一种发挥双重功效的纳米铌涂层牙科种植体及其制备方法

技术领域

本发明涉及牙科种植体，具体涉及一种发挥双重功效的纳米铌涂层牙科种植体。

背景技术

钛种植体植入体内后，其周围骨组织良好的成骨能力是种植体修复成功的关键。然而，种植体与骨组织实现快速整合并保证种植体周围骨组织结构功能的长期稳定性，离不开充分而持续的血液供应。因此，种植体植入后局部骨组织的重新血管化生成为种植体实现短期和长期治疗效果的必备前提，对提高种植体成功率具有重要意义。

目前，大多数种植体的表面改性思路多集中于对成骨能力的提升，而对血管再生的改良的手段相对较少。现已报道的关于提升种植体成血管性能的手段，一种方法是通过在种植体表面装载促血管生成的相关生长因子，如VEGF、HiF-1等，通过种植体植入后释放有效成分来起到促血管再生的效果。但是，由于上述加载方法得到稳定性不足，且具有突释风险，无法实现稳定地长期促血管效果；另一种方法是将钴等化学元素掺入种植体表面纳米管涂层中，通过钴元素稳定释放进而诱导局部组织产生HiF-1，促进血管生成。然而，上述方法仅实现了对促成血管性能的改良，而若想实现对促成骨性能的改良，需要辅以更为复杂的表面改性步骤，增加了工业生产的难度。因此，一种通过简单方便的制备方法，能长期稳定地实现促成骨和促血管双重效能的种植体改性手段至关重要。

纳米铌是一种生物相容性好、理化性能优越的新兴材料，我们的前期研究证实，纳米铌具有显著的促成骨和促成血管的双重效应，而利用纳米铌的上述效应对种植体进行涂层改性，从而改良种植体的性能的研究目前尚未报道。

发明内容

本发明针对上述现有技术的缺点与不足，提出了一种发挥双重功效的纳米铌涂层牙科种植体的制备方法。

本发明的第二个目的在于提供通过上述方法制备得到的发挥双重功效的纳米铌涂层牙科种植体。

本发明的第三个目的在于提供上述发挥双重功效的纳米铌涂层牙科种植体在提高种植修复成功率、缩短种植体植入后的愈合时间和保证种植体远期稳定性的应用。

为实现本发明的目的，提供如下的技术方案：

一种发挥双重功效的纳米铌涂层牙科种植体的制备方法，包括以下步骤：

（1）将氢氧化钠和β-甘油磷酸钠加入到水中，得到混合溶液，并将其作为电解液，以纯钛为阳极，以不锈钢槽体为阴极；将电解液加入到不锈钢槽体中，将纯钛置于电解液中进行微弧氧化，在纯钛表面生成具有多孔结构的二氧化钛涂层；

（2）将纳米铌粒子均匀分散于明胶溶液中，制成纳米铌明胶悬液；

（3）将步骤（1）中微弧氧化处理后的纯钛浸泡于步骤（2）中制得的纳米铌明胶悬液中，振荡器处理制得发挥双重功效的纳米铌涂层牙科种植体。

优选的，步骤（1）中所述的氢氧化钠的浓度为0.05 mol/L，β-甘油磷酸钠的浓度为0.05 mol/L。

优选的，步骤（1）中所述的微弧氧化采用工作电压350~450 V，微弧氧化脉冲频率为500~800 Hz，微弧氧化时间为5~15 min。

优选的，步骤（2）中所述的明胶悬液中纳米铌的浓度为20~30 mM。

更优选的，步骤（2）中所述的明胶悬液中纳米铌的浓度为25 mM。

优选的，步骤（3）中所述的纳米铌明胶溶液的体积为250~300 μL。

优选的，步骤（3）中所述的振荡器的振荡频率为50~80 rpm/min，振荡时间为20~30min，振荡器的振荡温度为40~50℃。

为实现本发明的另一目的，提供如下的技术方案：

一种发挥双重功效的纳米铌涂层牙科种植体的制备方法制备得到的一种发挥双重功效的纳米铌涂层牙科种植体。

优选的，所述种植体植入口腔后，可以在种植部位同时发挥促成骨和促成血管效果，提高种植成功率。

与现有技术相比，本发明具有以下优点及有益效果：

（1）本发明所述的发挥双重功效的纳米铌涂层牙科种植体，纯钛种植体经微弧氧化处理后可形成一层具有多孔结构的二氧化钛涂层，类似于骨小梁的生理结构，可以有效促进种植体与周围骨组织的稳定结合。

