废纤维素的碱性水解

引起本发明的部分活动在由欧盟地平线(European Union’s Horizon)2020研究和创新计划下的公私合营生物基产业联合企业(Bio Based Industries JointUndertaking)根据拨款协议第745746号资助的项目内进行。

本发明涉及通过其可以由使用废纤维素生物质作为原料来获得复数种可以用作化学中间体的有机化合物的方法。通过该方法，可以从所述废纤维素生物质中提取、分离和回收可发酵糖类。

根据本发明的废纤维素生物质可以源自卫生产品，例如一次性婴儿尿布、成人失禁垫、女性卫生产品、婴儿床衬垫、一般卫生和个人护理用吸收性材料、以及卫生纸。这样的生物质可以为后工业和/或消费后的，并且在后者的情况下来自废物或污水处理厂的分捡。

以上列举的卫生产品通常包含纤维素级分(例如，从不同的植物生物质中获得的纤维素纤维，例如通过牛皮纸浆制法(Kraft process))并且可以包含超吸收性聚合物以及通常由非织造织物或塑料膜组成的外层覆盖物。尽管这些产品在使用之后通常被送至垃圾填埋场或被焚烧，但近年来已经开发了用于回收和再循环其构成材料的方法。为了能够重复使用这些产品，需要用于分离其主要组分-塑料、吸收性卫生产品废纤维素(AHPwc)和超吸收性聚合物(SAP)的方法。例如，FaterSMART公司已经开发了用于分离这些组分的方法，所述方法在专利申请WO 2017/015242中进行了描述。该方法包括使用高压釜和干燥器对个人吸收性产品进行处理以对材料进行灭菌、预分离和干燥，消除不愉快的气味和潜在的病原体，然后分离和回收纤维素级分、塑料和超吸收性聚合物的阶段。

污水处理厂处理城市或工业来源的废水。该废水可能包含纤维素生物质(成为待燃烧或送至垃圾填埋场的废物的组分)。这些组分，如果从废水中有效地分离并进行处理，可以在其他过程中重复使用，例如作为可发酵糖的可再生来源。例如，KNN Cellulose公司已经开发了用于从废水处理污泥中回收纤维素级分的

纤维素生物质通常包含富含多糖(例如半纤维素和纤维素)的纤维素级分，所述多糖由具有5和6个碳原子的糖单元(称为C5-C6糖)组成，所述纤维素级分为可发酵糖的重要可再生来源。然而，由于纤维素级分的复杂结构，必须将其结构组分(纤维素、半纤维素和木质素)之间的化学键破坏以促进多糖酶水解为简单的糖。因此，预处理通常用于破坏木质素和半纤维素的外部结构，降低纤维素的结晶度和聚合度，并允许水解酶进入纤维素。

这样的预处理本质上可以为物理、化学和/或生物的。

专利EP 2 828 392描述了用于由油性草本植物生产糖的方法，所述方法包括对木质纤维素生物质进行碱性预处理以除去木质素、乙酸盐、可提取物和灰分，并允许回收半纤维素和纤维素，避免形成降解副产物，例如糠醛、HMF及其衍生物。

专利申请US 2010/0112242描述了用于使用植物和动物来源的生物质以及城市废物来生产生物燃料的方法。这样的生物质经历选自辐射、超声处理、热解和氧化的处理以改变其分子结构并获得糖。

专利申请WO 2017/015242描述了用于通过用高温和高压处理对消费后的纤维素生物质进行解构的方法。在处理之后，纤维素级分被直接糖化，产生被微生物用作用于生物燃料生产的碳源的糖。

然而，从废纤维素生物质中获得可发酵C5-C6糖是困难的，不仅因为纤维素的结构复杂，而且因为杂质的存在，例如在与纤维素级分未完全分离时的超吸收性聚合物和/或与纤维素生物质本身的利用有关的任何有机和/或无机残余物。

这些杂质可能降低参与糖化的酶的活性，影响用于纯化所获得的糖溶液的过程，抑制微生物的生长，并且干扰发酵过程和通过发酵过程产生的化合物的纯化。

为了促进来自卫生产品的纤维素生物质的糖化反应，例如，必须除去或适当地处理存在的超吸收性聚合物(称为SAP)以降低其吸收能力。事实上，超吸收性聚合物的存在可能在预处理和/或后续的酶糖化期间导致非常粘稠的悬浮体或混合物，所述悬浮体或混合物难以混合和转移。其还可能影响糖化过程中使用的酶的催化活性和/或参与任何下游发酵过程的微生物(如果有的话)。然而，将超吸收性聚合物与纤维素级分分离是困难的并且通常不是完全的。

有机和/或无机残余物的存在也可能使废纤维素生物质的酶糖化和发酵过程中获得的糖的后续使用二者变得困难，因为这些残余物干扰酶催化反应以及通过抑制微生物生长和发酵过程干扰微生物代谢。

例如，专利JP5875922B2描述了用于从一次性尿布中获得糖的方法，其中将氯化钙添加至通过生物质的酶糖化获得的糖溶液中以除去超吸收性聚合物。由于氯化钙在糖化期间或糖化之后添加，因此超吸收性聚合物存在于糖化反应器中，并且除了通过吸收水和增加反应器体积而降低反应器容量之外，还干扰酶活性并影响糖化效率。此外，使用高浓度的盐可能导致糖化期间酶的失活或损害用于发酵的微生物的生存能力。

本发明使得可以克服上述问题。事实上，已经发现通过使废纤维素生物质经受特定的碱性预处理，可以减少杂质的存在并获得适用于发酵过程的C5-C6糖。事实上，根据本发明的方法不仅使得可以使纤维素级分解构以使其更容易能够被酶攻击，而且可以除去抑制用于发酵过程的微生物的代谢的杂质。

