UCP3基因甲基化用于判断猪瘦肉率性状的方法及其应用

技术领域

本发明属于分子生物技术领域，具体涉及UCP3基因甲基化用于判断猪瘦肉率性状的方法及其应用。

背景技术

解偶联蛋白家族(UCPs)是线粒体阴离子转运蛋白超家族的成员，它能消除线粒体内膜两侧的跨膜质子浓度差，使质子浓度差驱动的氧化磷酸化过程减慢。目前已被发现的解偶联蛋白有UCP1、UCP2、UCP3、UCP4、UCP5。它们在不同的组织中特异性表达，并发挥不同的功能。UCP1主要在棕色脂肪中表达，是棕色脂肪组织冷诱导产热的主要生理介质。在寒冷刺激下交感神经和去甲肾上腺素能激活UCP1，UCP1激活后通过质子漏的方式，将储存在线粒体质子梯度中的化学能以热量的方式释放。UCP2与UCP1和UCP3同源性分别为56％和73％，在脾脏和巨噬细胞等免疫系统组织中高表达，在心脏、肺脏、骨骼肌、胰岛、白色脂肪组织和棕色脂肪组织中均有表达，在小鼠棕色脂肪组织中，UCP2的表达量要显著低于UCP1。与之相比，UCP3的表达模式较为局限，其主要表达于骨骼肌中，在心肌和BAT中也少许表达，是骨骼肌中唯一在蛋白水平表达的解偶联蛋白。与UCP1、UCP2和UCP3相比，UCP4和UCP5氨基酸序列存在着明显差异，且只在大脑中表达。UCP3基因多态性对牲畜的生长性状、胴体性状和肉质性状都有较大影响，但关于UCP3基因的表达对牲畜的表型性状的影响还鲜有研究。

DNA甲基化是一种在DNA甲基转移酶的作用下，在DNA序列上添加甲基基团的生物化学过程，是一种广泛存在于自然界的重要的表观遗传修饰方式。

随着人们生活水平的提高，人们对猪肉的需求发生了从数量到质量的改变，高品质的猪肉越来越受到消费者的青睐。我国幅员辽阔，有许多肉质优良的地方猪种，但大多都存在着生长速度慢和瘦肉率低的问题。通过引进国外瘦肉型猪与国内本土猪种杂交可以显著提升地方猪种生长速度和瘦肉率，同时也能保持地方猪种肉质好的优势。中国地方猪种与引进猪种杂交，其子代在生长性能、抗逆性和肉质上较亲本都有明显的提升，但与国外商品猪相比，生产性能还有较大差距。猪的生产性能是影响猪经济效益的主要因素，而瘦肉率是评价猪只生产性能的重要指标，较高的瘦肉率能带来更大的经济效益。猪的瘦肉率主要受遗传、营养水平、饲养环境等多重因素影响，遗传因素则是影响猪瘦肉率的重要因素。表观遗传学作为遗传学的一个重要分支，是生物的第二套遗传密码，从表观遗传学角度探究造成猪瘦肉率差异的机制，可以为猪杂交育种提供分子依据。

发明内容

本发明的发明目的是，针对上述存在的问题，提出了UCP3基因甲基化用于判断猪瘦肉率性状的方法及其应用。

为达到上述目的，本发明所采用的技术方案是：

UCP3基因甲基化用于判断猪瘦肉率性状的应用。

进一步说明，所述瘦肉率性状为高瘦肉率或低瘦肉率。

进一步说明，通过检测UCP3基因启动子区第1847bp～1999bp处CpG岛的CpG-3位点的甲基化水平以筛选或判断高或低瘦肉率的猪。

进一步说明，采用甲基化特异性PCR、DNA甲基化重亚硫酸盐法对UCP3基因启动子区第1847bp～1999bp处CpG岛的CpG-3位点甲基化水平程度进行检测以筛选或判断高或低瘦肉率的猪。

进一步说明，所述的猪的品种为杜陆杂交猪。

进一步说明，采用序列如SEQ ID NO.3：AGTTAGAAGGTGYGATTGTTAAGA和SEQ IDNO.4：AACAAAAACCCRAATACCCTATAC所示的引物序列进行DNA甲基化重亚硫酸盐测序。

在本发明的具体实施方案中，所述UCP3基因启动子区甲基化位点的甲基化区域的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

在本发明的具体实施方案中，所述UCP3基因的编码核酸序列如SEQ ID NO.2所示。

本发明通过屠宰测定发现，DLG组屠宰重、胴体重、平均日增重和背膘厚都低于DLD组，但两组差异不显著，而DLG组瘦肉率、眼肌面积等肌肉相关表型都显著高于DLD组。

本申请人通过对UCP3基因启动子区进行生物信息学分析时发现，UCP3基因启动子核心区有一个区域，位于序列1947-1997bp处。该启动子区域存在多种转录因子结合位点，其中出现频次最多的是SP1、NF-1、c-Jun、MyoD、C/EBPα等转录因子。对UCP3基因启动子活性分析发现，DLG组UCP3基因启动子全长活性显著高于DLD组，当UCP3基因启动子由-2000bp截短到-1500bp、-500截短到-250相对荧光活性升高，－2000bp～+90bp、－1000bp～+90bp和－500bp～+90bp启动活性差异不显著，当启动子截短到-250bp～+90bp时活性最高，且启动子-1500bp～+90bp和-250bp～+90bp片段相对荧光活性显著高于其它片段。

因此，本申请人可以预测，不同瘦肉率杜陆杂交猪UCP3基因启动子活性存在显著差异，为探究造成UCP3基因启动子活性的具体原因，本实验以杜陆杂交猪全基因组DNA为模板，使用BSP法检测高低组UCP3基因启动子CpG岛甲基化水平，运用SPASS软件将UCP3基因整体甲基化水平与单点甲基化水平与基因表达量进行关联分析，结合转录因子预测结果，筛选出影响UCP3基因转录活性的关键位点。

通过研究发现待研究的UCP3基因启动子区2090bp序列，在1847-1999bp处有一个CpG岛，包含12个CpG位点，长153bp。将DLG组(高瘦肉率)和DLD组(低瘦肉率)UCP3启动子CPG岛单点甲基化水平进行比较分析，结果发现UCP3基于启动子共有12个CPG位点，都发生了不同程度甲基化，并且除了CPG-4和CPG-12位点以外,DLG组甲基化水平均低于DLD组，其中CPG-3位点的甲基化差异达到了显著水平。将与启动子CpG岛甲基化水平与基因表达量和瘦肉率进行皮尔逊相关性分析，结果显示，CpG岛甲基化水平与基因表达量呈不显著负相关(r＝－0.671，p＝0.14＞0.05)，与瘦肉率也呈不显著负相关(r＝－0.45，p＝0.371＞0.05)。将UCP3基因启动子CpG岛各CpG位点甲基化水平与mRNA表达量进行皮尔逊相关性分析，结果显示，在12个CPG位点中，有8个CpG位点的甲基化水平与mRNA表达量呈负相关，其中CpG-3位点甲基化水平与基因表达量呈极显著负相关(r＝－0.921，p＝0.009＜0.01)。推测出UCP3启动子区CpG岛甲基化位点CpG-3可能通过调控UCP3表达来参与瘦肉合成。