（2）本发明所述的发挥双重功效的纳米铌涂层牙科种植体，纯钛种植体表面具有纳米铌涂层，在植入牙列缺损部位后会缓慢释放纳米铌。一方面，纳米铌会促进局部骨组织中的间充质干细胞进行成骨分化，并促进成骨细胞的成熟与矿化，增强成骨相关蛋白的表达，有效促进种植体与周围骨组织的骨结合；另一方面，纳米铌可以增强内皮细胞的成管性能，并增加内皮细胞中成血管相关蛋白的表达，从而促进血管再生，在植入部位实现充足的血液供应。通过上述的纳米铌涂层改性手段可以提高种植修复成功率、缩短种植体植入后的愈合时间和保证种植体远期稳定性。

（3）本发明所述的发挥双重功效的纳米铌涂层牙科种植体的制备方法中，首先通过微弧氧化手段在纯钛表面形成具有多孔结构的二氧化钛涂层，然后通过纳米铌明胶悬液浸泡法使纳米铌颗粒渗入二氧化钛涂层的孔隙结构中并形成稳定的纳米铌表面涂层。因此，比起现有技术，本发明制备方法简单方便，绿色无毒，并且能形成稳定的表面涂层结构，具有良好的工业生产和临床应用前景。

附图说明

下面结合附图对本发明技术方案做进一步的详细说明，但不构成对本发明的任何限制。

图1为发挥双重功效的纳米铌涂层牙科种植体的扫描电镜图。

图2为发挥双重功效的纳米铌涂层牙科种植体对骨髓间充质干细胞的ALP活性影响的结果图。

图3为发挥双重功效的纳米铌涂层牙科种植体的对骨髓间充质干细胞细胞外基质矿化程度影响的结果图。

图4为发挥双重功效的纳米铌涂层牙科种植体的对内皮细胞中成血管相关蛋白表达影响的结果图。

实施方式

下面将结合说明书附图和具体实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤、条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。若无特别说明，实施例中所用的实验方法均为本领域技术人员所熟知的常规方法和技术，试剂或材料如无特殊说明均为通过商业途径得到。本领域的技术人员在本发明的基础上所做的任何非实质性的变化及替换均属于本发明所要求保护的范围。

实施例1：发挥双重功效的纳米铌涂层牙科种植体的制备

（1）纯钛表面微弧氧化处理：

采用商业医用TA2纯钛加工成Φ3.3 mm*6 mm的牙科柱状种植体基体（同时加工出直径为20 mm，厚度为1 mm的种植体试样用于体外成骨性能检测），将其表面抛光后超声清洗，吹干待用；将氢氧化钠和β-甘油磷酸钠加入到去离子水中，得到氢氧化钠的浓度为0.05mol/L、β-甘油磷酸钠的浓度为0.05 mol/L的混合溶液；将上述混合溶液作为电解液，以纯钛为阳极，以不锈钢槽体为阴极；将电解液加入到不锈钢槽体中，将纯钛置于电解液中进行微弧氧化，制备具有多孔结构的二氧化钛涂层。具体的参数为：微弧氧化采用工作电压350~450 V，微弧氧化脉冲频率为500~800 Hz，微弧氧化时间为5~15 min。

（2）纳米铌明胶悬液的制备:

将直径为40~60 nm的纳米铌粒子均匀分散于质量分数为0.2 %明胶溶液中，搅拌均匀，制成浓度为5 mM纳米铌明胶悬液。

（3）纳米铌涂层牙科种植体的制备：

取250~300 μL步骤（2）中得到的纳米铌明胶悬液与烧杯中，将步骤（1）中微弧氧化处理后的纯钛浸泡于步骤（2）中制得的纳米铌明胶悬液中，在40~50℃的环境下，以50~80rpm/min的频率振荡处理20~30 min，制得发挥双重功效的纳米铌涂层牙科种植体。

实施例2：发挥双重功效的纳米铌涂层牙科种植体的制备

（1）纯钛表面微弧氧化处理：

采用商业医用TA2纯钛加工成Φ3.3 mm*6 mm的牙科柱状种植体基体（同时加工出直径为20 mm，厚度为1 mm的种植体试样用于体外成骨性能检测），将其表面抛光后超声清洗，吹干待用；将氢氧化钠和β-甘油磷酸钠加入到去离子水中，得到氢氧化钠的浓度为0.05mol/L、β-甘油磷酸钠的浓度为0.05 mol/L的混合溶液；将上述混合溶液作为电解液，以纯钛为阳极，以不锈钢槽体为阴极；将电解液加入到不锈钢槽体中，将纯钛置于电解液中进行微弧氧化，制备具有多孔结构的二氧化钛涂层。具体的参数为：微弧氧化采用工作电压350~450 V，微弧氧化脉冲频率为500~800 Hz，微弧氧化时间为5~15 min。

（2）纳米铌明胶悬液的制备:

将直径为40~60 nm的纳米铌粒子均匀分散于质量分数为0.2 %明胶溶液中，搅拌均匀，制成浓度为15 mM纳米铌明胶悬液。

（3）纳米铌涂层牙科种植体的制备：

取250~300 μL步骤（2）中得到的纳米铌明胶悬液与烧杯中，将步骤（1）中微弧氧化处理后的纯钛浸泡于步骤（2）中制得的纳米铌明胶悬液中，在40~50℃的环境下，以50~80rpm的频率振荡处理20~30 min，制得发挥双重功效的纳米铌涂层牙科种植体。

实施例3：发挥双重功效的纳米铌涂层牙科种植体的制备

（1）纯钛表面微弧氧化处理：

采用商业医用TA2纯钛加工成Φ3.3 mm*6 mm的牙科柱状种植体基体（同时加工出直径为20 mm，厚度为1 mm的种植体试样用于体外成骨性能检测），将其表面抛光后超声清洗，吹干待用；将氢氧化钠和β-甘油磷酸钠加入到去离为0.05 mol/L的混合溶液；将上述混合溶液作为电解液，以纯钛为阳子水中，得到氢氧化钠的浓度为0.05 mol/L、β-甘油磷酸钠的浓度极，以不锈钢槽体为阴极；将电解液加入到不锈钢槽体中，将纯钛置于电解液中进行微弧氧化，制备具有多孔结构的二氧化钛涂层。具体的参数为：微弧氧化采用工作电压350~450 V，微弧氧化脉冲频率为500~800 Hz，微弧氧化时间为5~15 min。

（2）纳米铌明胶悬液的制备:

将直径为40~60 nm的纳米铌粒子均匀分散于质量分数为0.2 %明胶溶液中，搅拌均匀，制成浓度为25 mM纳米铌明胶悬液。

（3）纳米铌涂层牙科种植体的制备：

取250~300 μL步骤（2）中得到的纳米铌明胶悬液与烧杯中，将步骤（1）中微弧氧化处理后的纯钛浸泡于步骤（2）中制得的纳米铌明胶悬液中，在40~50℃的环境下，以50~80rpm/min的频率振荡处理20~30 min，制得发挥双重功效的纳米铌涂层牙科种植体。

对照例1：采用商业医用TA2纯钛加工成Φ3.3 mm*6 mm的牙科柱状种植体基体（同时加工出直径为20 mm，厚度为1 mm的种植体试样用于体外成骨性能检测），将其表面抛光后超声清洗，吹干待用；将氢氧化钠和β-甘油磷酸钠加入到去离为0.05 mol/L的混合溶液；将上述混合溶液作为电解液，以纯钛为阳子水中，得到氢氧化钠的浓度为0.05 mol/L、β-甘油磷酸钠的浓度极，以不锈钢槽体为阴极；将电解液加入到不锈钢槽体中，将纯钛置于电解液中进行微弧氧化，制备具有多孔结构的二氧化钛涂层。具体的参数为：微弧氧化采用工作电压350~450 V，微弧氧化脉冲频率为500~800 Hz，微弧氧化时间为5~15 min。

以实施例3制备的发挥双重功效的纳米铌涂层牙科种植体，并结合相关附图对本发明进行进一步说明。通过扫描电镜(SEM)对实施例3和对照例1制得的种植体进行表面形貌检测，结果如图1所示。可以发现，相对于图1a中纯钛种植体表面的微观形貌，可以看到图1b中发挥双重功效的纳米铌涂层牙科种植体表面形成具有多孔结构的纳米铌涂层。

实验例4：发挥双重功效的纳米铌涂层牙科种植体的促成骨性能检测

为了验证发挥双重功效的纳米铌涂层牙科种植体的促成骨效果，并探究最佳浓度配比，故通过下列体外实验对实施例1~3和对照例1的牙科种植体的促成骨性能进行测试：

首先，通过对实施例1~3和对照例1中牙科种植体试样作用下大鼠骨髓间充质干细胞的的碱性磷酸酶活性进行检测，探究纳米铌涂层牙科颗种植体的早期促成骨分化效果。

（1）大鼠骨髓间充质干细胞rBMMSC在α-MEM培养基中37 ℃、5% CO2条件下培养。每3 d换1次培养基，待细胞融合达80 %左右时，用胰蛋白酶消化传代，选用第3~4代细胞进行试验。

（2）将实施例1~3和对照例1中的牙科种植体试样置入6孔板中，然后在试样表面滴加2 mL rBMMSC细胞悬液，放入培养箱中，期间每3天更换一次细胞培养液。rBMMSCs的碱性磷酸酶活性用ALP活性检测试剂盒测定。