因此，本发明的目的是提供用于由包含杂质的废纤维素生物质生产C5-C6糖的方法，所述方法包括以下步骤：

(a)使所述生物质与pH>12，优选地≥13的碱性水溶液在60℃至120℃的温度下接触，从而产生包含相对于溶液的总重量的至少5重量％的所述纤维素生物质的混合物；

(b)将所述混合物分离成固体级分和液体级分，所述固体级分包含纤维素；

(c)用水使固体级分经受一次或更多次洗涤；

(d)使由步骤(c)产生的固体级分经受水解处理，产生包含C5-C6糖的水解产物。

优选地，在步骤d)之后，所述方法包括从所述水解产物中分离包含所述C5-C6糖的液体级分的步骤e)。

在本发明的含义中，废纤维素生物质意指植物来源的有机级分，主要包含从后工业和/或消费后的废物中分离的纤维素(称为纤维素级分)。在纤维素级分源自消费后生物质的情况下，其优选经历消毒过程以在被进给到本发明方法之前消除任何存在的病原体。

根据一个优选方面，根据本发明的废纤维素生物质源自消费后生物质并且来源于例如废物分拣厂或污水处理厂。

根据一个方面，废纤维素生物质源自卫生产品并且可能包含超吸收性聚合物。

根据一个方面，废纤维素生物质来源于污水或废水处理厂。

相对于生物质的干重，废纤维素生物质包含20重量％，优选地40重量％至99重量％的纤维素。纤维素含量优选超过50重量％，更优选地超过55重量％，并且甚至更优选地为60重量％或更大。

废纤维素生物质中的纤维素通常以绒毛的形式存在，并且具有使其区别于其他产品(例如，纸)中使用的纤维素的分子量、结构和聚合度。作为废纤维素生物质可能已经经受的处理(例如，其他组分的分离、灭菌等)的结果，这些特性可能改变。

相对于生物质的干重，废纤维素生物质可以包含0重量％至30重量％，优选地0重量％至20重量％，甚至更优选地0重量％至10重量％的半纤维素。

相对于生物质的干重，废纤维素生物质可以以不超过15重量％，优选地不超过10重量％，甚至更优选地不超过5重量％的量包含木质素。有利地，相对于生物质的干重，木质素含量小于2重量％。根据一个方面，废纤维素生物质不包含木质素。

生物质的干重(也称为干物质或干残余物)意指生物质在除去其包含的水之后的剩余部分的重量；其可以例如根据ASTM E1756-08来确定。

根据本发明的废纤维素生物质包含杂质。

在本发明的含义中，杂质意指废纤维素生物质的除多糖(即，纤维素和半纤维素)之外的组分并且相对于生物质的干重，小于或等于50重量％，例如1重量％至50重量％。优选地，相对于生物质的干重，这样的杂质小于或等于40重量％，更优选地小于或等于30重量％，更优选地小于或等于20重量％，并且甚至更优选地小于或等于10重量％。

例如，使用由国家可再生能源实验室的分析程序实验室(LAP)开发的方法(Sluiter,A.；Ruiz,R.；Scarlata,C.；Sluiter,J.；Templeton,D.；Crocker,D:"Determination of Structural Carbohydrates and Lignin in Biomass."技术报告NREL/TP-510-42618,2012)，使用加热油浴代替高压釜进行修改(在第10.1.8节中提供)来确定多糖含量。使用具有安培检测器的离子色谱仪确定所获得的单糖。

因此，可以通过从生物质的干重中减去多糖含量来确定杂质含量。

还可以例如使用由国家可再生能源实验室的分析程序实验室(LAP)开发的方案(Sluiter,A.；Ruiz,R.；Scarlata,C.；Sluiter,J.；Templeton,D.:"Determination ofExtractives in Biomass."技术报告NREL/TP-510-42619,2005)，使用自动提取程序或经由索氏，通过两步提取过程以除去水可溶和乙醇可溶的化合物来量化杂质。

废纤维素生物质的除多糖之外的组分(例如SAP和/或有机污染物和/或无机污染物)可能使得难以获得可发酵C5-C6糖，降低参与糖化的酶的活性，影响用于纯化所获得的糖溶液的过程，并且干扰微生物的代谢(例如，通过抑制其生长和/或发酵过程)和用于纯化所产生的化合物的过程。

在一个方面中，废纤维素生物质包含杂质，所述杂质包括超吸收性聚合物。当存在时，相对于生物质的干重，超吸收性聚合物含量为例如1重量％至35重量％。优选地，相对于生物质的干重，超吸收性聚合物含量小于或等于35重量％，更优选地小于或等于30重量％，更优选地小于或等于20重量％并且甚至更优选地小于或等于6重量％。

在本发明的含义中，超吸收性聚合物意指能够吸收其重量的400倍至1000倍的水并且甚至在经受压力时也保留水的交联聚合物。超吸收性聚合物可以由合成单体(例如，丙烯酸、丙烯酰胺、甲基丙烯酸等)、天然单体(例如，多肽和多糖)或其组合构成。迄今为止，所使用的大多数SAP均为合成来源，并且最常使用的单体为丙烯酸酯或丙烯酰胺。在超吸收性聚合物中，聚丙烯酸酯是卫生产品的生产中最常用的之一。

超吸收性聚合物含量可以通过测量其能够吸收的水的量来确定。

废纤维素生物质可能包含含有有机污染物的杂质。当存在时，相对于纤维素生物质的干重，有机污染物可以为0.1重量％至40重量％，优选地0.1重量％至30重量％，甚至更优选地0.1重量％至20重量％。有机污染物的实例为有机酸、用于洗涤剂和化妆品的生物活性分子、蛋白质、脂肪酸、药物及其衍生物、氮化合物等。