由于采用上述技术方案，本发明具有以下有益效果：

本发明还提供了检测UCP3基因启动子区甲基化位点CpG-3的甲基化水平在判定杜陆杂交猪高/低瘦肉率用于筛选不同瘦肉率形状的杜陆杂交猪；可以作为辅助育种中的应用，将其应用于种猪瘦肉率性状遗传改良中，从而提高猪的瘦肉率，提高企业利润，增加核心竞争力。

附图说明

图1Promoter2.0 Prediction网站预测结果图；

图2BDGP网站预测结果结果图；

图3UCP3基因启动子PCR扩增和pGL3-basic质粒双酶切图；注：A：启动子全长PCR扩增，M：DL 2000DNAMarker；泳道1～3：DLG，泳道4～6：DLD，B：启动子片段PCR扩增，M：DL2000DNAMarker，泳道1～5：－2000～+90bp、－1500～+90bp、－1000～+90bp、－500～+90bp、－250～+90bp，C：pGL3-basica质粒酶切双酶切，M:DL 5000DNAMarker，泳道1～2：pGL3-basic；

图4UCP3基因重组载体菌液PCR图；注：A：UCP3基因启动子全长菌液PCR扩增，M：DL2000DNAMarker；泳道1～3:DLG，泳道：4～6DLD，B：UCP3基因不同长度启动子菌液PCR扩增，M：DL 2000DNAMarker，泳道1～10:－2000～+90bp、－1500～+90bp、－1000～+90bp、－500～+90bp、－250～+90bp；

图5UCP3基因启动子重组载体酶切图；注：A：UCP3基因启动子全长重组载体酶切，M：DL 5000DNAMarker；泳道1～3：DLG，泳道4～6DLD，B：UCP3基因不同长度启动子重组载体酶切，M：DL 5000DNAMarker，泳道1～5:－2000～+90bp、－1500～+90bp、－1000～+90bp、－500～+90bp、－250～+90bp；

图6UCP3基因启动子活性分析；注：同一张图不同小写字母表示差异显著(P＜0.05)，相同小写字母表示差异不显著(P＞0.05)；A：UCP3基因启动子全长启动活性；B：UCP3基因不同长度启动子活性；

图7UCP3基因相对表达量；注：“**”表示差异极显著(P＜0.01)；

图8CPG岛预测；

图9CpG岛转录因子结合位点预测；注：红色字符表甲基化位点；

图10CpG岛扩增结果；注：M：DLDNAMaker 10000；泳道1～3DLG泳道4～6DLD；

图11UCP3基因启动子CpG岛整体甲基化水平；注：A：甲基化位点甲基化水平黑白点图；B：CpG岛整体甲基化水平统计图；

图12CpG岛单点甲基化水平对比；注：“*”表示差异显著(P＜0.05)；

图13CpG位点甲基化水平与基因表达量相关性分析；注：“**”表示相关性极显著(P＜0.01)；图14UCP3基因核心启动子扩增；注：M：DL 2000DNAMarker；泳道1～3：DLG，泳道：4～6DLD；

图15UCP3基因菌液PCR鉴定和双酶切鉴定；注：A：菌液PCR，M：DL 2000DNAMarker；泳道1～3：DLG，泳道4～6DLD；B：质粒双酶切，M：DL 5000DNAMarker；泳道1～3：DLG，泳道4～6DLD；

图16UCP3基因核心启动子活性；注：“**”表示差异极显著(P＜0.01)。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例与附图，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

实施例1：UCP3基因启动子活性研究

1.1.1实验样品选择与采集

本次实验，实验动物为杜洛克与陆川猪杂交后代杜陆杂交猪。选择40头初生重无显著差异的仔猪在相同饲养环境下饲养，给予相同的饲料和饮水，当日龄达到240天进行屠宰测定和实验样品的采集，计算胴体瘦肉率，选择试验群体中瘦肉率最高且相近的3头作为DLG(高瘦肉率)组，瘦肉率最低且相近的3头作为DLD(低瘦肉率)组。采集心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、背最长肌和皮下脂肪组织立即置于液氮中，然后转移至实验室－80℃冰箱保存备用。屠宰测定方法以《畜禽遗传资源调查技术规范第2部分:猪GB/T 27534.2—2011》要求为基础，结合现场测定的实际开展。

1.1.2实验试剂与耗材

pGL3-Basic和pRL-TK质粒由广西大学动物遗传育种实验室保存，其它试剂见如下：组织基因组DNA提取试剂盒(北京天漠生物科技有限公司)；DNAMaker、内切酶Nhel、内切酶Hind II、La Tap*&GC buffer(宝日医生物技术有限公司)；胰蛋白胨、酵母浸出物、氯化钠、琼脂粉(索莱宝生物科技有限公司)；感受态细胞DH5a、无内毒质粒小量提试剂盒、胶回收试剂盒(天根生化科技有限公司)；ClonExpress IIOne Step Cloning Kit试剂盒、氨苄青霉素、Dual Luciferase ReporterAssay Kit双荧光素、酶报告基因检测试剂盒(诺唯赞生物科技有限公司)；胎牛血清、0.25％胰酶、Lipofectamine LTX&p1us Reagent、opti-MEM、DMEM(赛默飞世尔科技公司)。

1.1.3实验仪器和设备

实验仪器如下：低温高速离心机、实时荧光定量PCR仪、凝胶电泳仪、凝胶成像仪、智能梯度触屏PCR仪、细胞培养箱、生化培养箱、电热恒温水浴锅、储存型液氮罐、移液枪、Infinite国200PRO酶标仪、电子天平、医用低温冰箱(4C)、台式振荡器、冷藏冷冻冰箱(-40C)、超声波细胞粉碎机、倒置显微镜、Q5000超微量分光光度计、台式高压蒸汽灭菌锅、医用超低温冰箱(-80C)、烘干箱、恒温空气摇床。