（3）培养至7天和14天后，用PBS清洗试样两次，将细胞更换至新的6孔培养板，每孔滴加0.5 mL的细胞裂解液，将孔板置于冰块上裂解40 min。

（4）将裂解细胞洗脱下来，4℃下离心(8000 rpm，10 min)，并取上清液，向上清液中加入磷酸对硝基苯酯，并于37℃下培养30 min。加入1M NaOH溶液终止反应，在荧光显微镜下观察ALP的染色情况。结果如图2所示。

接下来，通过对实施例1~3和对照例1中牙科种植体试样作用下大鼠骨髓间充质干细胞细胞外基质的矿化情况进行检测，探究纳米铌涂层牙科种植体的促矿化效果。

（1）大鼠骨髓间充质干细胞rBMMSC在α-MEM培养基中37 ℃、5% CO2条件下培养。每3 d换1次培养基，待细胞融合达80 %左右时，用胰蛋白酶消化传代，选用第3~4代细胞进行试验。

（2）将实施例1~3和对照例1中的牙科种植体试样置入6孔板中，然后在试样表面滴加2 mL rBMMSC细胞悬液，放入培养箱中，期间每3天更换一次细胞培养液。

（3）培养至7和14天后，用PBS清洗样品三次，然后用75％的酒精固定1 h，固定完后用PBS漂洗三次，接着用40 mM茜素红在室温下将细胞染色10 min。

（4）用去离子水反复漂洗样品至不再脱色，在荧光显微镜明场模式下观察试样表面ECM的矿化情况。结果如图3所示。

可以发现，与对照组1中的纯钛牙科种植体相比，实施例1~3中的纳米铌涂层牙科种植体作用下骨髓间充质干细胞的成骨分化水平和矿化程度均明显升高，并且25 mM NbNPs组作用下的成骨分化和矿化程度优于5 mM Nb NPs组和15 mM Nb NPs组。这证实了本发明发挥双重功效的纳涂米铌层牙科种植体的促成骨效果优良，并且优选实施例3中由25 mM纳米铌明胶悬液制得的纳米铌涂层牙科种植体材料。

实验例5：发挥双重功效的纳米铌涂层牙科种植体的促成血管性能检测

为了验证发挥双重功效的纳米铌涂层牙科种植体的促成血管效果，并探究最佳浓度配比，故通过下列体外实验对实施例1~3和对照例1的牙科种植体的促成血管性能进行测试：

（1）人脐静脉内皮细胞（HUVECs）在ECM内皮细胞培养基中37 ℃、5 % CO2条件下培养。每2 d换1次培养基，待细胞融合达80 %左右时，用胰蛋白酶消化传代，选用第3代细胞进行试验。

（2）取4只离心管分别注入3 mL ECM培养液，分别放入实施例1~3和对照例1已制备好的5 mM Nb NPs组、15 mM Nb NPs组、25 mM Nb NPs组和纯Ti组牙科种植体，浸泡3 d，制备相应的标准浸提液，用于体外血管生成实验。

（3）将第3代HUVEC内皮细胞系铺于六孔板，待细胞生长至密度80%，每孔加入2 mL上述浸提液，提前预处理12 h。

（4） 每孔加入0.5 mL PBS洗涤1次，加入250 μL胰酶消化1 min，吹打收集后离心1000 rpm 5 min 22 ℃。离心后弃液，每个样本加入1 mL ECM重悬待用。

（5）用RIPA裂解缓冲液提取总蛋白。用BCA试剂盒检测药物浓度。每个蛋白质样品用10 μg的十二烷基硫酸钠-PAGE分离后转移到聚偏氟乙烯膜上。用封闭缓冲液封闭30 min后，在4 ℃下与抗体孵育过夜，与其对应的二抗孵育。以GAPDH为内标。

内皮细胞中与成血管相关的蛋白质的表达情况如图4所示。其中，CD31和VEGFA是标志内皮细胞成血管能力的蛋白。可以发现，与对照组1中的纯钛牙科种植体相比，实施例1~3中的纳米铌涂层牙科种植体作用下内皮细胞中CD31和VEGFA的表达均有所升高，并且25mM Nb NPs组作用下内皮细胞中CD31和VEGFA的表达高于5 mM Nb NPs组和15 mM Nb NPs组。这证实了本发明发挥双重功效的纳米铌涂层牙科种植体的促成血管效果优良，并且优选实施例3中由25 mM纳米铌明胶悬液制得的纳米铌涂层牙科种植体材料。

综上，本发明方法制备的发挥双重功效的纳米铌涂层牙科种植体能同时发挥出显著的促成骨和促成血管功能，从而可以有效提高种植修复成功率、缩短种植体植入后的愈合时间和保证种植体远期稳定性，具有良好的临床应用前景。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其它的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。