一种防治小鼠艰难梭菌感染的高铁饲料及其应用

技术领域

本发明属于饲料技术领域，具体涉及一种防治小鼠艰难梭菌感染的高铁饲料及其应用。

背景技术

艰难梭菌是一种厌氧芽孢杆菌，是人类和动物抗生素相关性腹泻和结肠炎的常见原因。艰难梭菌感染是住院患者感染性腹泻和结肠炎的最常见原因，给家庭及社会都带来了极大的经济负担。近年来，不仅欧洲和北美的艰难梭菌感染发病率和严重程度急剧增加，中国艰难梭菌感染的发病率也逐年攀升。

艰难梭菌产毒株主要释放2种大蛋白外毒素，毒素A和毒素B。这两种毒素都具有细胞毒性活性。此外，毒素A可在实验动物的肠环中引起黏液分泌和炎症反应，因此也被称为肠毒素。艰难梭菌毒素是艰难梭菌致病的主要原因，可导致一系列临床疾病，如腹泻、假膜性结肠炎和中毒性巨结肠。

目前，抗生素治疗仍然是艰难梭菌感染的主要治疗方法，一线抗生素如甲硝唑、万古霉素和非达霉素广泛用于艰难梭菌的临床治疗。然而长期使用抗生素会削弱肠道微生物群的多样性，为其他病原体入侵创造了条件。因此，寻求一种安全有效的非抗生素疗法迫在眉睫。

益生菌、粪便微生物群移植、饮食、纳米颗粒和化合物都是新兴的非抗生素疗法，吸引了广泛关注。其中，关于膳食组分与感染之间的研究已屡见不鲜。铁对于真核细胞与原核细胞生长都具有重要作用，膳食铁过多对于肠道微生物群也具有一定影响。艰难梭菌感染与肠道菌群关系密切，因此，研究高浓度铁膳食对艰难梭菌感染的影响具有一定意义。

发明内容

针对现有技术中的不足之处，本发明提供一种防治小鼠艰难梭菌感染的高铁饲料及其应用。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种防治小鼠艰难梭菌感染的高铁饲料，其原料组成g/kg如下：酪蛋白200， L-胱氨酸3，玉米淀粉397.5，麦芽糊精132，蔗糖100，纤维素50，大豆油70，混合维生素10，混合矿物质35，硫酸亚铁0.4。

优选地，所述混合矿物质为不含铁的S10022G型混合矿物质，即将AIN93G标准灭菌饲料中混合矿物质的铁元素剔除，用硫酸亚铁补充铁元素。

本发明还提供上述防治艰难梭菌感染的高铁饲料在作为膳食干预小鼠艰难梭菌感染引起的肠道炎症中的应用。

有益效果：通过动物实验发现，高铁饲料可以有效抑制艰难梭菌孢子在小鼠体内的定植和萌发，缓解艰难梭菌感染导致的体重下降，腹泻和驼背等临床症状，并且增加有益化合物如牛磺熊脱氧胆酸和延龄草苷的分泌，减少炎细胞和炎性因子的产生，从而缓解艰难梭菌感染性肠炎；本发明提供了一种绿色安全且有效的艰难梭菌感染疗法，为开发艰难梭菌非抗生素疗法提供了重要的实验数据，具有良好的应用前景和巨大的潜在价值。

附图说明

图1为高铁饲料对艰难梭菌感染临床症状的影响示意图（A.艰难梭菌感染模型；B.感染48小时内各组小鼠体重变化情况；C.感染48小时内小鼠疾病活动指数变化情况。）。

图2为高铁饲料对艰难梭菌感染小鼠肠道损伤的影响示意图（A. 各组小鼠结肠长度；B.各组小鼠代表性盲结肠大观及盲肠HE染色图；200×；C.各组小鼠盲肠组织病理学评分；D.各组小鼠盲肠内容物LCN2含量。）。

图3为高铁饲料对艰难梭菌体内定植及毒素分泌的影响示意图（A.各组小鼠盲肠内容物毒素、粪便毒素含量；B.各组小鼠盲肠菌量、盲肠内容物菌量、肠系膜淋巴结菌量、脾脏菌量比较。）。

图4为高铁饲料对艰难梭菌感染肠道免疫影响示意图（A.各组小鼠结肠中性粒细胞比例；B.各组小鼠结肠巨噬细胞比例；C.各组小鼠盲肠CXCL1蛋白表达情况；D.各组小鼠盲肠IL-33蛋白表达情况；E.各组小鼠盲肠TNF-α蛋白表达情况；F.各组小鼠盲肠IL-6蛋白表达情况；G.各组小鼠盲肠IL-1β蛋白表达情况；H.各组小鼠结肠炎性因子IL-6, TNF-α,IL-33和CXCL1基因表达情况。）。

