一种控制水稻种子粒长和种子活力的基因、编码蛋白及应用

技术领域

本发明属于水稻分子生物学和生物技术领域，特别涉及一种控制水稻种子粒长和种子活力的基因、编码蛋白及应用。

背景技术

水稻(Oryza sativa L.)是世界的主要粮食作物之一，提供了人类消耗的热能与蛋白质，全球50％以上人口以水稻作为主食。在中国水稻更是重要的粮食作物，水稻的种植在农村社会经济中扮演着十分重要的角色。因此利用分子育种的手段培育高产优质的水稻品种是解决当前粮食问题的最有效的手段之一。

水稻单株产量的构成主要包括有效穗数、每穗实粒数和粒重三个部分。水稻粒重主要由水稻种子的粒型以及灌浆充实度所决定。由粒长、粒宽和粒厚三个维度确定的水稻种子粒型决定了稻米的粒重和稻米品质。目前水稻中有多个与粒型相关的QTL已经被成功克隆，如：GW5、GW2、GS3等；多条调控水稻种子粒型的通路已经被阐释，如：G蛋白信号通路、泛素-蛋白酶体通路、有丝分裂原活化蛋白激酶信号及植物激素调控通路、microRNA调控通路等。

种子活力是指种子的发芽和出苗率、幼苗生长的潜势、植株抗逆能力和生产潜力的总和，是评价种子的极其重要的指标之一，种子活力受多种因素影响，包括种子自身遗传特性，种子发育程度以及种子贮藏环境等。低活力的种子发芽率低、出苗速度慢，耐逆性差，最终导致农作物产量显著降低。目前相关学者在种子生理生化层面对种子活力进行了一系列探究，并且克隆到了一些与种子活力相关的基因。

因此，进一步挖掘控制水稻种子粒长和种子活力的相关基因，探索水稻种子粒重和活力的调控途径对水稻分子育种具有十分重要的应用价值。

发明内容

为了获得更多与水稻种子粒长或种子活力相关的基因，本发明提供了一种控制水稻种子粒长和种子活力的基因，该基因命名为RIF2，基因RIF2能够正向调控水稻种子粒长，负调控水稻种子活力，为现代水稻分子育种提供了新的基因资源，具有重要的理论和实践意义。

本发明还提供了一种控制水稻种子粒长和种子活力的基因的编码蛋白及应用。

本发明通过以下技术方案实现：

本发明提供一种控制水稻种子粒长和种子活力的基因，所述控制水稻种子粒长和种子活力的基因命名为RIF2；

RIF2基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；

或者，RIF2基因的cDNA的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

基于同一发明构思，本发明提供一种控制水稻种子粒长和种子活力的基因在控制水稻种子粒长和/或水稻种子活力中的应用。

进一步的，所述应用包括：

通过靶向敲除RIF2基因或降低RIF2基因表达量，以降低水稻种子粒长，提升水稻种子活力；

或者，通过提高RIF2基因表达量，以降低水稻种子活力，提升水稻种子粒长。

基于同一发明构思，本发明提供一种控制水稻种子粒长和种子活力的基因的编码蛋白，所述编码蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。

基于同一发明构思，本发明提供上述编码蛋白在控制水稻种子粒长和/或水稻种子活力中的应用。

基于同一发明构思，本发明提供一种控制水稻种子粒长和种子活力的基因的扩增引物，所述扩增引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5所示。