废纤维素生物质可能包含含有无机污染物的杂质。当存在时，相对于纤维素生物质的干重，无机污染物可以为0.1重量％至40重量％，优选地0.1重量％至30重量％，甚至更优选地0.1重量％至20重量％。废纤维素生物质的无机污染物可以包含一种或更多种无机盐和金属，例如铁、锰、磷、锌、铝、铬、镍、铅、锑、镉、铜。

根据本发明的一个方面，起始废纤维素生物质包含杂质，所述杂质包含相对于纤维素生物质的干重的至少0.35重量％，例如0.35重量％至3.5重量％的总氮，和/或相对于纤维素生物质的干重，量为500mg/Kg或以上，优选地750mg/Kg或以上，并且更优选地1000mg/Kg或以上的磷。

根据本发明的方法可以包括通过本领域技术人员已知的技术对从步骤e)获得的C5-C6糖进行纯化和/或浓缩的后续任选步骤。优选地，所述步骤包括选自吸附、渗析、反渗透、结晶、色谱法、蒸发或蒸馏中的一种或更多种操作。

根据一个优选方面，对从步骤e)获得的C5-C6糖进行浓缩。

通过该方法获得的C5-C6糖特别适合用作用于生产化学中间体和聚羟基链烷酸酯的发酵过程中的碳源，并且在发酵之后需要用于分离和纯化产物的简化操作。

因此，根据本发明的方法包括在包含在步骤d)中水解的C5-C6糖的碳源的存在下使能够产生化学中间体和/或聚羟基链烷酸酯的微生物菌株生长的任选步骤。该生长步骤优选地前面是分离步骤e)并且任选地是上述纯化和/或浓缩步骤。

这些化学中间体有利地选自：二醇(优选地1,4-丁二醇)、单醇、羟基酸、二酸、氨基酸和二胺。

根据一个优选实施方案，根据本发明的方法包括在包含或有利地包含在步骤d)中水解的C5-C6糖的碳源的存在下使能够产生1,4-丁二醇的微生物菌株生长的任选步骤。该生长步骤优选地前面是分离步骤e)并且任选地是上述纯化和/或浓缩步骤。

根据一个替代实施方案，根据本发明的方法包括在包含在步骤d)中水解的C5-C6糖的碳源的存在下使能够产生聚羟基链烷酸酯的微生物菌株生长的任选步骤。所述生长步骤可以前面是分离步骤e)并且任选地是上述纯化和/或浓缩步骤。

根据一个替代实施方案，根据本发明的方法包括在包含在步骤d)中水解的C5-C6糖的碳源的存在下使能够产生二酸的微生物菌株生长的任选步骤。该生长步骤优选地前面是分离步骤e)并且任选地是上述纯化和/或浓缩步骤。

因此，本发明涉及用于从包含杂质的废纤维素生物质中获得化学中间体和/或聚羟基链烷酸酯的方法，所述方法包括以下步骤：

(a)使所述生物质与pH>12，优选地≥13的碱性水溶液在60℃至120℃的温度下接触，从而产生包含相对于溶液的总重量的按干重计至少5％的所述纤维素生物质的混合物；

(b)将所述混合物分离成固体级分和液体级分，所述固体级分包含纤维素；

(c)用水使固体级分经受一次或更多次洗涤；

(d)使由步骤(c)产生的固体级分经受水解处理，产生包含C5-C6糖的水解产物；

(e)优选地，从所述水解产物中分离包含所述C5-C6糖的液体级分；

(f)任选地通过以下操作中的一者或更多者对所述C5-C6糖进行纯化和/或浓缩：吸附、渗析、反渗透、结晶、色谱法、蒸发或蒸馏；

(g)在由所述C5-C6糖组成的碳源的存在下使能够产生化学中间体和/或聚羟基链烷酸酯的微生物菌株生长。

在步骤a)之前，根据本发明的方法可以前面是废纤维素生物质的机械粉碎处理。优选地，将生物质减小至小于2cm，优选地小于1cm的尺寸，例如通过机械处理例如研磨、切割、压碎、切碎或其组合。可以通过使用研磨机或能够减小这样的生物质的尺寸的任何装置来进行处理。

现在将更详细地描述根据本发明的方法。

图1示出了根据本发明的方法的流程图。

在所述方法的步骤a)中，使包含杂质的废纤维素生物质与pH>12，优选地≥13，更优选地≥13.3的碱性水溶液接触，从而产生包含相对于生物质的总干重的至少5重量％，优选地至少7.5重量％，甚至更优选地至少10重量％的所述纤维素生物质的混合物。

水溶液的碱性pH可以通过添加碱例如NaOH、LiOH、KOH、Mg(OH)

使纤维素生物质与所述碱性水溶液接触30分钟至24小时，优选地1小时至10小时，甚至更优选地2小时至5小时。

在步骤a)之前或之后，可以使纤维素生物质与氧化剂接触。使用这样的氧化剂使得可以降低生物质中存在的任何有机污染物(例如药物)的含量。

在一个优选实施方案中，氧化剂为过氧化氢，相对于步骤a)中使用的水的重量，所述氧化剂的浓度为0重量％至3重量％。

步骤a)优选在温和搅拌或剧烈搅拌的条件下进行以获得均质组成的混合物。

在步骤a)结束时，在将混合物适当冷却之后，可以通过添加酸例如H

然后使步骤a)中获得的混合物经受分离成步骤b)中的液体级分和包含纤维素的固体级分。

这样的分离包括选自压制、倾析、沉降、离心、过滤以及用于分离固体和液体的任何其他合适技术、及其组合中的一种或更多种操作。

优选地，将混合物传送至装置，在所述装置中其经历压缩以及分离成液体级分和包含纤维素的固体级分的过程(步骤b)。

尽管如此，进给至步骤b)的材料必须包含至少5重量％或以上，优选地至少7.5重量％或以上，甚至更优选地至少10重量％或以上的量的固体。

可以用于步骤b)的通过压缩来分离固体级分和液体级分的装置可以为倾析器、沉降器、压滤机、带式过滤器、离心机、过滤器或通常用于纤维材料的固-液分离的任何系统。

在根据本发明的方法的一个优选实施方案中，首先使用带式过滤器将混合物离心或过滤，其中初步分离固体级分和液体级分。可以例如通过过滤(例如，微滤)对所获得的液体级分进行再次处理，以回收富含纤维素和半纤维素的另外的固体级分。

