用FGFR驱动的癌细胞模型评价了F3.14在抑制癌细胞侵袭和增殖中的功效。球体侵入试验和CellTiter-Glo测定的结果表明，F3.14在所有测试的FGFR驱动癌细胞系中有效抑制癌细胞侵入和增殖。为了测试F3.14对FGF信号通路的作用，发明人使用免疫印迹。F3.14通过抑制FGF信号通路下游效应物的磷酸化来抑制FGF信号转导。发明人使用体外ADMET研究和体内PK研究来确定F3.14的“药物样”特性。这些分析的结果证明F3.14具有良好的渗透性、非常好的溶解性、中等的固有清除率、非常低的毒性、和高效力。体内PK研究表明F3.14在小鼠中耐受良好，并且可以通过静脉内途径安全地施用给活生物体以治疗FGFR驱动的疾病。

方法和仪器

球体侵入测定(SIA)和自动化细胞传播计数器(aCDc)

每孔1000个细胞/100μL接种在细胞排斥性96孔微板(650790，Greiner Bio-One)中。细胞在37℃孵育过夜以形成球状体。从各孔中除去70μL培养基，剩余的具有球状体的培养基用2.5％牛胶原蛋白1覆盖。胶原蛋白聚合后，向细胞中加入新鲜培养基，并用生长因子和/或抑制剂处理。使细胞侵入胶原蛋白基质24小时，然后用4％ PFA固定并用Hoechst染色。图像是在Axio Observer 2mot plus荧光显微镜(德国慕尼黑蔡司)上使用5×物镜获得的。细胞侵入被确定为从球体中心起算细胞侵入距离的平均值，如使用自动化细胞传播计数器(aCDc)和我们的细胞传播计数器软件aSDIcs(Kumar et al.,Sci Rep 5,15338(2015))所确定的。

纳米差示扫描荧光测定法(nanoDSF)

将纯化的用六聚组氨酸残基标记的FRS2蛋白和鸟氨酸核苷酸结合蛋白亚基β(GB1)在蛋白质缓冲液(100mM磷酸钠、50mM NaCl、0.5mM EDTA、50mM精氨酸、1mM TCEP，pH7.0)中稀释至终浓度30μM。将化合物以50或100mM溶解于100％中，并用100％ DMSO进一步稀释至终浓度1mM。将化合物和蛋白质以1∶1的比例混合，得到化合物终浓度15μM和500μM。在测量前将混合物在室温下温育15分钟。测量是在Prometheus系统上的高灵敏度毛细管中进行的。样品以1℃/min的间隔经受20–95℃的温度梯度。

微量热泳(MST)

将纯化的用六聚组氨酸残基标记的FRS2蛋白和鸟氨酸核苷酸结合蛋白亚基β(GB1)用二代BLUE-NHS染料标记。用60μM染料标记终浓度为20μM的蛋白质。在没有精氨酸补充的蛋白质缓冲液中进行标记。标记后将精氨酸再缓冲到蛋白质的缓冲液中。将化合物以50或100mM溶解于100％中，并用100％ DMSO进一步稀释至终浓度1mM。然后稀释化合物。在补充有10％ DMSO的蛋白质缓冲液中以1∶1比例从1mM连续稀释至61.04nM。将10μL的50nM标记蛋白质加入10μL各化合物稀释液中，使最终的标记蛋白质浓度为25nM、DMSO浓度为5％。将样品在室温下孵育15分钟。在优质涂覆的毛细管中进行实验。激发功率设定为20％，MST功率设定为40％(温度梯度4开尔文)，激光器开启时间为20秒，激光器关闭时间为3秒。温度设定为25℃。每次测量重复二次。相互作用以二个独立的重复进行测量。

免疫印迹(IB)

用bFGF(100ng/ml)和/或化合物处理癌细胞，并使用放射免疫沉淀分析(RIPA)缓冲液裂解。通过SDS-PAGE分离RIPA缓冲液裂解物，并根据制造商的说明书使用转移装置(Bio-Rad)转移至硝酸纤维素膜。用针对磷酸-FRS2、FRS2、ERK1/2、磷酸-ERK1/2、AKT、磷酸-AKT、磷酸-PKC和微管蛋白的第一抗体探测膜。使用HRP连接的二抗(1∶5000)检测一抗。化学发光检测使用ChemiDoc Touch凝胶和Western印迹成像系统(BioRad)进行。

CellTiter-Glo测定

根据制造商的说明书使用Promega的CellTiter-Glo测定来测定细胞的代谢活性和增殖。简言之，将每孔250个细胞/100μL(温育长达72小时)接种于Greiner Bio-oneμ-clear 384孔板(655090，Greiner Bio-one)中，并在37℃孵育过夜。然后用新鲜的无血清培养基替换旧培养基，并用BGJ398或F3.14处理细胞，直至所需的时间点。在每个时间点适当温育后，将10μL的CellTiter-Glo试剂加入每个孔(每孔CellTiter-Glo试剂的终浓度为1∶10)，并在37℃孵育30分钟。然后以每孔0.5至1秒的信号积分时间测量发光。

体内药物动力学

3只健康的非SCID小鼠用F3.14静脉内处理——在处理后2、4、6、8和24小时收集血液样品。从收集的血样中分离血清，测量血清中F3.14的浓度以确定F3.14的固有清除率。

通路分析

RIPA缓冲液FGFR驱动的细胞裂解物通过SDS-PAGE分辨，并根据制造商的说明书使用转移装置(Bio-Rad)转移至硝酸纤维素膜。用针对磷酸-FRS2、FRS2、ERK1/2、磷酸-ERK1/2、AKT、磷酸-AKT、磷酸-PKC和微管蛋白的第一抗体探测膜。使用HRP连接的二抗(1∶5000)检测一抗。化学发光检测使用ChemiDoc Touch凝胶和Western印迹成像系统(BioRad)进行。免疫反应条带的积分密度使用Adobe Photoshop CS5定量。

化合物的可用性

该化合物在ChemBridge以以下供应商ID购买：

F3.1424662310(ChemBridge)