基于同一发明构思，本发明提供上述扩增引物在控制水稻种子粒长和/或水稻种子活力中的应用。

基于同一发明构思，本发明提供重组载体在控制水稻种子粒长和/或水稻种子活力中的应用，所述重组载体包括以下任意一种：

A:能够靶向敲除RIF2基因或降低RIF2基因表达量的CRISPR-Cas9重组载体；

B:含有编码RIF2基因的cDNA全长的过表达重组载体。

基于同一发明构思，本发明提供还一种利用RIF2基因调控水稻粒长与活力的方法，包括以下步骤：

构建重组载体，以所述重组载体对水稻进行遗传转化，获取RIF2转基因植株；

从所述RIF2转基因植株中筛选出目标转基因株系；

其中，所述重组载体包括以下任意一种：

A:能够靶向敲除RIF2基因或降低RIF2基因表达量的CRISPR-Cas9重组载体；

B:含有编码RIF2基因的cDNA全长的过表达重组载体。

进一步的，所述从所述RIF2转基因植株中筛选出目标转基因株系，具体包括：

从所述RIF2转基因植株中筛选出RIF2基因过量表达植株，即为目标转基因株系；

或者，从所述RIF2转基因植株中筛选出RIF2基因敲除植株，即为目标转基因株系。

本发明实施例中的一个或多个技术方案，至少具有如下技术效果或优点：

本发明一种控制水稻种子粒长和种子活力的基因，该基因命名为RIF2，基因RIF2或其编码蛋白能够正向调控水稻种子粒长，负调控水稻种子活力，利用该基因有助于筛选和培育高活力水稻品种，为创制适应直播生产的水稻新品种提供新的基因资源，具有重要的理论和实践意义。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例中的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作一简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其它的附图。

图1为RIF2基因结构图。

图2为RIF2基因cDNA扩增胶图两个泳道：泳道1为Marker；泳道2、3为RIF2 cDNA扩增产物。

图3为pYLCRISPR/Cas9载体构建图：A:PCR构建gRNA表达盒，五个泳道(1，Marker；2，靶点1gRR扩增目的条带；3，靶点1U-F扩增条带；4，靶点2gRR扩增目的条带；5，靶点2U-F扩增的条带)；B:扩增gRNA表达盒,三个泳道(1，Marker；2，靶点1gRNA表达盒扩增产物；3：靶点2gRNA表达盒扩增产物)。

图4为RIF2敲除靶点位置与突变情况图：A，RIF2敲除靶点位置与靶点1、靶点2突变情况；B：靶点1突变株系测序峰图；C：靶点2突变株系测序峰图。

图5为RIF2突变体株系与野生型编码氨基酸序列比对图。

图6为pH611载体图谱。

图7为RIF2过表达株系潮霉素标记鉴定胶图。

图8为RIF2敲除突变体的籽粒和糙米图：A:RIF2敲除突变体籽粒粒长,1野生型，2CRRIF2-1,3CRRIF2-2；B:RIF2敲除突变体籽粒粒宽,1野生型，2CRRIF2-1,3CRRIF2-2；C：RIF2敲除突变体糙米粒长,1野生型，2CRRIF2-1,3CRRIF2-2；D:RIF2敲除突变体糙米粒宽,1野生型，2CRRIF2-1,3CRRIF2-2：(n＝10，Bar＝1cm)。

图9为RIF2敲除突变体株系籽粒粒长和粒宽统计图：A:RIF2敲除突变体籽粒粒长统计柱形图；B:RIF2敲除突变体籽粒粒宽统计柱形图。

图10为RIF2敲除突变体糙米粒长与粒宽统计柱形图：A:RIF2敲除突变体糙米粒长统计柱形图；B：RIF2敲除突变体糙米粒宽统计柱形图。

图11为RIF2敲除突变体株系千粒重统计柱形图。

图12为RIF2敲除突变体发芽率统计折线图。

图13为RIF2敲除突变体活力指数统计图。

图14为RIF2敲除突变体发芽指数统计图。

图15为同天发芽的野生型NPB,敲除突变体CRRIF2-1,CRRIF2-2种子连续七天发芽动态考察图；(Bar＝1cm)。

图16为RIF2敲除突变体七天根长折线图。

图17为RIF2敲除突变体七天芽长折线图。

图18为RIF2过表达株系实时荧光定量。

图19为RIF2过表达株系籽粒和糙米图：A:RIF2过表达株系籽粒粒长,1野生型，2:OERIF2-1,3:OERIF2-2；B:RIF2过表达株系籽粒粒宽,1:野生型，2:OERIF2-1,3:OERIF2-2；C：RIF2过表达株系糙米粒长,1野生型，2:OERIF2-1,3:OERIF2-2；D:RIF过表达株系糙米粒宽,1野生型，2OERIF2-1,3OERIF2-2：(n＝10，Bar＝1cm)。