分离步骤b)产生液体级分以及主要包含纤维素和半纤维素的固体级分。

在步骤b)结束时获得的固体级分的水含量有利地低于60重量％。

在步骤c)中用水或微酸性水溶液使步骤b)结束时的固体级分经受一次或更多次洗涤。优选地，用水进行洗涤。洗涤由向固体级分中添加水并随后再次分离固体级分和液体级分组成。

保持固体级分搅拌，可以用水和/或酸性水(pH低于7，优选地低于6)在10℃至100℃，优选地20℃至90℃，甚至更优选地40℃至60℃的温度下进行洗涤。

洗涤可以有利地反向进行。

通过洗涤步骤，固体级分的pH降低至低于13，优选地低于10，更优选地低于8的值。本领域技术人员将能够估计实现该pH降低所需的水的量。或者，可以进行洗涤直至离开洗涤的液体级分的电导率值与用于进行洗涤的水的电导率值相当。

例如，对于每克干固体级分可以使用30ml至100ml水。

在一个有利的方面中，在洗涤过程结束时和洗涤过程之间，如果存在两次或更多次洗涤，则使用与步骤b)中相同的装置将固体级分与液体级分分离。

洗涤的总数量、每次洗涤的持续时间和每次洗涤所使用的水的体积没有特别限制。

有利地，通过根据本发明的方法的步骤a)、b)和c)降低固体级分的杂质和总氮含量。

在步骤c)结束时获得的固体级分富含多糖(即，纤维素和半纤维素)并且具有相对于固体级分的干重的小于或等于30重量％，优选地小于或等于25重量％，更优选地小于或等于15重量％，并且甚至更优选地小于或等于10重量％的杂质含量(例如SAP以及/或者有机和/或无机污染物)。

有利地，通过本发明方法，在步骤c)结束时获得的固体级分的总灰分含量比初始废生物质中的含量低至少50％。特别地，铝、锑、铁、锰、钼、铅和铜的含量可以有利地降低30％或更多。在这些元素中，通常存在于来自卫生产品或来自废水处理厂的纤维素生物质废物中的诸如铝、锑和铅的一些元素对于酶水解反应和用生物体的发酵过程二者均是不期望的，因此它们的除去使本发明的方法特别可用于生产可发酵糖。根据本发明的一个方面，从包含含有相对于纤维素生物质的干重的至少0.35重量％，例如0.35重量％至3.5重量％的总氮的杂质的废纤维素生物质开始，本发明方法有利地使得可以在步骤c)结束时获得相对于固体级分的干重，总氮含量小于0.35重量％，优选地小于或等于0.2重量％，甚至更优选地小于或等于0.1重量％的固体级分。步骤c)结束时的固体级分的总氮含量有利地降低40重量％或更多，50重量％或更多，优选地70重量％或更多并且甚至更优选地80重量％或更多。总氮含量可以例如使用标准EN15407:2011来确定。

根据另一个方面，当相对于纤维素生物质的干重，从包含含有≥1000mg/Kg磷的杂质的废纤维素生物质开始时，在步骤c)结束时的固体级分的磷含量相对于其干重有利地为≤500mg/Kg。

因此该方法具有允许从废生物质中除去并可以回收源自人类活动的诸如氮和磷的元素的另外优点。

可以使该固体级分任选地经受随后的化学/物理或生物处理，例如经受分离半纤维素组分和纤维素组分。

使步骤c)结束时获得的固体级分经受糖化处理以获得方法的步骤d)中的单糖C5-C6。该处理可以为酶类型、化学类型或物理类型或者这些的组合。

在根据本发明的方法中，酶处理为优选的并且使用能够将多糖分解成单糖的水解酶或其混合物来进行。

酶水解步骤d)可以有利地通过将包含所述酶和固体级分的溶液进给到配备有搅拌的反应器中来进行，其中固体级分的浓度为5重量％至30重量％，优选为10重量％至25重量％。

糖化可以通过连续过程，或者替代地，通过将固体级分与所述酶在间歇反应器中混合来进行。

糖化条件(反应介质、pH、温度、持续时间等)取决于所使用的酶混合物，特别是纤维素酶和半纤维素酶的存在。通常需要添加缓冲液(例如基于磷酸盐的)以保持最佳pH。

在本发明的始于废纤维素生物质的方法中，酶水解步骤d)可以出乎意料地在无需添加任何缓冲液的情况下通过在反应介质中仅控制添加酸/碱而保持pH值恒定来进行。因此，反应成本和任何相关废物的处理成本二者均降低。此外，在不添加盐的情况下操作的可能性有助于保持低电导率并减少对发酵过程和下游的影响。

用于本发明的纤维素酶和半纤维素酶可以为分别具有纤维素酶活性或半纤维素酶活性的任何酶。纤维素酶和半纤维素酶可以为包含一种或更多种纤维素酶、一种或更多种半纤维素酶或者其混合物的酶混合物(cocktail)的一部分。合适的酶混合物是可商购获得的，例如CTec2和HTec2(Novozymes)、Viscamyl Flow(Genencor,DuPont)和Cellulase8000L(Enzyme Supplies)。