1.1.4实验试剂配制

(1)LA固体培养基:称量氯化钠2.5g、酵母浸出物1.25g、胰蛋白胨2.5g、琼脂粉3.37g于三角瓶中，加入蒸馏水，定容至250ml，用橡胶塞盖住瓶口，并用牛皮纸封口后，放入高压灭菌锅中灭菌，待其降温至不烫手，加入250μl氨苄青霉素，轻轻晃匀，倒入一次性细菌培养板中，待冷却凝固，倒置于37℃培养箱过夜后取出置于4℃冰箱保存备用。(2)LB液体培养基:称量氯化钠2.5g、酵母浸出物1.25g、胰蛋白胨2.5g于三角瓶中，加入蒸馏水，定容至250ml，用橡胶塞盖住瓶口，并用牛皮纸封口后，放入高压灭菌锅中灭菌，待其温度降至室温后置于4℃冰箱长期保存。(3)0.5×TBE Buffer:称取13.5g Tris-base、6.875g硼酸、1.744g EDTA于2.5L容器中，加入蒸馏水定容至2.5L，置于常温保存。(4)细胞完全培养基：在50ml无菌离心管中加入5ml胎牛血清和45ml DMEM培养基轻晃混匀，用封口胶封口后置于4℃冰箱保存。(5)细胞冻存液:将DMSO、DMEM和FBS按照1：2：7的比例混合并充分混匀，细胞冻存液需现配现用。

1.2实验方法

1.2.1猪UCP3基因启动子和转录因子预测

使用NCBI和UCSC网站截取猪UCP3基因第一外显子上游2000bp和第一外显子(90bp)作为待研究序列。运用在线软件Promoter2.0和BDGP对目标序列进行启动子预测，使用AliBaba2.1在线软件预测目标序列的转录因子结合位点，网站信息如下：NCBI(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)，UCSC(https://genome.ucsc.edu/)，Promoter2.0(https://services.healthtech.dtu.dk/services/Promoter-2.0/)，BDGP(https://fruitfly.org/seq_tools/promoter.html)，AliBaba2.1(http://generegulation.com/pub/programs/alibaba2/index.html)

1.2.2猪背最长肌基因组DNA提取

使用北京天漠生物科技有限公司的组织DNA提取试剂盒对杜陆杂交猪UCP3基因组DNA进行提取，具体步骤如下：

(1)用灭菌剪刀剪取大约25mg猪背最长肌组织于一个1.5ml无酶无菌离心管中，并向其中添加10μl蛋白酶K、95μl固体组织消化液和95μl RNase-Free ddH2O，彻底混匀；(2)将第(1)步混合物置于55℃水浴锅中过夜消化直到组织全部溶解，进行下一步前混匀；(3)12000rmp离心1min，取上清置于另一个1.5ml无酶无菌离心管中；(4)加入上清体积2倍的基因组结合液，振荡混匀10-15s；(5)将混合液转移至套在收集管里的吸附柱中，12000rmp离心1min，弃去收集管；(6)将吸附柱套在一个新的收集管里，向其中加入400μl洗涤液1，12000rmp离心1min，倒掉收集管中滤液；(7)加入700μl洗涤液2至吸附柱中，12000rmp离心1min，倒掉收集管中滤液；(8)加入200μl洗涤液2至吸附柱中，12000rmp离心1min；(9)将吸附柱转移至一个1.5ml无酶无菌离心管中，向吸附柱中添加50μl基因组DNA洗脱液，室温静置2～5min，12000rmp离心1min；(10)丢弃吸附柱，将基因组DNA溶液测浓度后，置于－40℃冰箱保存。

1.2.3引物设计

参考NCBI在线网站上公布的猪UCP3基因序列，利用UCSC网站截取第一外显子上游2000bp和第一外显子(90bp)为待研究序列，运用Primer5分别设计UCP3基因启动子全长PCR引物和不同长度启动子片段扩增引物UCP3-F5～F1共5对引物。这5对引物下游相同上游不同，引物两端分别加上限制性内切酶NheI和HindIII识别序列和pGL3-Basic载体同源臂，委托南宁捷尼斯生物科技有限公司合成。引物信息见下表，单下划线表示同源臂，双下划线表示酶切位点。

表1UCP3基因启动子区扩增引物

1.2.4UCP3基因启动子PCR扩增

以高低组杜陆杂交猪背最长肌基因组DNA为模板，UCP3-F5/UCP3-R为引物进行启动子全长扩增，UCP3-F5～F1/UCP3-R为引物，进行不同长度启动子片段扩增，PCR反应体系：0.1μl TakaRa LA"Tap，5.0μl 2xGC Buffer I，1.6μl dNTP Mixture，0.5μl DNA，0.4μlUCP3-F1～F5，0.4μl UCP3-R，RNase-Free ddH2O up to 10μl。程序：94℃预变性60s循环1次，94℃变性30s、66℃退火30s、72℃延伸120s循环32次，72℃终延伸300s循环1次。

1.2.5UCP3基因启动子扩增片段胶回收

PCR结束后，通过琼脂糖凝胶电泳分离出目的片段，使用天根通用型DNA纯化回收试剂盒回收，具体操作步骤按说明书进行，将回收后的DNA于－40℃冰箱保存备用。

1.2.6pGL3-Basic载体线性化

使用内切酶NheI和HindIII对目的载体pGL3-Basic进行双酶切线性化，反应体系1.0μlNheI、1.0μlHindIII、1.0μl pGL3-Basic、2.0μl 10×M Buffer、RNase-Free ddH2Oup to 20μl，反应条件为37℃，6h。

1.2.7pGL3-Basic酶切产物回收

步骤同1.2.5

1.2.8UCP3启动子与pGL3-Basic连接

将胶回收得到的UCP3启动子片段与线性化的pGL3-Basic载体使用ClonExpressIIOne Step Cloning Kit试剂盒进行连接(37℃，30min)，反应体系：4.0μl pGL3-Basic、3.0μl UCP3启动子、2.0μl 5x CE II Buffer、1.0μl Exnase II。

1.2.9pGL3-UCP3-promoter重组质粒转化

(1)从－80℃冰箱中取出感受态细胞DH5α置于冰上解冻；(2)将重组产物加入到感受态细胞中，轻弹离心管混匀，置于冰上20min；(3)将第(2)步离心管置于42℃水浴锅中温浴1min后，立即置于冰上冷却3min；(4)向离心管中加入890μl不含抗生素的LB液体培养基，200rpm培养45min～1h；(5)将含有氨苄抗性的LA固体培养基平板从4℃冰箱中取出置于37℃培养箱中预热；(6)将离心管4000rpm离心3min，弃去900μl上清，用余下的培养基将菌体重悬，用一次性涂布棒将菌液均匀涂布于含有氨苄抗性的平板；(7)将平板放入37℃培养箱中倒置培养12～14h。