图20为RIF2过表达株系籽粒粒长和粒宽统计柱形图：A:RIF2过表达株系籽粒粒长统计柱形图；B：RIF2过表达株系籽粒粒宽统计柱形图。

图21为RIF2过表达株系糙米粒长和粒宽统计柱形图：A:RIF2过表达株系糙米粒长统计柱形图；B：RIF2过表达株系糙米粒宽统计柱形图。

图22为RIF2过表达株系千粒重统计柱形图。

图23为RIF2过表达株系发芽率统计折线图。

图24为RIF2过表达株系发芽指数统计柱形图。

图25为同天发芽的野生型NPB,过表达株系OERIF2种子连续七天发芽动态考察图；(Bar＝1cm)。

图26为OERIF2过表达株系七天根长折线图。

图27为OERIF2过表达株系七天芽长折线图。

具体实施方式

下文将结合具体实施方式和实施例，具体阐述本发明，本发明的优点和各种效果将由此更加清楚地呈现。本领域技术人员应理解，这些具体实施方式和实施例是用于说明本发明，而非限制本发明。

在整个说明书中，除非另有特别说明，本文使用的术语应理解为如本领域中通常所使用的含义。因此，除非另有定义，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域技术人员的一般理解相同的含义。若存在矛盾，本说明书优先。

除非另有特别说明，本发明中用到的各种原材料、试剂、仪器和设备等，均可通过市场购买得到或者可通过现有方法制备得到。

本发明整体思路如下：

泛素是一种小分子蛋白质，在细胞内部参与多种生物学过程，泛素蛋白酶体作为控制种子粒型的通路已有相关报道，但是通过泛素途径调控种子活力的相关基因鲜有报道。本发明阐述了RIF2作为一个未知功能的泛素类相关基因，可以同时对水稻种子粒型与活力进行调控，证实了RIF2具有一因多效的功能，为创制新的水稻优质品种提供新的基因资源具有重要意义。

在本发明中，RIF2基因或编码泛素结构蛋白正向调控调控水稻种子粒长。通过万科考种仪对同时收获的成熟饱满的野生型、RIF2敲除突变体纯合株系以及过表达株系的水稻种子进行粒型测量，测量数据通过SPSS软件进行数据分析。发现RIF2敲除株系的水稻籽粒长度显著短于野生型，RIF2过表达株系的水稻籽粒长度显著长于野生型。

在本发明中，RIF2基因或编码泛素结构蛋白负向调控水稻种子的活力。所述的水稻种子活力是指，种子发芽和出苗率、幼苗生长的潜势、植株抗逆能力和生产潜力的总和(种子发芽：种子萌动后继续生长，当胚根长度与水稻籽粒长度相等，胚芽长度达到水稻籽粒一般长度时，称为发芽)。