酶处理可以在能够抵制消耗糖含量的微生物的不希望的生长的一种或更多种抑菌剂和/或杀菌剂(例如抗生素、短链脂肪酸例如壬酸、对羟基苯甲酸酯等)的存在下进行。

水解也可以化学地和/或物理地实现，例如使用无机酸(如HCl和H

水解产物在步骤d)结束时获得，并且这优选经历分离固体级分和包含C5-C6糖的液体级分(称为糖溶液)的步骤e)。

分离可以通过利用固相和液相的不同特性(例如存在的颗粒的密度和尺寸)来进行，并且包括以下操作中的一者或更多者：压制、倾析、沉降、离心、过滤和用于固液分离的任何其他合适的技术及其组合。

设备类型、其组合及其操作模式的选择取决于待分离的水解产物的量、类型和期望的品质。

分离操作可以例如通过使用离心机或倾析器或沉降器利用固体级分和液体级分的不同密度来进行。

在根据本发明的方法的一个优选的实施方案中，通过至少一次过滤操作，优选超滤来分离从步骤d)中获得的C5-C6糖。

过滤操作包括微滤和/或超滤和/或纳滤。

根据一个方面，通过离心、微滤和超滤来分离从步骤d)中获得的C5-C6糖。

根据一个替代方面，通过微滤和超滤来分离从步骤d)中获得的C5-C6糖。

根据另一个替代方面，通过离心或倾析和超滤来分离从步骤d)中获得的C5-C6糖。

超滤后可以任选地是一次或更多次渗滤操作。

超滤后可以任选地是一次或更多次纳滤操作。

微滤可以例如使用0.1μm聚砜膜来进行。

纳滤可以例如使用具有250KDa至300KDa的孔的由聚酰胺制成的膜来进行。

使用配备有半透膜的任何过滤器单元(例如管状类型、中空纤维类型、螺旋类型、板框类型)并且利用与膜的表面相切或垂直的流来工作的任何超滤技术都可以用于超滤。关于过滤膜，可以使用由醋酸纤维素、醋酸纤维素衍生物(例如醋酸丁酸纤维素)、和合成聚合物(例如聚丙烯、聚酰胺、聚酰亚胺、PVDF(聚偏二氟乙烯)、PAN(聚丙烯腈)、PES(聚醚砜)和陶瓷制成的半透膜。优选地，使用孔隙度为10KDa或更小的半渗透聚醚砜膜。

温度、跨膜压力和进行超滤阶段的其他操作条件的选择将主要由水性混合物进料的粘度以及所使用的膜的类型和孔隙度决定。

随着超滤进行，水性混合物的粘度和跨膜压力自然地趋向于增加，以及分离效率趋向于降低。这需要使用逐渐增加的压力，如果压力太高，则可能损坏过滤器单元并损害过程效率。为了避免使用过高的压力，可以借助于所谓的渗滤，即进给恢复溶液的一个或更多个等分试样，所述恢复溶液补偿已经渗透通过膜的水性混合物的部分。渗滤可以连续或不连续地进行。

根据本发明的方法可以包括通过选自吸附、渗析、反渗透、结晶、色谱法、蒸发或蒸馏中的一种或更多种操作对从步骤e)中获得的C5-C6糖进行纯化和/或浓缩的随后的任选步骤。

设备的类型、其组合及其操作模式的选择将取决于待纯化和/或浓缩的水解产物的量和类型、以及期望的品质。

可以任选地对步骤e)结束时获得的液体级分进行浓缩以减小在随后发酵过程期间的操作体积。

浓缩可以通过已知的技术进行，例如通过蒸馏、蒸发或反渗透，直到获得C5-C6糖浓度为20重量％至80重量％，优选地40重量％至80重量％的糖浆。优选不需要过高温度的操作以避免形成可能对发酵中使用的微生物具有抑制效果的降解副产物。

相对于所述糖溶液的干重，包含在根据本发明的方法的步骤e)之后获得的C5-C6糖的糖溶液的杂质含量小于45重量％，优选地小于35重量％，更优选地小于25重量％，甚至更优选地小于15重量％，这使得其特别适合于在发酵过程中使用。该杂质含量实际上不干扰微生物代谢。

糖溶液中的杂质含量通过从糖溶液的干重中减去糖含量来计算。

在第二方面中，因此本发明涉及由废纤维素生物质获得的C5-C6糖的组合物，相对于组合物的干重，所述废纤维素生物质的杂质含量小于45重量％，优选地小于35重量％，更优选地小于25重量％，甚至更优选地小于15重量％。

根据本发明的一个方面，相对于C5-C6糖组合物的干重，C5-C6糖的所述组合物的总氮含量为0.0重量％至0.5重量％，优选为0.1重量％至0.5重量％，更优选为0.3重量％至0.5重量％。

根据本发明的另一个方面，相对于C5-C6糖组合物的干重，C5-C6糖的所述组合物的磷含量为0.0重量％至2.5重量％，优选为0.25重量％至2.5重量％，更优选为1.25重量％至2.5重量％。

根据一个优选的方面，相对于C5-C6糖组合物的干重，C5-C6糖的所述组合物具有0.0重量％至0.5重量％的总氮含量和0.0重量％至2.5重量％的磷含量。

因此所述组合物的C5-C6糖可以被生物化学转化(例如通过细菌、古生菌或酵母发酵)以获得聚羟基链烷酸酯和化学中间体，例如二醇(优选1,4-丁二醇)、单醇、羟基酸、二酸和氨基酸。