1.2.10pGL3-UCP3-promoter重组质粒菌液PCR鉴定

将固体培养基上的单克隆菌落挑取转移至1ml含有相应抗性的液体培养基中，在37℃180rmp条件下摇菌3h，以菌液为模板进行PCR鉴定。反应体系和程序如下，将鉴定为阳性的菌液送至上海生工生物股份有限公司测序。

PCR反应体系：5.0μl 2xEs Tap MasterMiX，0.4μl UCP3-F1～F5，0.4μl UCP3-R，0.5μl菌液，RNase-Free ddH2O up to 10μl。程序：94℃预变性120s循环1次，94℃变性30s、65℃退火30s、72℃延伸120s循环25次，72℃终延伸120s循环1次。

1.2.11无内毒提取pGL3-UCP3-promoter重组质粒

测序完成后，选择测序正确的菌株过夜扩大培养，使用天根生化科技有限公司的无内毒质粒小量提取试剂盒按照说明书步骤提取质粒，提取完成的质粒于－40℃冰箱保存备用。

1.2.12pGL3-UCP3-promoter重组质粒酶切鉴定

将pGL3-UCP3-promoter重组质粒使用内切酶NheI和HindIII进行双酶切鉴定，酶切体系同表2-7。酶切完成后进行电泳检测。

1.2.13C2C12细胞培养

1.2.13.1细胞复苏

(1)提前30min打开超净台和细胞房紫外灯，将10％FBS培养基放入37℃水浴锅中预热；(2)取一支15ml无菌离心管，向其中加入3ml 10％FBS培养基，取一个直径60mm细胞培养皿，向其中加入2ml 10％FBS培养基；(3)从液氮中取出C2C12细胞冻存管，用手捏住冻存管盖把冻存管放入37℃水浴锅中，注意水浴锅液面不得超过冻存管盖下缘，在化冻过程中轻晃冻存管以加快溶解；(4)将溶解后的细胞悬液转移至15ml离心管中，1000rmp离心5min；(5)将离心管中的上清吸弃，加入1ml 10％FBS培养基，轻轻吹打混匀后，将细胞悬液转移至细胞培养皿中，轻晃混匀；(6)将细胞培养皿置于37℃，5％CO

1.2.13.2细胞传代

(1)提前30min打开超净台和细胞房紫外灯，10％FBS培养基、PBS缓冲液和0.25％胰酶放入37℃水浴锅中预热；(2)取出细胞细胞培养箱中的培养皿，在倒置显微镜下观察，若细胞生长状态良好，汇合度超过70％，即进行传代操作；(3)吸弃培养皿中的培养基，沿着皿壁向培养皿中加入1ml PBS缓冲液，用十字法轻晃培养皿以清洗细胞；(4)吸弃PBS缓冲液，向细胞培养皿中加入1ml胰酶后，将细胞培养皿放回37℃细胞培养箱，2min后取出细胞培养皿，若细胞皱缩变圆，则立即加入2ml 10％FBS培养基终止反应；(5)将细胞从细胞培养皿中轻轻吹打下来，混匀后将细胞重悬液转移至一个15ml无菌离心管中，1000rmp离心5min，弃去上清；(6)向离心管中加入2ml 10％FBS培养基重悬细胞，取两个直径60mm细胞培养皿，分别向其中加入2ml 10％FBS培养基和1ml细胞重悬液；(7)用十字法轻轻晃匀细胞，使其均匀分布于细胞培养皿中；(8)将细胞培养皿置于37℃，5％CO

1.2.13.3细胞冻存

(1)将DMSO、DMEM、FBS按照1：2：7的比例混合并充分混匀备用；(2)从培养箱中取出细胞培养皿在显微镜下观察，若细胞汇合度达70％即可进行冻存；(3)吸弃旧的培养基，加入1ml PBS缓冲液清洗，弃去PBS缓冲液；(4)向细胞培养皿中加入1ml 0.25％胰酶，将细胞培养皿放至37℃细胞培养箱中消化，2min后取出培养皿加入2ml完全培养基终止消化；(5)用移液枪将皿底细胞吹打下来后，转移至一个15ml无菌离心管中，1000rmp离心5min；(6)弃去上清，将1ml细胞冻存液加入离心管中轻轻吹打混匀，然后将细胞悬液转移至2ml细胞冻存管中；(7)将冻存管在4℃冰箱放置20min后转移至－20℃冰箱放置30min，然后将冻存管转置于－80℃冰箱24h，最后放至液氮中保存。

1.2.14pGL3-UCP3-promoter重组质粒转染

将C2C12细胞传代至12孔板中，转染前，用显微镜观察细胞汇合度，当细胞汇合度达到80％时即可进行转染，分别将不同长度pGL3-UCP3-promoter质粒、pGL3-basic空载质粒与pRL-TK质粒进行共转染，每组3个重复，具体操作如下：

(1)取两个1.5ml无菌离心管，分别命名为管A和管B，分别向管A和管B中加入150μl无血清培养基opti-MEM，向管A中加入4.5μl Lipofectamine

1.2.15pGL3-UCP3-promoter活性检测

使用双荧光素酶报告基因检测试剂盒对高低组UCP3基因启动子全长和不同长度pGL3-UCP3-promoter进行活性检测，具体操作步骤如下：

(1)提前半小时打开多功能酶标仪预热；(2)打开装有Luciferase Substrate的玻璃瓶，向其中加入10ml Reaction Buffer II充分混匀，将1.5ml离心管包上锡箔纸分装Luciferase Substrate溶液置于－80℃备用；(3)将5×Cell Lysis Buffer与RNase-FreeddH2O以1:4的比例混匀，置于冰上备用；(4)将Renilla Substrate与Stop&ReactionBuffer以1:5的体积混合；(5)弃去细胞培养孔中培养基，用PBS洗涤两次，每孔加入200μl 1×Cell Lysis Buffer，室温裂解5min，将细胞裂解产物转移至1.5ml离心管中，12000rmp常温离心3min，取上清用于后续实验。(6)拿出白色不透明酶标板，用排枪向其中加入Luciferase Substrate，每孔100μl，吸取20μl细胞裂解液上清至酶标板孔中，快速混匀后立即使用酶标仪检测Firefly luciferase报告基因活性。(7)向第(6)步反应液中加入100μl Renilla substrate，快速混匀后立即使用酶标仪检测Renilla luciferase报告基因活性。

1.2.16启动子活性分析

将各孔的Firefly luciferase值除以Renilla luciferase值后，以空载pGL3-basic组比值为1，对各组数据归一化，用SPSS软件对各组数据进行单因素方差分析，使用Graphpad软件作图。