下面将结合实施例及实验数据对本申请一种控制水稻种子粒长和种子活力的基因、编码蛋白及应用进行详细说明。

实施例1

本实施例水稻基因RIF2 cDNA片段的克隆，具体如下：

1.RNA片段的提取

以品种日本晴的叶片组织进行取样，取样大小为3cm叶片，迅速将样品放入液氮中保存，使用Trizol提取样本RNA，RNA提取及反转录步骤如下：

(1)取水稻叶于2ml RNase-free离心管中，放入液氮速冻，用高速磨样机磨至粉末状，加入1ml Trizol提取液漩涡震荡，冰浴静置10min；

(2)向提取液中加入300μl氯仿(国药)，震荡混匀，室温静置5min，12，000g 4℃离心15min；

(3)小心吸取上清液(约400μl)至新的1.5ml RNase-free离心管中，向上清液中加入等体积预冷的异丙醇(国药)，颠倒混匀，冰上静置10min；

(4)12,000g 4℃离心10min；弃上清，加入1ml75％乙醇(国药)，颠倒数次，4℃10000g离心20S，弃上清；

(5)加入1ml75％酒精(国药)，颠倒数次混匀，10000g 4℃离心20s,室温晾干,去除残留的75％酒精；

(6)加30-40μl DEPC处理水，充分溶解RNA，使用核酸浓度检测仪测定总RNA浓度，1％琼脂糖凝胶电泳检测RNA质量后置于-80℃保存备用。

2、反转录

将提取的RNA使用全式金EasyScript One-Step gRNA Removal and cNDASynthesis SμperMix(REF:AE311)的试剂盒进行反转录，得到日本晴叶片的总cDNA。逆转录体系如下所示：

PCR程序设定程序为，50℃15-30min，85℃5s。

将反应后的样品放置4℃短期保存，-20℃长期保存。

3、RIF2 cDNA的克隆

根据NCBI提供的关于RIF2基因(位于10号染色体上，其在水稻中的基因位点编号为LOC_Os10g39620)的cDNA序列(SEQ ID NO：2)；该编码区含有1980个碱基对，编码一个含有659个氨基酸的含泛素结构的蛋白(SEQ ID NO：3)，基因结构如图1所示。根据编码区的基因序列设计RIF2扩增引物F(5’-3’):ATGGGCGGCGGAGGAGGCGA(SEQ ID NO.4)；R(5’-3’):TTATGATTTATGAAGATACCCCA(SEQ ID NO.5)。扩增使用的酶为：Go l

PCR结束后得到PCR原液进行琼脂糖凝胶电泳，称取4g的琼脂粉使用1％的TAE溶液加热溶解，加入2.5μL的核酸染料配置琼脂糖凝胶，使用北京君意的水平凝胶电泳槽进行凝胶电泳(电压150伏特，时间20min)，电泳结束后使用莫纳的凝胶成像仪器进行观察，扩增目的基因RIF2 cDNA条带如图2所示。

4、序列对比

在国家水稻数据中心(https://www.ricedata.cn/gene/)获取RIF2基因公布的cDNA序列，下载基因组序列后与扩增的PCR原液的测序结果序列(测序由生工生物有限公司完成)使用生物信息学软件BioXM2.7.1进行序列比对。

实施例2

水稻基因RIF2敲除载体构建，获取RIF2敲除株系(以靶点1为例，靶点2与靶点1的方法相同)。

1、SgRNA的设计与合成

设计敲除目的基因RIF2所需的接头引物，PAM序列选择NGG，snoRNA promoter选择Μ6，Gμide Seqμence Length选择20bp，Target Genome选择Oryza sative(MSΜ)，LocμsTag选择对应基因的LOC号。选择GC含量在45％-70％，脱靶估值等于或大于0.7(或0.6)，Offtarget＜100，TSL为2或3；GSL＜＝6；CBP＜＝7；TBP＜＝12；IBP＜＝6的敲除引物，前引F为GCCG+靶点序列，后引R为AAAC+靶点序列的反向互补序列，引物序列如下：