所述聚羟基链烷酸酯(PHA)优选地选自：聚羟基丁酸酯、聚羟基丁酸酯-戊酸酯、聚羟基丁酸酯-丙酸酯、聚羟基丁酸酯-己酸酯、聚羟基丁酸酯-癸酸酯、聚羟基丁酸酯-十二烷酸酯、聚羟基丁酸酯-十六烷酸酯、聚羟基丁酸酯-十八烷酸酯、聚3-羟基丁酸酯-4-羟基丁酸酯。更优选地，所述聚羟基链烷酸酯选自聚羟基丁酸酯(PHB)、聚羟基丁酸酯-戊酸酯(PHBV)和聚羟基丁酸酯-己酸酯(PHBH)。

这些化学中间体优选地选自：二醇例如1,2-乙二醇、1,2-丙二醇、1,3-丙二醇、1,3-丁二醇、2,3-丁二醇、1,4-丁二醇；单醇例如丁醇和乙醇；羟基酸例如乳酸；二酸(DCA)，例如琥珀酸、戊二酸、己二酸、粘康酸、壬二酸、癸二酸、十一烷二酸、十二烷二酸、十三烷二酸、十六烷二酸、十八烷二酸、十八烯二酸、十八碳二烯酸、十八碳三烯酸、二十烷二酸、二十二烷二酸和呋喃二甲酸；氨基酸例如丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、半胱氨酸、甘氨酸、谷氨酰胺、组氨酸、甲硫氨酸、脯氨酸、酪氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、天冬氨酸和谷氨酸、赖氨酸、苏氨酸、丝氨酸、色氨酸和苯丙氨酸。

用于生产聚羟基链烷酸酯的生物化学转化的实例是由属于芽孢杆菌(Bacillus)属、红球菌(Rhodococcu)属、假单胞菌(Pseudomonas)属、罗尔斯顿菌(Ralstonia)属、海富盐菌(Haloferax)属、贪铜菌(Cupriavidus)属、原单胞菌(Protomonas)属、产碱杆菌(Alcaligenes)属、埃希菌(Escherichia)属和明串珠菌(Leuconostoc)属的细菌进行的发酵。

为了生产PHA，可以首先使细菌培养物在合适的培养基中生长以促进细胞生物量的产生，然后可以改变生长条件以诱导细胞内内含物形式的PHA的合成和积累。PHA的合成通常通过使微生物经受缺乏大量营养素(例如磷、氮和硫)并同时经受过量的碳源来诱导。

用于生产化学中间体的生物化学转化的实例是通过细菌(例如大肠杆菌(E.coli))或产油酵母(例如属于耶氏酵母(Yarrowia)属、假丝酵母(Candida)属、红酵母(Rhodotorula)属、红冬孢酵母(Rhodosporidium)属、隐球酵母(Cryptococcus)属、丝孢酵母(Trichosporon)属和油脂酵母(Lipomyces)属的那些)的发酵。特别优选属于耶氏酵母属和假丝酵母属的酵母。

例如，C5-C6糖的混合物可以通过在专利WO 2015/158716中描述的方法中的转基因大肠杆菌用来获得1,4-丁二醇(1,4-BDO)。

1,4-BDO可以在具有至少一种用于合成1,4-BDO的代谢途径的一种或更多种微生物的存在下通过发酵过程由包含至少一种糖，优选葡萄糖和任选地除葡萄糖之外的一种或更多种糖的培养基获得。

供应至用于产生1,4-BDO的微生物的糖可以为源自废纤维素生物质或其混合物与第一代糖的糖化的C5-C6糖，其特征在于高纯度水平。在混合物的情况下，相对于总的糖，这些可以包含1重量％至99重量％，优选地15重量％至65重量％的源自废纤维素生物质的糖化的糖。

培养基可以包含在发酵阶段期间用于微生物的生长和维持所必需的其他物质，例如诸如C、H、O、N、K、S、P、Fe、Ca、Co、Mn、Mg的元素。通常，培养基可以包含选自以下的一种或更多种组分：除葡萄糖之外的糖、蛋白质水解产物、蛋白质、氨基酸、有机酸、维生素、矿物盐、酵母提取物和微量元素例如钴、钙和铜。钴、钙和铜可以例如作为诸如氯化钴、氯化钙和氯化铜的盐投加到培养基中。通常，培养基以10g/L至100g/L的浓度包含至少一种糖，通常为葡萄糖和任选地除葡萄糖之外的一种或更多种糖。由于在本方法的发酵阶段期间，微生物消耗一种或更多种糖，因此通常需要将这些糖重新引入到发酵反应器中。根据本领域技术人员已知的方法，这种重新引入可以以连续或不连续的方式进行。

为了限制未使用的糖的含量并因此优化过程的经济性，在发酵结束之前有利地中断或逐渐减少一种或更多种糖的供应。至于培养基的其他组分，培养基通常包含盐、必需矿物质和消泡剂。培养基可以以本领域技术人员已知的任何方式制备，例如通过将所有组分混合在一起或者通过预混合除葡萄糖之外的所有组分并稍后单独地或者已经预混合添加它们来制备。也可以使用市售培养基作为起点并在稍后阶段例如当使培养基与具有至少一种用于由可再生资源合成1,4-BDO的代谢途径的微生物接触时适当地改变其组成。在发酵期间，将包含微生物和含有一种或更多种糖的培养基的组合保持在适合利用由可再生资源合成1,4-BDO的代谢途径的条件下。此外，本领域技术人员将能够在发酵期间检查过程的进展，例如通过检查一个或更多个参数并且可以对其采取行动以使过程回到适合生产1,4-BDO的条件。