图5为高铁饲料对艰难梭菌感染小鼠肠道代谢的影响示意图（A.感染组与高铁饲料干预组KEGG代谢通路；B.感染组与高铁饲料干预组KEGG拓扑学分析气泡图；C.感染组与高铁饲料干预组差异代谢火山图；D.各组小鼠肠道延龄草苷相对丰度；E.各组小鼠肠道牛磺熊脱氧胆酸相对丰度。）。

图6为化合物牛磺熊脱氧胆酸和延龄草苷对艰难梭菌感染的缓解作用示意图（A.艰难梭菌感染后48小时内各组小鼠体重变化情况；B.艰难梭菌感染后48小时内各组小鼠疾病活动指数变化情况；C.各组小鼠盲肠内容物、盲肠及结肠菌量；D.各组小鼠代表性盲结肠大观及盲肠HE染色图，200×；E.各组小鼠结肠长度；F.各组小鼠盲肠组织病理学评分；G.各组小鼠感染48小时后中性粒细胞比例；H.各组小鼠盲肠CXCL1蛋白含量；I.各组小鼠盲肠IL-1β蛋白表达量。）。

实施方式

以下参照具体的实施例来说明本发明。本领域技术人员能够理解，这些实施例仅用于说明本发明，其不以任何方式限制本发明的范围。

实施例1高铁饲料在小鼠艰难梭菌感染中的应用

除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备均为本技术领域常规试剂、方法和设备，以下实施例所用饲料和试剂均为市购。

一、实验步骤

1. 实验饲料

本实施例中所用AIN93G标准灭菌饲料购自江苏协同生物有限公司，高铁饲料原料组成g/kg为：

酪蛋白200， L-胱氨酸3，玉米淀粉397.5，麦芽糊精132，蔗糖100，纤维素50，大豆油70，混合维生素10，混合矿物质（S10022G-铁缺乏）35及硫酸亚铁0.4。

AIN93G标准灭菌饲料原料g/kg组成为：

酪蛋白200， L-胱氨酸3，玉米淀粉397.5，麦芽糊精132，蔗糖100，纤维素50，大豆油70，混合维生素10，混合矿物质35。

2. 艰难梭菌孢子

本研究中艰难梭菌菌种ATCC43255储存在-80℃，并且在使用前复苏。将菌株接种到脑心浸液肉汤培养基（BHI）平板上，37℃厌氧培养48小时后挑单个菌落接种于5ml新鲜BHI液基中，37℃厌氧培养48小时。然后按照1:25将菌液接种于新鲜BHI液基中，37℃厌氧培养5天后，用PBS洗涤离心菌体3次，70℃灭活10min后，将孢子稀释计数后冻于-20℃直至使用。

3. 实验动物

雄性C57BL/6小鼠，6周龄，24只，无特定病原体(specific pathogen-free, SPF)，由徐州医科大学实验动物中心提供，许可证号：SCXK（苏）2020-0011。将小鼠饲养于徐州医科大学实验动物中心，动物房室温25℃，湿度40-70％，给予12h昼夜交替光源，标准实验室灭菌饲料，自由进食和饮水，实验前适应环境3天。

4. 高铁饲料干预艰难梭菌感染流程

如图1所示，将小鼠分为随机对照组(NC)、高铁饲料对照组（NC+ Iron diet）、艰难梭菌感染组(CDI)和高铁饲料干预(CDI+ Iron diet)，每组6只。其中NC组和CDI组保持AIN93G标准灭菌饲料喂养，而NC+ Iron diet 和CDI+ Iron diet小鼠的饲料更换成高铁饲料直至取材。饲料更换的第16天，开始将四组小鼠的饮用水换成混合抗生素，5天后换回无菌饮用水。混合抗生素配方分别为0.4 mg/mL卡那霉素（kanamycin），0.035 mg/mL庆大霉素（gentamicin），0.045 mg/mL 粘菌素（colistin），0.215 mg/mL 甲硝唑（metronidazole），0.045 mg/mL万古霉素（vancomycin）。第21天撤去混合抗生素的同时给小鼠腹腔注射10mg/kg克林霉素。1天后，给CDI和CDI+ Iron diet组每只小鼠灌胃5×10

5. 以下实施例中所涉及的数据处理均按以下方法统计：

采用GraphPadPrism8.0软件进行统计学分析。计量资料采用X(——)±SEM表示，两组计量资料的比较采用独立t检验；多组计量资料之间的两两比较采用单因素方差分析(ANOVA)。

二、实验结果：

1.高铁饲料对艰难梭菌感染临床症状的影响

用于评估肠炎严重程度的临床疾病活动指数评分（disease activity index,DAI）是基于体重下降百分比（0：不下降，1：1-5%，2：5-10%，3：10-15%，4：>15%）、大便稠度（0：正常，1：粪便松软，2：稀便，3：稀水便，4：黏液便）和精神状况（0：正常，1：行动较缓慢，2：行动受限，3：驼背，行动受限，4：驼背，行动迟缓甚至死亡）的综合评分。将3个结果的评分加起来，得到最终DAI评分。