靶点1(Tag1)前引物KOF-1(5’-3’):GCCG ACTTGGACCCGTTCGCGCAC(SEQ ID NO.6)；

靶点1(Tag1)后引物KOR-1(5’-3’)：AAAC ATGCTCTTCTTGCCACCGT(SEQ ID NO.7)；

靶点2(Tag2)前引物KOF-2(5’-3’):GCCG CAGCAGCGCCTGATCTACAA(SEQ ID NO.8)；

靶点2(Tag2)前引物KOF-2(5’-3’):AAAC TTGTAGATCAGGCGCTGCTG(SEQ ID NO.9)。

Μ-F/gR-R，Pps-GGL/Pgs-GGR引物序列为构建Crispr-Ca9通用引物；

Μ-F(5’-3’):CTCCGTTTTACCTGTGGAATCG(SEQ ID NO.10)；

gR-R(5’-3’):CGGAGGAAAATTCCATCCAC(SEQ ID NO.11)；

Pps-GGL：(5’-3’):TTCAGAGGTCTCTCTCGACTAGTATGGAATCGGCAGCAAAGG(SEQ IDNO.12)；

Pgs-GGR：(5’-3’):AGCGTGGGTCTCGACCGACGCGTATCCATCCACTCCAAGCTC(SEQ IDNO.13)；

之后在长沙擎科生物公司进行合成引物。

2、CRISPR敲除载体构建

本实验使用的载体是pYLCRISPR/Cas9双元载体系统，sgRNA中间载体pYLgRNA-OsΜ6a。采用靶点接头连接扩增法进行sgRNA表达盒构建，此详细过程如下：

(1)靶点双链接头的制备

将接头前引KOF-1(SEQ ID NO.6)和后引KOR-1(SEQ ID NO.7)在0.5×TE buffer中混合成0.5μmol/L。90℃金属水浴锅水浴时间为30s，之后移至室温冷却。

(2)SgRNA表达盒的构建

构建体系如下：

将上述反应液混合后，进行PCR扩增，PCR温度体系为：

循环圈数：5cycles，得到SgRNA表达盒。

(3)第一轮PCR：sgRNA扩增

第一轮PCR的反应体系如下：

将上述反应液混合后，进行PCR扩增，PCR温度体系为

通过凝胶电泳进行跑胶验证(如图3-A)，具体凝胶电泳方法见RIF2基因的克隆中的凝胶电泳步骤；扩增条带位置为一低一高，扩增条带大小分别为284bp(产物gRR)，629bp(产物Μ-F)。确认连接成功后，取第一轮PCR产物进行第二轮PCR。

(4)第二轮PCR：扩增sgRNA表达盒

取第一轮PCR产物进行第二轮PCR反应，反应体系为50μl，反应体系如下：

将上述反应液混合后，进行PCR扩增，PCR循环体系为

(5)PCR产物纯化

将第二轮PCR产物用1％的琼脂糖凝胶进行凝胶电泳迁移，之后在凝胶成像仪上观察目的条带位置(如图3-B)，目的条带大小为800bp，确认条带位置正确。确认条带位置正确后，将含有目的条带的凝胶切到2.0EP管，使用胶回收试剂盒(NA:omega,REF:D2500-02)进行回收。具体回收步骤如下：

1)琼脂糖凝胶电泳分离DNA片段；

2)当所需DNA片段完全分离时，转移凝胶至紫外灯上，迅速把目的DNA片段切胶回收至新的2ml EP离心管。(切胶时尽量去除多余的凝胶，目的DNA片段曝露在紫外灯的时间不宜过长)；

3)加入没过DNA片段的XP2 Binding Buffer，置于58℃-60℃烘箱中至凝胶完全融化，每隔2-3min振荡混合物至完全溶解。

4)取一个

5)转移300μl XP2 Binding Buffer至结合柱，室温下12000xg离心1min，弃滤液；

6)将

7)重复步骤6；

8)将

9)将

10)将10μl洗脱液从1.5ml离心管吸出到

(6)将sgRNA表达盒克隆到pYLCRISPR/Cas9载体

此步骤使用基于BsaⅠ(No.Thermo；LOT:00882417)酶切和连接的“金门”克隆方法(Gibson等开发了一种“isothermal in vitro recombination reaction”，也称为“GibsonAssembly”可进行多个PCR片段的连接(Gibson,et al.,2009；Gibson,et al.,2010；Gibson,2011)，通过“边切边连”的方法将sgRNA表达盒与双元载体pYL CRISPR/Cas9进行连接，反应体系为15μl，连接的反应体系如下：