C5-C6糖的混合物也可以通过属于假丝酵母属的产油酵母用来获得二酸。

二酸可以通过两步发酵(即具有生物质细胞生长步骤和随后的生产步骤)产生。在最初的生长步骤中，细胞使用培养基中存在的作为其唯一碳源的糖来生长。随后的DCA产生步骤优选为旨在在脂肪酸转化成DCA时保持细胞生物量活性和催化活性的分批进料过程。有利地，该步骤具有双重进料：保持细胞活性的糖和用于生物转化的单羧酸或单羧酸甘油酯的来源。

通过根据本发明的方法获得的C5-C6糖还可以通过化学手段经历转化以产生化学中间体。化学转化的实例为葡萄糖异构化为果糖，并随后在酸性环境中脱水以获得HMF，HMF进而可以被氧化以获得呋喃二甲酸及其衍生物。

可以通过经由根据本发明的方法引起的糖转化而获得的化学中间体例如丁二醇、琥珀酸、己二酸、粘康酸、呋喃二甲酸、对苯二甲酸、乙酰丙酸、乳酸和聚羟基链烷酸酯可用作用于合成聚合物，特别是聚酯的单体。

现在将根据非限制性实施例描述根据本发明的方法。

实施例

实施例1

步骤a)

相对于生物质的干重，用于该实施例的来自成人吸收性产品的纤维素生物质具有10.45％的含水量、27.4重量％的杂质含量、和0.56重量％的总氮。杂质含量根据如以上报道的技术报告NREL/TP-510-42618,2012通过从生物质的干重中减去多糖含量来确定。

将6.7kg这样的生物质(最终浓度为10％)和59.3升碱性水溶液添加到配备有具有交替叶片的机械搅拌器、温度控制系统、pH计和滴液漏斗的圆柱形反应器中，产生pH为13.3的混合物。然后将所得混合物通过加热油夹套加热至90℃的温度并在温和搅拌下保持4小时。

步骤b)

将在步骤a)结束时获得的混合物通过离心滤袋分离，从而产生10kg包含纤维素的固体级分和56升液体级分。

步骤c)

将来自步骤b)的包含纤维素的固体级分在20℃的温度下用330升水连续洗涤直到达到约8的pH。

在步骤c)结束时，相对于固体级分的干重，固体级分具有5重量％的杂质含量和0.28重量％的总氮含量。

步骤d)

使来自步骤c)的固体级分经历酶水解处理。

将3.6kg干固体级分添加至配备有具有交替叶片的机械搅拌器、温度控制系统和pH控制系统的圆柱形反应器中的23.3升的50mM在pH 5下的磷酸盐缓冲液中，并且添加569ml Viscamyl

步骤e)

在水解反应完成后，将水解产物离心，通过具有高至25微米的网孔尺寸的筛进行过滤，并使用具有10kDa孔的再生纤维素膜进行切向超滤，产生溶液中的葡萄糖浓度为55g/L(通过离子色谱法确定)的液体级分(糖溶液)。

在步骤e)结束时，相对于液体级分的干重，液体级分的C5-C6糖含量等于76.66重量％。相对于液体级分的干重，通过从液体级分的干重中减去步骤d)的葡萄糖、木糖、低聚糖和添加剂的含量而获得的杂质的含量等于15.93重量％。

糖含量使用配备有安培检测器并且装有Metrosep Carb 2 250mm×4.0mm×5μm柱和Metrosep Carb 2Guard/4.0前置柱的Metrohm Professional IC Vario 940离子色谱仪使用以下操作条件来分析：

流量：0.7mL/分钟

烘箱温度：30℃

检测器温度：35℃

洗脱剂：40mM NaOH+40mM NaOAc。

实施例2

使用旋转蒸发器在50℃下在真空下将步骤e)结束时获得的液体级分浓缩，产生溶液中的葡萄糖浓度为484.4g/L(通过液相色谱法确定)的糖浆。

将获得的糖浆在发酵过程中用作碳源来生产1,4-BDO。

将具有用于合成1,4-BDO的代谢途径的大肠杆菌菌株接种到包含50ml第一培养基(10g/l来自酪蛋白Sigma的胰蛋白胨酶消化物、5g/l酵母提取物Sigma、0.5g/l NaCl、10g/l葡萄糖)的250ml锥形烧瓶中。然后将该烧瓶在35℃的温度下以275rpm摇动过夜，产生预接种物。

随后，将预接种物的等分试样转移至包含200ml第二培养基(12.78g/L M9Minimal Salt Teknova；10g/L第一代葡萄糖；1ml/L 1M MgSO

将锥形烧瓶在35℃下培养，以275rpm摇动内容物约8小时。在该培养期之后，光密度达到约3OD至4OD的OD值(在600nm处测量的光密度)，并且将培养物用于接种种子发酵器。

在达到适当的细胞生物量之后，将种子发酵的等分试样用于在OD 4下接种包含1升培养基(1.73g/L KH

将来自实施例1的经纯化并浓缩的糖以分批进料方法逐渐进给到发酵器中，以便保持培养基中的葡萄糖浓度恒定在30g/L至60g/L的范围内，然后逐渐减少直到获得约0g/L的在发酵结束时(在接种之后约30小时至40小时)的葡萄糖浓度。

将生物反应器保持在>700rpm的搅拌和处于0.6755Pa*m3/秒的空气流、以及优化的pH和温度条件下。

在不同时间下取反应介质的样品以通过使用离子色谱法进行分析来评估1,4-BDO的生产。

1,4-BDO含量使用配备有安培检测器并且装有Metrosep Carb 2 250mm×4.0mm×5μm柱和Metrosep Carb 2Guard/4.0前置柱的Metrohm Professional IC Vario 940离子色谱仪使用以下操作条件来确定。