从图1B-C可以看出，在艰难梭菌感染48小时内，感染组由于体重减少、驼背和腹泻，DAI增加。而高铁饲料干预组在感染后48小时内未出现艰难梭菌感染症状，说明高铁饲料能显著改善艰难梭菌感染性肠炎。

2.高铁饲料对艰难梭菌感染小鼠肠道损伤的影响

（1）结肠长度的影响

如图2A和2B所示，标准饲料感染组盲结肠明显萎缩，肠内容物较少，结肠长度相较于高铁饲料干预的小鼠显著缩短。而高铁饲料干预组，感染或不感染艰难梭菌的小鼠盲结肠都没有明显的变化。

（2）盲肠组织病理学评分

取出结肠组织置多聚甲醛固定液中固定，常规脱水、透明、浸蜡、石蜡包埋切片，采用苏木素-伊红(HE)染色进行病理学观察，并且根据炎症浸润程度(0-3)、肠上皮损伤程度(0-3)和水肿程度(0-3)对这些染色切片进行评分。

通过光镜下盲肠组织切片的HE染色，染色结果如图2B所示，未感染的NC组和NC+Iron diet组的结肠组织没有损伤和炎症的迹象；CDI组小鼠出现肠上皮丢失、隐窝结构破坏以及水肿等结肠炎症状；而CDI+ Iron diet组小鼠肠上皮损伤较轻，隐窝结构较完整，炎性细胞浸润及水肿均较轻，因此在图2C中，CDI+ Iron diet组的组织学评分更接近与NC+Iron diet和NC组，此结果表明高铁饲料改善了盲肠黏膜屏障损伤。

（3）LCN2测定

由于LCN2在一定程度上反应了肠道的损伤情况，因此我们收集了小鼠的盲肠内容物，使用ELISA试剂盒检测了小鼠LCN2蛋白表达情况。

如图2D结果显示NC+ Iron diet组和CDI+ Iron diet组小鼠的LCN2含量与NC组相似，而CDI组LCN2含量急剧增高，这与小鼠肠道损伤结果一致。此结果表明高铁饲料明显减轻了肠道炎症。

3.高铁饲料对艰难梭菌体内定植及毒素分泌的影响

在菌量测定方面，对于小鼠的盲肠，脾脏和肠系膜淋巴结，称重后加入无菌PBS匀浆，倍比稀释后使用BHI平板计数。而对于小鼠的粪便和盲肠内容物，称重后提取标本中细菌DNA，使用qPCR技术测定艰难梭菌毒素TcdB的Cq值，根据绘制的艰难梭菌菌量与毒素TcdB的Cq值的标准曲线，得到最终标本中所含的艰难梭菌含量。在毒素的检测方面，将盲肠内容物与粪便称重后加入无菌PBS匀浆，离心取上清后使用ELISA检测试剂盒测定其含量。

图3A结果显示，CDI组毒素含量较NC组显著增加，这意味着小鼠体内细菌载量较高。而图3B的结果证明了CDI组在肠内外的艰难梭菌负荷较CDI+ Iron diet组更重。因此，高铁饲料可以显著减少艰难梭菌孢子的体内定植，生长，毒素分泌及肠外播散。

4.高铁饲料对艰难梭菌感染小鼠结肠炎细胞募集的影响

收集新鲜小鼠结肠组织，提取小鼠结肠固有层单个核细胞后进行表面抗体染色，经流式细胞分析得到结肠中中性粒细胞和巨噬细胞比例。

如图4A-B所示，艰难梭菌感染后，CDI组小鼠结肠募集了大量中性粒细胞，巨噬细胞增加并不明显。在CDI+ Iron diet组，巨噬细胞和中性粒细胞的募集都不明显。由此可见，高铁饲料减少了艰难梭菌感染小鼠肠道炎症部位中性粒细胞募集。

5.高铁饲料对艰难梭菌感染小鼠肠组织炎性因子分泌的影响

将小鼠盲肠称重后用裂解液均质，超声离心取上清根据细胞因子ELISA检测试剂盒检测炎性因子肿瘤坏死因子-α（TNF-α），白介素-33（IL-33）, 趋化因子 (C-X-C 基序)配体 1（CXCL1）, 白细胞介素-6（IL-6）和白介素1β（IL-1β）蛋白表达量。

将小鼠结肠使用总RNA提取试剂盒（Solarbio，中国）提取mRNA。根据说明书，使用UltraSYBR混合物（Bimake，美国）和特异引物通过qPCR（Roche Light Cycler 96，美国）对TNF-α、IL-6、CXCL1和IL-33的mRNA表达水平进行定量检测。将基因表达相对β-actin标准化并通过2