将上述反应液混合后，进行PCR扩增，PCR循环体系为

(7)连接产物转化

使用擎科大肠感受态Trelief.5α,在-80℃取出感受态细胞加入连接产物10μl，轻轻混匀(轻柔吹打或轻弹管壁数下)，冰上静置5min；42℃水浴热激45～60s，迅速转移至冰浴中，静置2min(冰上静置过程中请勿晃动样品，否则会降低转化效率)；向离心管中加入700μL不含抗生素的无菌液体LB培养基，混匀后37℃，200rpm摇床复苏20min(复苏时间每增加5min转化效率提高3～5倍)；取合适体积的复苏液均匀涂布到含卡纳抗生素的固体LB培养基上，37℃培养箱倒置培养过夜。第二天挑取单菌落，加入含有卡纳抗生素的液体LB培养基进行摇菌培养，之后使用质粒提取试剂盒(NO.omega；REF:D6943-02)提取菌落质粒。质粒提取具体实验步骤如下：将带有质粒的大肠杆菌接种于含有Kan抗生素的5ml LB培养液中培养，37℃摇床培养12～16h；将4ml菌液分次移入2ml的离心管中，室温下10000xg离心1min收集细菌；弃滤液，加入250μl Solution I/RNaseA混和液，漩涡振荡使细胞完全悬浮；往重悬混和液中加入250μl Solution II，轻轻颠倒混匀4-6次。(避免剧烈混匀裂解液且裂解反应不超过5min)加入350μl Solution III，温和颠倒数次至形成白色絮狀沉淀。室温下12000xg离心10min；转移上清液至套有2ml收集管的

(8)载体遗传转化

以粳稻品种NPB(日本晴)为遗传受体材料，将构建好的敲除载体送至武汉伯远生物公司，使用农杆菌体外侵染的方法进行遗传转化获取转基因株系。

(9)RIF2突变体株系的鉴定

在敲除靶点前后设计鉴定引物，引物序列为JDF(5’-3’):CTTCTTCCCCTCTCCCGAAGA(SEQ ID NO.14)；JDR(5’-3’):GTCAATTCCAACCCATCGGAC(SEQ ID NO.15)以转基因株系的DNA作为模板进行PCR扩增，通过鉴定后得到转基因阳性植株，获取RIF2突变体植株两种不同的突变类型(图4-A)突变体株系CRRIF2-1在靶点1的位置与野生型相比单碱基插入“G”，突变体株系CRRIF2-2在靶点2的位置与野生型相比单碱基插入“A”,测序峰图如图4-A,4-B。突变后RIF2基因在野生型与突变体中的氨基酸比对序列如图5所示。

通过设计测序之后将纯合突变体植株种植于湖南农业大学耘园基地，正常大田土肥管理，转基因水稻苗成熟期后，收获足量的纯合株系种子供后续实验使用。

实施例3

通过同源重组的方法构建RIF2超表达载体，得到RIF2过表达株系。

具体构建步骤如下：

1、过表达引物设计合成

设计带有重组接头的引物。首先在CDS序列前后分别选择18-24bp作为基因CDS序列扩增引物，其次在过表达载体pHF611的MCN(多克隆位点区域)选择两个酶切位点(BamHI和HindIII)，在酶切位点BamHI前选择12-15bp作为前引(F)重组接头，在酶切位点HindIII后选择12-15bp反向互补后作为后引(R)重组接头，此时获得过表达引物序列，F：重组接头序列+酶切位点序列(酶切位点：BamHI)+CDS序列扩增引物F；R：重组接头序列反向互补序列+酶切位点序列(酶切位点：HindIII)+CDS序列扩增引物R。