流量：0.7mL/分钟

烘箱温度：30℃

检测器温度：35℃

洗脱剂：50mM NaOH+5mM NaOAc。

基于收集的数据，确定滴度和生产率(表1)，其中：

-“滴度”(g/l)：在发酵时间结束时反应介质中的1,4-BDO的加权浓度；

-“生产率”(g/l/小时)：1.4-BDO的加权平均合成率，计算为滴度/发酵小时

所获得的结果示于表1中。

实施例3

使用通过将作为碳源的25重量％的来自实施例1的葡萄糖和75重量％的第一代葡萄糖混合而制备的浓缩糖浆来进行实施例2中描述的相同发酵过程。

发酵在接种之后约40小时完成。

所获得的结果示于表1中。

比较例4

使665.7g来自成人吸收性产品的纤维素生物质(相对于生物质的干重，具有9.59％的含水量、27.4重量％的杂质含量、和0.56重量％的氮含量)直接经受酶水解而无任何另外处理。

在11.87L的50mM在pH 5下的磷酸盐缓冲液、95.1ml的Viscamyl

在水解反应完成后，将水解产物离心，通过具有高至25微米的网孔尺寸的筛进行过滤，并通过具有10kDa孔的再生纤维素膜经历切向过滤，产生溶液中的葡萄糖浓度为29.5g/L(通过离子色谱法确定)的液体级分。

使用旋转蒸发器在50℃下在真空下将所获得的液体级分浓缩，产生溶液中的葡萄糖的浓度为467.9g/L(通过离子色谱法确定)的糖浆。

使用通过将25重量％的比较例4中生产并浓缩的葡萄糖和75重量％的第一代葡萄糖混合而制备的混合物作为碳源来进行实施例2中描述的相同发酵过程。

由于微生物重要参数的急剧下降，发酵在接种之后约27小时停止。

所获得的结果示于表1中。

所获得的结果清楚地示出根据本发明的方法可以用于由适合于使用的废纤维素生物质通过能够产生1,4-丁二醇的微生物菌株获得C5-C6糖。这样的糖(单独使用(实施例2)或以与第一代糖的混合物使用(实施例3))不干扰细胞活力，并且通过其被有效地转化为1,4-丁二醇，如通过表1中所示的滴度和生产率值所证实的。

另一方面，比较例4证实，即使当与第一代糖混合时，由废纤维素生物质获得的没有经历根据本发明的方法的糖也不能用于发酵。实际上，这样的糖具有使它们对细胞活力具有强毒性的杂质含量。实际上，杂质的存在导致其重要参数急剧下降，并因此发酵在接种之后仅28小时停止。

此外，杂质的存在干扰1,4-丁二醇的生产，导致发酵参数降低。

实施例5

步骤a)

在搅拌的夹套反应器中以5.5重量/重量％的最终浓度将0.96Kg的含水量为6.69％的来自污水处理厂的升级再造的纤维素生物质(相对于生物质的干重，杂质含量为10.92％，以及总氮含量为1.14％)在15.35升的碱性溶液中稀释，最终pH为13。将所得混合物在90℃下加热并温和搅拌4小时。在过程结束时，将混合物冷却并添加1.25Kg的H

步骤b)

使用滤袋离心机将在步骤a)结束时获得的混合物过滤，获得2.6Kg的包含纤维素的固体级分和14.9升的液体级分。

步骤c)

将来自步骤b)的包含纤维素的固体级分在20℃下用47.1L水洗涤。

在步骤c)结束时，相对于干重，固体级分示出5.45重量％的杂质含量(如以上作为水提取物和乙醇提取物的总和测量的)和0.33重量％的总氮含量。

步骤d)

使来自步骤c)的经洗涤的固体级分经历酶水解处理。将0.617Kg固体级分在配备有机械搅拌器、控制温度的热夹套和pH控制系统的搅拌槽生物反应器内用5.57L去离子H

步骤e)

在水解反应完成后，将水解产物倾析以将包含糖的液体级分与未消化的固体级分分离。在使用0.1μm膜的切向流微滤以及使用5KDa聚醚砜(PES)膜的切向流超滤中过滤液体级分。使保留物经受渗滤以使糖回收最大化。

所获得的液体级分具有29.5g/L的葡萄糖浓度和3.5g/L的木糖浓度。

量化糖浓度的分析使用配备有折射率检测器(RID)Shodex并且装有PhenomenexRezex ROA-有机酸H+300mm×7.8mm柱和Phenomenex Carbo-H 4mm×3.0mm ID前置柱的HPLC Surveyor Thermo Scientific用高压液相色谱法(HPLC)使用以下操作条件来进行：

流量：0.6mL/分钟，等度(isocratic)

烘箱温度：65℃

洗脱剂：5mM硫酸。

因此步骤a)至c)的操作导致升级再造的纤维素生物质的纤维素的富集，以及随之发生的葡萄糖的更多释放。此外，相对于直接对相同起始生物质进行的相同水解反应，它们允许略微增加水解的产率。

实施例6

使用在50℃下在真空中工作的旋转蒸发器对源自实施例5步骤e的最终纯化的糖溶液进行浓缩。所获得的糖浆具有526g/L的葡萄糖浓度和62g/L的木糖浓度。

将糖浆与第1代葡萄糖混合，达到混合物(来自实施例5的30％葡萄糖和70％第一代葡萄糖)中30重量％的葡萄糖最终比率。将所获得的混合物用作碳源以根据实施例2稍作修改进给用于1,4-bioBDO生产的发酵过程。

色谱分析示出，发酵时间结束时(约35小时)产生了滴度为117g/L的1,4-BDO，并且观察到3.38g/L/小时的生产率。