如图4C-H，CDI组中性粒细胞趋化因子CXCL1和促炎因子IL-33、TNF-α、IL-6和IL-1β在蛋白和基因水平的表达较NC组均显著增加，然而CDI+ Iron diet组炎性因子升高并不明显。这表明高铁饲料显著减轻了艰难梭菌感染引起的肠道免疫反应，从而减轻肠道损伤。

6.高铁饲料对艰难梭菌感染小鼠肠道代谢的影响

收集小鼠盲肠内容物，液氮速冻送至上海美吉生物有限公司进行非靶向代谢组检测，检测完成后通过云平台进行数据分析。

数据分析结果图5A表明CDI小鼠与CDI+ Iron diet组氨基酸代谢和脂质代谢差异较大，且图B的KEGG拓扑学分析显示精氨酸合成等氨基酸代谢差异更加明显。通过对CDI小鼠与CDI+ Iron diet的差异代谢物进行分析，我们发现延龄草苷和牛磺熊脱氧胆酸在CDI+Iron diet组表达显著上调（图5C-E），这可能与高铁饲料缓解艰难梭菌感染有关。

实施例二 牛磺熊脱氧胆酸和延龄草苷在艰难梭菌感染性肠炎中的应用

一、实验步骤

1.药物

本实验所用药物延龄草苷购自北京索莱宝科技有限公司（SD8370，纯度≥98%），牛磺熊脱氧胆酸购自北京索莱宝科技有限公司（IT0790，纯度≥98%）。

2.实验动物

雄性C57BL/6小鼠，4周龄，20只，无特定病原体(specific pathogen-free, SPF)，由徐州医科大学实验动物中心提供，许可证号：SCXK（苏）2020-0011。将小鼠饲养于徐州医科大学实验动物中心，动物房室温25℃，湿度40-70％，给予12h昼夜交替光源，标准实验室灭菌饲料，自由进食和饮水，实验前适应环境3天。

3.牛磺熊脱氧胆酸和延龄草苷干预艰难梭菌感染流程

将小鼠分为随机对照组(NC)、艰难梭菌感染组(CDI)、牛磺熊脱氧胆酸干预(CDI+TUDCA)和延龄草苷干预组（CDI+ Collettiside I），每组5只。自感染前一周给CDI+ TUDCA组小鼠灌胃100mg/kg牛磺熊脱氧胆酸直至取材前一天。感染前6天，开始将三组小鼠的饮用水换成混合抗生素，5天后换回无菌饮用水，同时给小鼠腹腔注射10mg/kg克林霉素。混合抗生素配方分别为0.4 mg/mL卡那霉素（kanamycin），0.035 mg/mL庆大霉素（gentamicin），0.045 mg/mL 粘菌素（colistin），0.215 mg/mL 甲硝哒唑（metronidazole），0.045 mg/mL万古霉素（vancomycin）。1天后，给CDI， CDI+ TUDCA和CDI+ Collettiside I组每只小鼠灌胃5×10

二、实验结果

根据实施例一所述的方法，对小鼠的体重，粪便和精神状态进行监测，对盲结肠进行观察及组织学评分，另外采取ELISA和流式细胞术检测炎性因子和炎细胞的变化。

结果如图6所示，相比于CDI组，化合物干预组CDI+ TUDCA和CDI+ Collettiside I组在艰难梭菌感染的48小时内，小鼠体重下降、驼背和腹泻等症状显著减轻（图6A-B），这可能与化合物减少感染小鼠肠内菌量有关（图6C）。相应地，化合物也减轻了小鼠的盲结肠损伤及萎缩，组织病理学评分显著降低（图6D-F）。此外，与CDI组相比，化合物干预组小鼠结肠中性粒细胞募集减少，趋化因子CXCL1及促炎因子IL-1β分泌显著降低（图6G-I）。这些数据表明牛磺熊脱氧胆酸（TUDCA）和延龄草苷通过减少艰难梭菌毒素分泌减少肠上皮损伤，从而减少中性粒细胞的募集和炎性因子的分泌缓解艰难梭菌感染。

动物实验表明，高铁饲料能够抑制艰难梭菌孢子的体内定植和生长，减少艰难梭菌毒素的产生，从而减少毒素诱导的中性粒细胞募集及促炎因子的产生，缓解艰难梭菌感染性肠炎。另一方面，高铁饲料改变小鼠肠道菌群的代谢，上调牛磺熊脱氧胆酸和延龄草苷等代谢物的产生，抑制艰难梭菌肠内生长，减少肠道损伤以及中性粒细胞在损伤部位的趋化，从而缓解艰难梭菌感染导致的体重下降及腹泻等症状。综上所述，高铁饲料可作为一种有效防治艰难梭菌感染的小鼠饲料。