过表达连接引物为：OE-F:TACGACGTTCCAGATTACGCT GGATCCATGGGCGGCGGAGGAGGCGA(SEQ ID NO.16)；

OE-R:ACTTAGCGGCCGCACTAGT AAGCTT TTATGATTTATGAAGATACCCCA(SEQ IDNO.17)。

将设计完毕的引物序列在擎科生物公司合成引物。

2.RIF2过表达载体构建

本实验使用的载体是pHF611(湖南农业大学南方粮油协同创新中心国家重点实验室自行构建)载体，载体图谱如图6所示，采用同源重组方法构建目的基因融合载体。

以粳稻品种日本晴叶片组织进行取样，取样大小为3cm叶片，迅速将样品放入液氮中保存，使用Trizol提取样本RNA，RNA提取及反转录方法同上。

3、目的基因扩增

将逆转录获得的cDNA作为模板，使用高保真酶KOD(NO.TOYOBO；REF:KFX-101),以反转录的cDNA为模板，序列扩增所使用的无缝克隆引物OE-F(SEQ ID NO.16),OE-R(SEQ IDNO.17)，对目的基因RIF2的CDS进行扩增，PCR扩增体系为50μl，扩增体系如下：

将上述反应液混合后，进行PCR扩增(ETC811Plus PCR仪)，PCR程序为：

4、过表达载体pHF611线性化

将pHF611载体(图6)使用限制性内切酶BamHI和HindIII(NO.NEB；REF:R0141L,R0136L)进行双酶切，酶切反应体系：限制性内切酶BamHI 1μl，HindIII 1μl，ddH

5、RIF2基因cDNA片段与线性化pHF611载体的连接与转化

将目的基因片段与线性化载体按照浓度比1:3连接，连接的反应体系为20μl。连接体系如下：

将上述反应液混合，进行连接反应，连接温度为50℃，时间为1h。

产物连接结束后，转化大肠杆菌感受态(转化步骤同上)，涂板划线，培养箱37℃倒置过夜培养。(载体转化步骤同敲除载体转化)

7、挑菌

挑取部分菌落至含有卡纳抗生素的LB液体培养基，摇床转速220rpm，温度为37℃，培养16h，摇至菌液浑浊后，使用质粒小提回收试剂盒提取菌液质粒(提取步骤同敲除质粒提取)，之后将质粒送至擎科测序部进行测序，筛选得到含有目的基因的过表达载体。

8、载体转化

载体构建成功后同样将质粒载体送至武汉伯远公司进行遗传转化，转化受体材料为粳稻品种日本晴。

得到过表达转基因植株后，设计潮霉素标记引物，以转基因植株的叶片DNA为模板，检测转基因中是否含有潮霉素标记，检测结果表明阳性率达100％(图7)。将转基因水稻苗种植于湖南农业大学耘园基地，正常水肥管理，正常灌溉措施，获取足量的过表达株系种子。

实施例4

RIF2敲除株系的籽粒粒型分析

田间自然条件下种植RIF2敲除纯合株系与野生型日本晴植株。同期收获成熟的突变体与野生型水稻种子，之后对收获的水稻籽粒进行籽粒长度、宽度以及千粒重进行统计分析。

每样品随机挑取10粒成熟饱满的谷粒，首尾相接，不留空隙，在坐标纸上排成一行，之后对带有颖壳的水稻籽粒进行拍照考察(图8A、图8B)，同时对脱去颖壳的糙米使用相同的方法也进行水稻粒型的表型考察(图8C、图8D)。之后使用万科考种仪对随机挑选的50粒水稻籽粒以及去除颖壳后糙米的粒长与粒宽进行测量。结果表明，RIF2敲除株系的水稻种子的籽粒长度相较于野生型日本晴的籽粒显著变短(图9A)，籽粒宽差异不显著(图9B)；糙米粒长与野生型日本晴水稻种子相比显著变短(图10A)，籽粒宽与糙米宽无显著差异(图10B)；与野生型相比，RIF2两个突变体株系的千粒重显著下降(图11)。