1.3结果与分析

1.3.1屠宰测定结果

屠宰测定结果显示，DLG(高瘦肉率)组瘦肉率、眼肌面积等肌肉发育相关表型都显著高于DLD(低瘦肉率)组(P＜0.05)，详细表型数据见下表。

表2DLG和DLD组表型数据

注：同一行数据相比较，左上角没有字母表示差异不显著(P＞0.05)，左上角小写字母不同表示差异显著(P＜0.05)。

1.3.2猪UCP3基因启动子生物信息学分析

1.3.2.1UCP3基因核心启动子预测

使用Promoter2.0 Prediction和BDGP在线网站预测UCP3基因核心启动子区。预测结果如图1-2所示，在序列1300bp和1947bp～1997bp处可能存在启动子区域，得分分别为0.742分和1.00分。

1.3.2.2UCP3基因启动子转录因子结合位点预测

使用AliBaba2.1网站对UCP3基因启动子转录因子结合位点进行预测。转录因子结合位点预测结果：Sp152个，CEBP/α17个，NF-kappaB 11个，Oct-1 9个，AP-1 8个，GATA-18个，C-Jun 6个，ER 5个。猪UCP3基因启动子区存在多种转录因子结合位点，其中出现频次最多的是Sp1、NF-1、c-Jun、MyoD、C/EBPα。

1.3.3UCP3基因启动子扩增及载体酶切结果

以杜陆杂交猪背最长肌DNA为模板，UCP3-F5/UCP3-R为引物，PCR扩增后，进行1.5％琼脂糖凝胶电泳，电泳结果如图3A所示，在2000bp附近有单一的条带，与预期2090bp相符。以UCP3-F5～F1/UCP3-R为引物进行PCR扩增，通过1.5％凝胶电泳，发现在2000bp、1000～2000bp、1000bp、500bp、250bp附近均有单一的条带(图3B)，与预期条带2090bp、1590bp、1090bp、590bp、320bp相符。pGL3-Basic质粒酶切后，经1.5％琼脂糖凝胶电泳，发现在靠近5000bp处有单一条带(图3C)，与pGL3-Basic质粒长度4818bp相符，说明UCP3基因启动子全长和不同长度启动子片段初步扩增成功，pGL3-basic质粒酶切成功，可以进行下一步实验。

1.3.4UCP3基因启动子重组载体鉴定结果

将UCP3基因启动子全长及各长度的启动子片段分别与线性化的pGL3-Basic质粒连接后，转化至感受态细胞Trans5α，涂板后培养12h，挑取单克隆菌体摇菌，以菌液为模板进行菌液PCR。如图4所示，在250bp、500bp、1000bp、1000～2000bp、2000bp处均有清晰明亮且单一目的的条带，与预期相符。将阳性克隆菌液送至上海生工生物技术有限公司测序，测序结果与UCP3基因启动子序列对比，将测序正确结果菌株进行扩培，无内毒提取质粒，使用内切酶Nhel和HindIII对pGL3-UCP3-promoter重组质粒进行双酶切鉴定。如图5所示，在3000-5000bp有单一的条带，与pGL3-Basic载体长度4818bp相符，在在250bp、500bp、1000bp、1000～2000bp、2000bp处均有明亮且单一的条带，与启动子目的片段相符。说明杜陆杂交猪启动子全长及不同长度启动子片段双荧光素酶报告基因载体构建成功，可以用于下一步实验。

1.3.5UCP3基因启动子活性分析及核心启动子鉴定

将pRL-TK质粒与不同长度pGL3-UCP3-promoter共转染至C2C12细胞，转染48h后，使用双荧光素酶报告基因检测试剂盒检测UCP3基因全长及不同长度启动子萤火虫荧光值和海肾荧光值。计算萤火虫荧光值和海肾荧光值的比值，并以空载的pGL3-Basic与pRL-TK质粒共转染组的比值为1，对各组数据进行归一化后，用SPSS对数据进行处理。结果如图6所示，DLG组UCP3基因启动子全长活性显著高于DLD组。当UCP3基因启动子由－2000bp截短到－1500bp、－500bp截短到－250bp相对荧光活性显著升高(P＜0.05)，－2000bp～+90bp、－1000bp～+90bp和－500bp～+90bp启动活性差异不显著(P＞0.05)，当启动子截短到－250bp～+90bp时活性最高，且启动子－1500bp～+90bp和－250bp～+90bp片段相对荧光活性显著高于其它片段(P＜0.05)。

1.4讨论

本研究使用在线分析软件对杜陆杂交猪UCP3基因第一外显子上游2000bp以及第一外显子区域90bp进行了预测分析，发现该区域内存在多个转录因子结合位点，出现频次最多的是Sp1、Oct-1、c-Jun、C/EBPalp等。基因的转录调控由一系列转录因子(TF)蛋白介导，其过程涉及蛋白质-蛋白质和蛋白质-DNA相互作用复合物的形成，单个TF与其同源顺式元件或转录因子结合位点(TFBS)结合，转录因子与DNA序列的结合则是调控基因表达重要方式。特异性蛋白1(Sp1)属于含有DNA结合蛋白的C2H2型锌指家族，它可高亲和力地结合富含GC的基序，并调控大量哺乳动物基因的表达。Oct-1是在哺乳动物中广泛表达的转录因子，它拥有一个特殊的POU结构域，能与SNAPc、OBF-1、TFIIB、TBP等蛋白结合，从而介导特异性基因表达，在生物发育过程中发挥重要作用。c-Jun蛋白是转录激活因子蛋白1(AP-1)的重要组成部分，生长因子、趋化因子和细胞应激都可以促进c-Jun蛋白活化，从而对细胞增殖、分化和凋亡，以及转化、侵袭和转移等重要生物学过程进行调控。C/EBPalp是增强子结合蛋白转录因子家族中的一员，C/EBPalp有两个亚型p24和p30，且两个亚型都是活性很强的转录激活剂，它们在细胞分化和细胞功能维持中发挥重要作用。以上转录因子是通过何种方式调控UCP3基因表达还需深入研究。

双荧光素酶报告基因检测系统是通用的检测基因启动子活性的方法，其原理是将目的基因启动子片段与萤火虫荧光素酶报告基因载体连接，然后与海肾荧光素酶报告基因载体共转染细胞，加入荧光底物后，萤火虫荧光素酶报告基因载体与海肾荧光素酶报告基因载体可催化荧光底物发出生物荧光，而萤火虫荧光值与海肾荧光荧光值的比值即为该基因启动子的相对活性。曾强等通过构建猪CYP11A1基因启动子双荧光素酶报告基因截短载体，发现该基因核心启动子区位于启动子上游－398～－108bp。Chen等研究发现－385bp～+3bp是牛UCP3基因启动子序列中保障UCP3基因启动子活性的最小启动子区域，即核心启动子区，在－620bp～－433bp之间具存在一些负调控元件，在－433bp～－385bp之间存在一些正调控元件。以上研究表明，双荧光素酶报告基因检测系统是检测基因启动子活性以及鉴定基因核心启动子区的有效手段。

本研究以杜洛克和陆川猪杂交后代杜陆杂交猪背最长肌基因组DNA为模板，构建了DLG和DLD组UCP3基因启动子双荧光素酶报告基因载体。通过双荧光素酶报告基因实验检测发现，DLG组基因启动子活性显著高于DLD组。为探究影响UCP3基因启动活性的关键区域，实验同时构建了杜陆杂交猪UCP3基因启动子截短载体，运用双荧光素酶报告基因检测系统检测杜陆杂交猪UCP3基因不同长度启动子活性，以定位UCP3基因核心启动子区域。实验结果表明，当启动子由－2000bp截短到－1500bp，启动子活性显著升高，说明－2000bp～－1500bp有抑制UCP3启动子活性的调控元件，当启动子由－1500bp截短到－1000bp启动子活性显著降低，说明－1500bp～－1000bp有提高UCP3基因启动子活性的调控元件。－1000bp～－500bp以及－500bp～－250bp区域启动子活性差异不显著。而当启动子截短到－250bp～+90bp时，UCP3基因启动子已具备较高的启动活性。－250bp～+90bp启动子区活性略高于－1500bp～+90bp区域，显著高于－2000bp～+90bp、－1000bp～+90bp和－1000bp～+90bp区域。说明－250bp～+90bp为保障UCP3基因启动活性最小区域，即核心启动子区。核心启动子区是调控基因表达的关键，对UCP3基因核心启动子的深入研究可能发现造成UCP3基因表达差异的原因。

1.5小结

(1)DLG组和DLD组UCP3基因启动子都具有启动活性，且DLG组显著高于DLD组；(2)杜陆杂交猪UCP3基因核心启动子位于－250bp～+90bp区域。

实施例2：UCP3基因表达量与启动子甲基化，UCP3基因甲基化与猪瘦肉率的关系研究2.1实验材料

2.1.1实验样品：同实施例1

2.1.2实验试剂与耗材

DNA重亚硫酸盐转化试剂盒购自天根生化科技有限公司，其它试剂同实施例1。

2.1.3实验仪器：同实施例1

2.2实验方法

2.2.1背最长肌总RNA提取

(1)在无菌操作台中，预先向1.5ml无酶无菌离心管中加入4-5粒磁珠和1mlRNAiso Plus，然后用剪刀剪取40mg左右的杜陆杂交猪背最长肌组织于其中，置于冰上备用；(2)将装有组织的离心管转移至提前预冷好的低温振荡研磨机中，－40℃，60HZ研)磨300s至组织全部破碎；(3)向离心管中添加200μl氯仿，上下剧振20s直至完全混合，常温下静置5min，4℃12000rmp离心15min；(4)将离心管从离心机中取出，小心吸取400μl上清液至一个新的无酶无菌离心管中，向其中加入500μl异丙醇，轻柔上下颠倒混匀，室温静置10min后，4℃12000rmp离心10min；(5)将离心管从离心机中取出，此时可见离心管底有成块的白色沉淀，小心吸取弃去上清，向离心管中加入1ml用无酶无菌水现配的75％酒精，轻轻颠倒，使白色沉淀漂浮起来，室温静置2min，4℃7500rmp离心5min；(6)弃去上清，保留白色沉淀，敞开离心管盖子，于室温下使酒精完全挥发；(7)根据白色沉淀大小，向离心管中加入10～40μl无酶无菌水，轻柔吹打，使沉淀完全溶解；(8)用紫外分光光度计检测浓度及纯度，置于－80℃冰箱保存。

2.2.2cDNA第一链合成

使用天根生物科技有限公司的FastKing gDNADispelling RT SuperMixs试剂盒进行反转录，反转录反应体系：4.0μl 5×FastKing-RT SuperMix，1μg Total RNA，RNase-Free ddH2O up to 20μl。程序：42℃去除基因组及反转录反应15min，95℃酶灭活过程3min。

2.2.3实时荧光定量PCR引物设计

根据NCBI上已公布的野猪UCP3基因和GAPDH基因编码区序列，使用NCBI网站的Primer-BLAST模块设计用于实时荧光定量的UCP3基因和GAPDH基因的定量引物，并使用在线软件Oligo CaCl检测引物质量，引物委托南宁捷尼斯生物科技有限公司合成，引物具体信息见表3。

表3定量PCR引物序列

2.2.4实时荧光定量PCR

分别以DLG组和DLD组背最长肌cDNA为模板，以GAPDH基因为内参进行相对荧光定量PCR，每个样本进行三个技术重复，定量结果运用2-

2.2.5DNA重亚硫酸盐转化与回收

2.2.5.1DNA重亚硫酸盐转化

(1)从－80℃冰箱中取出杜陆杂交猪背最长肌基因组DNA于冰上解冻备用；(2)向Bisulfite Mix干粉中加入850μl缓冲液BM，剧振以彻底混匀；(3)在200μl离心管中配置重亚硫酸盐反应体系，体系500ngDNA，10μl缓冲液DP，90μlBisulfite Mix，RNase-FreeddH2Oup to 120μl；(4)反应体系配置完成后按照95℃反应10min，64℃反应30min，4℃无限反应程序进行重亚硫酸盐转化；

2.2.5.2重亚硫酸氢盐转化后DNA的纯化

将杜陆杂交猪背最长肌基因组DNA用重亚硫酸盐处理后，用试剂盒对转化后的DNA进行纯化回收，首次使用回收试剂盒前需要向缓冲液DB和漂洗液PW中分别加入30ml和60ml无水乙醇，具体回收步骤如下：

(1)将吸附柱套如收集管中，并向其中添加500μl平衡液BL，常温12000rmp离心1min，弃去收集管中废液后将吸附柱重新套入收集管中备用；(2)重亚硫酸盐转化后，将反应液转移到一个新的无酶无菌的1.5ml离心管中；(3)向离心管中加入5倍体积的结合液PB，吹打混匀；(4)将(3)所得混合液全部加入吸附柱中，室温静置2min，常温12000rmp离心30s后，弃去收集管中废液，将吸附柱重新套回收集管中；(5)向吸附柱中加入500μl漂洗液PW，常温12000rmp离心30s后，弃去收集管中废液，将吸附柱重新套回收集管中；(6)重复步骤(5)；(7)常温12000rmp离心2min，以彻底去除漂洗液；(8)取出吸附柱套入一个新的无酶无菌的1.5ml离心管，打开收集管盖，室温放置5～10min，使乙醇彻底挥发；(9)向吸附柱中间的吸附膜上悬空滴加20μl EB，室温静置2min，常温12000rmp离心2min后，弃去收集管，收集DNA溶液，于－20℃保存。

2.2.6UCP3基因启动子CpG岛预测

将第二章克隆得到的的杜陆杂交猪UCP3基因2090bp启动子序列输入在线软件MethPrimer，预测该段序列可能存在CpG岛的位置。

2.2.7BSP引物设计

根据预测到的启动子位置，截取包含CpG岛序列设计BSP引物，重亚硫酸盐处理过后，基因组DNA未甲基化的胞嘧啶将转化为胸腺嘧啶，使用Primer 5对转化后的序列进行引物设计，引物见表4。

表4BSP引物序列

2.2.8UCP3基因启动子区CpG岛扩增

以重亚硫酸氢盐处理过的杜陆杂交猪背最长肌基因组DNA为模板，UCP3-CpG-F/UCP3-CpG-R为引物，对UCP3基因启动子区CpG岛进行扩增。

2.2.9UCP3基因启动子区CpG岛片段回收、连接及转化

将UCP3基因启动子区CpG岛片段回收后连接至T载体，连接体系和反应程序按照说明书进行，按照1.2.9的步骤进行转化。

2.2.10UCP3基因启动子区甲基化检测

在每个布满单克隆的LA固体培养平板上随机挑选30个单克隆菌体，加入1.5ml装有氨苄抗性的LB培养基的离心管中，用封口膜封口后，置于恒温摇床37℃，180rmp摇菌6h。以菌液为模板进行菌液PCR，每个个体挑取15个阳性克隆送上海生工生物工程有限公司测序，剔除测序失败及转化未成功的序列，每个个体保留10个测序结果。使用Quantificationtool for methylation analysis在线软件作图，并用SPSS软件将甲基化率与基因表达量和瘦肉率进行关联分析。

2.2.11UCP3基因核心启动子双荧光素酶报告基因载体构建

为探究UCP3基因核心启动子区CpG岛甲基化对核心启动子活性的影响，实验以杜陆杂交猪背最长肌基因组DNA为模板，构建包含CpG岛的UCP3基因核心启动子区双荧光素酶报告基因载体，构建方法同1.2.3-1.2.11，引物同表2-4UCP3-F1/UCP3-R。

2.2.12UCP3基因核心启动子片段活性分析

将构建好的pGL3-UCP3-promoter重组质粒与pRL-TK质粒共转染进C2C12细胞检测其活性，具体实验步骤同1.2.12～1.2.15。

2.3结果与分析

2.3.1UCP3基因在高低组背最长肌中mRNA表达量

以杜陆杂交猪背最长肌cDNA为模板，进行实时荧光定量PCR，定量结果使用SPSS进行单因素方差分析，并使用Graphpad作图。结果如图7所示，DLG组UCP3基因表达量极显著高于DLD组(P＜0.01)。

2.3.2UCP3基因启动子CpG岛预测分析

将杜陆杂交猪的UCP3基因启动子区2090bp序列输入Methprimer。预测结果如图8所示，在1847bp～199bp处有一个长153bp包含12个CpG位点的CpG岛，该CpG岛位于UCP3基因核心启动子区。AliBaba2.1在线软件预测结果如图9所示，CpG岛中有Sp1、C/EBPalp、TFIID、NF-1等转录因子结合位点。

2.3.3UCP3启动子CpG岛扩增

提取杜陆杂交猪背最长肌基因组DNA后，对DNA进行亚硫酸盐处理，以处理后的DNA为模板，进行PCR扩增。扩增结果如图10所示，在200bp处能看到单一明亮的条带，与预期206bp相符，说明杜陆杂交猪UCP3基因启动子CpG岛扩增成功。

2.3.4UCP3基因CpG岛的整体甲基化水平分析

将测序结果与原序列比对后，使用QUMA作图。如图11所示，白圈说明该CpG位点没有发生甲基化，黑点则表示该CpG位点发生了甲基化。DLG组整体甲基化水平低于DLD组，但差异不显著(P＞0.05)。

2.3.5UCP3基因CpG岛单点甲基化水平分析

将DLG组和DLD组UCP3启动子CpG岛单点甲基化水平进行比较分析。结果如图12所示，UCP3基因启动子CpG岛的12个CpG位点都发生了不同程度甲基化，并且除了CpG-4和CpG-12位点以外，DLG组其它甲基化位点甲基化水平均低于DLD组，其中CpG-3位点的甲基化水平在DLG组和DLD组之间的差异达到了显著水平(P＜0.05)。

2.3.6UCP3基因启动子甲基化水平与基因表达量及瘦肉率相关性分析

利用SPSS软件将UCP3基因启动子CpG岛甲基化水平与其基因表达量和瘦肉率进行皮尔逊相关性分析。结果如表5所示，CpG岛甲基化水平与基因表达量呈不显著负相关(r＝－0.671，P＞0.05)，与瘦肉率也呈不显著负相关(r＝－0.687，P＞0.05)。将UCP3基因启动子CpG岛各CpG位点甲基化水平与mRNA表达量进行皮尔逊相关性分析。结果如图13所示，在12个CpG位点中有8个CpG位点的甲基化水平与mRNA表达量呈负相关，其中CpG-3位点甲基化水平与基因表达量呈极显著负相关(r＝－0.921，P＝0.009＜0.01)。

表5甲基化水平与基因表达量及瘦肉率相关性分析

2.3.7UCP3基因核心启动子片段扩增

以各组杜陆杂交猪背最长肌基因组DNA为模板，进行PCR扩增，结果如图14所示，在250bp～500bp之间有一条明亮清晰的条带，与预期相符。

2.3.8pGL3-UCP3-promoter载体三重鉴定

UCP3基因启动子CpG岛片段与pGL3-Basic载体连接，转化涂板挑单克隆菌体摇菌，进行菌液PCR鉴定。结果如图15A，在250bp～500bp处有单一的目的条带，将鉴定为阳性的单克隆送上海生工测序，把测序正确的单克隆菌液过夜扩培，无内毒提取质粒，使用限制性内切酶进行酶切鉴定。酶切结果如图15B所示,在5000bp和250bp～500bp间有与预期相符的单一条带，说明pGL3-UCP3-promoter载体构建成功。

2.3.9UCP3基因核心启动子活性分析

将pGL3-UCP3-promoter质粒与pRL-TK质粒共转染进C2C12细胞，进行双荧光素酶报告基因实验，实验步骤同1.2.14。结果如图16所示，DLG组的核心启动子活性极显著高于DLD组(P＜0.01)。

2.4讨论

瘦肉率是猪的主要经济性状之一，属于中等遗传力性状，受多基因调控，而且易受外部环境影响。有研究发现，猪肌肉质量差异可能是通过表观遗传修饰的方式介导的，表观遗传修饰可能通过影响MyoD上游基因来调控MyoD表达，从而对成肌细胞分化产生影响。DNA甲基化作为一种重要的表观遗传修饰方式，能在不改变DNA序列的前提下，通过改变染色质结构，影响转录因子与DNA序列结合来调控基因表达，若甲基化发生在基因启动子区域，则对基因表达有抑制作用。杜陆杂交猪为瘦肉型杜洛克猪与中国本地优良猪种陆川猪杂交后代，它的瘦肉率较亲本有了显著提高。但在实际生产中出现了瘦肉率差异较大个体，而实时荧光定量PCR实验结果表明，不同瘦肉率杜陆杂交猪背最长肌UCP3基因表达量存在极显著差异。

为了探究造成UCP3基因表达差异的原因，本研究从DNA甲基化角度出发，通过在线软件MethPrimer预测到杜陆杂交猪UCP3基因启动子区有一个长153bp的CpG岛，且该CpG岛位于杜陆杂交猪UCP3基因核心启动子区。通过在线软件AliBaba2.1预测到CpG岛序列存在Sp1、C/EBPalp、TFIID、NF-1等调控基因转录的转录因子结合位点。转录因子Sp1由785个氨基酸组成，是Sp/KLF家族中的一员，是它通过与靶基因启动子结合对靶基因转录进行调控，从而参与细胞增殖、凋亡和分化等生物学过程。Sp1的稳定性和活性易受到甲基化、乙酰化、糖基化等翻译后修饰的影响。CCAAT结合子增强蛋白α(C/EBPalp)属于碱性亮氨酸蛋白家族，C/EBPalp是脂肪细胞分化的关键基因，它的表达能促进脂肪细胞增殖分化，此外，C/EBPalp也可以通过促进成脂相关基因GLUT4、SCD1、FABP4的表达来促进脂质沉积。而在小鼠成肌细胞的研究中发现，过表达C/EBPalp基因，MyoD、MyoG、Myf4和Myf5表达量显著降低，并且成肌细胞也丧失了分化为肌管的能力。TFIID是RNA聚合酶Ⅱ(RNApolymeraseⅡ)启动复合物的核心组件之一，其作用是识别并结合到基因的启动子区域，促进RNA聚合酶II的招募和定向启动转录，TFIID的功能对于正常的基因表达至关重要，因为它参与启动转录的过程，TFIID功能异常会导致基因表达的失调。转录因子NF-1(nuclear factor 1)在多种生物体广泛表达，并且参与多个基因的调控，除了结合到DNA上调控基因转录外，NF-1还可以与其它转录因子共激活因子相互作用，从而协同调控基因的表达。本研究发现，杜陆杂交猪UCP3基因启动子CpG岛上Sp1、C/EBPalp、TFIID、NF-1转录因子结合位点内，都存在一个CpG二核苷酸位点，推测这些CpG二核苷酸位点甲基化会影响转录因子与相应的DNA序列结合，从而影响UCP3基因的转录。

BSP测序结果显示，DLG与DLD组UCP3基因核心启动子区CpG岛整体甲基化水平存在差异，且DLG组整体甲基化水平低于DLD组。通过皮尔逊相关性分析显示，杜陆杂交猪UCP3基因启动子CpG岛整体甲基化水平与其基因表达、瘦肉率均呈不显著负相关。表明UCP3基因启动子甲基化对基因表达和瘦肉率有负调控作用，相关性没有达到显著水平可能是因为样本量较少。CpG岛内的CpG-1、CpG-2、CpG-3、CpG-5、CpG-7、CpG-8、CpG-9、CpG-11位点的甲基化水平与UCP3基因表达量呈负相关，其中CpG-3位点的甲基化水平与UCP3基因表达量相关性达到了极显著水平，通过与CpG岛转录因子预测结果对比分析发现，CpG-3位点位于转录因子Sp1结合位点内，推测Sp1是影响UCP3基因表达的关键转录因子。由于CpG岛位于杜陆杂交猪UCP3基因核心启动子内，推测UCP3基因启动子甲基化会对UCP3基因核心启动子活性造成影响。因此，实验构建了DLG和DLD组UCP3基因核心启动子双荧光素酶报告基因载体，通过双荧光素酶报告基因实验发现，DLG组UCP3基因核心启动子活性极显著高于DLD组。

综上，UCP3基因启动子CpG岛甲基化，可能通过影响转录因子Sp1与UCP3序列的结合，进而调控UCP3核心启动子活性，从而调节UCP3基因的表达和胴体瘦肉率。

2.5小结

(1)发现DLG组背最长肌中UCP3基因表达量极显著高于DLD组；(2)发现DLG组UCP3基因启动子CpG岛甲基化水平低于DLD组，UCP3基因启动子CpG岛甲基化水平与mRNA表达量和瘦肉率呈不显著负相关，在所有12个CpG位点中，位于转录因子Sp1结合位点内的CpG-3位点甲基化水平与UCP3 mRNA表达量呈极显著负相关；(3)DLG组UCP3基因核心启动子活性极显著高于DLD组。

实施例3：UCP3基因甲基化用于评估猪瘦肉率性状的方法

通过上述的研究结论，进行验证实验：

方法如下：

采用的试验样品选择与采集与1.1.1相同，重新选择了高瘦肉率和低瘦肉率的杜陆杂交猪各10头；

采用甲基化特异性PCR、DNA甲基化重亚硫酸盐法对UCP3基因启动子区第1847bp～1999bp处CpG岛的CpG-3位点甲基化水平程度进行检测；

结果发现：10头高瘦肉率的杜陆杂交猪CpG-3位点甲基化水平均小于40％；10头低瘦肉率的杜陆杂交猪CpG-3位点甲基化水平均大于等于40％。

可见，通过检测UCP3基因启动子区第1847bp～1999bp处CpG岛的CpG-3位点的甲基化水平可以筛选或判断高或低瘦肉率的杜陆杂交猪。

上述说明是针对本发明较佳可行试验例的详细说明，但实施例并非用以限定本发明的专利申请范围，凡本发明所提示的技术精神下所完成的同等变化或修饰变更，均应属于本发明所涵盖专利范围。