实施例5

RIF2敲除株系种子发芽表型鉴定

1)选取同一时期收获的RIF2纯合突变体与野生型的成熟度一致且饱满度良好的水稻种子，使用40℃烘箱将种子烘干，破除种子休眠后，选取50粒健康饱满的成熟种子，在蒸馏水中浸泡24h后(每隔12h换一次水)均匀排列于已浸湿的两层发芽纸上，种子间间距约2cm，然后在上层盖上一层发芽纸,卷成宽松纸卷,两端用皮筋扣住，套上半封口的一次性塑封袋,直立放置于光照培养箱(发芽箱温度30℃，16h光照、8h黑暗)中，并设置3次生物学重复。

2)以胚根超过整粒种子长且胚芽超过半粒种子长为标准来判断种子是否完成发芽，在放入培养箱后，每隔24小时统计种子发芽数，计算当天种子发芽率，连续考察七天。发芽率为每天总的的发芽数除以水稻种子总数的百分值。发芽指数是衡量种子萌发速度和能力的重要指标，与种子活力正相关，计算方式为：GI＝∑(Gt/Dt)式中Dt为发芽日数，Gt为与Dt相对应的每天发芽种子数；活力指数计算方式为：VI＝GI×S,式中S第七天种子幼苗单株长度。根长与芽长代表种子生物量，根长与芽长越长种子整体苗长越长，种子活力越高。

3)选取合适的时间进行拍照

通过对野生型日本晴与RIF2敲除株系CRRIF2-1、CRRIF2-2纯合株系的种子进行发芽实验并对表型拍照观察。连续7天动态考察种子发芽表型，结果发现，CRRIF2-1、CRRIF2-2的种子七天动态发芽率(图12)、活力指数(图13)与发芽指数(图14)显著高于野生型；连续七天对同一时间萌发的突变体与野生型种子的发芽状态进行考察，每天进行拍照考察(图15)，并对同一天发芽的种子进行每天根长与芽长的测量，通过绘制根长(图16)与芽长的动态折线图发现(图17)：与野生型日本晴的种子发芽的根长与芽长相比，突变体株系的种子萌发七天后有更长的根长与芽长，说明突变体株系的种子具有更强的活力。

实施例6

RIF2过表达株系的籽粒粒型分析

提取野生型与RIF2过表达株系成熟种子胚的RNA后反转录获得cDNA(方法同上)。设计RIF2定量引物，DLF:TTCAGCAGATTTGGGAAGTTTG(SEQ ID NO.18)；DLR：TTGGGTTGAAGTTAAGCAACTG(SEQ ID NO.19)。通过qRT-PCR方法(两步法)，检测转基因株系RIF2的表达量。

qRT-PCR体系：模板cDNA(稀释10倍)1μl，DLF(SEQ ID NO:18)0.5μl，DLR(SEQ IDNO:19)0.5μl，2×RealStar Fast SYBR MIX 10μl(北京康润生物公司),ddH

每个样本设置三个生物学重复进行扩增。荧光定量采集的数据结果依照2

选取RIF2表达量显著升高的两个株系，OERIF2-1、OERIF2-2，表达量如图18所示，在海南加繁一代获取足量的转基因种子后进行后续种子粒型表型验证。

每样品随机挑取10粒成熟饱满的谷粒，首尾相接，不留空隙，在坐标纸上排成一行，之后对带有颖壳的水稻籽粒进行拍照考察(图19A、图19B)，同时对脱去颖壳的糙米使用相同的方法也进行水稻粒型的表型考察(图19C、图19D)。之后使用万科考种仪对随机挑选的50粒水稻籽粒以及去除颖壳后糙米的粒长与粒宽进行测量。结果表明，RIF2过表达株系的水稻种子的籽粒长度相较于野生型日本晴的籽粒显著变长(图20A)，籽粒宽差异不显著(图20B)；糙米粒长与野生型日本晴水稻种子相比显著变长(图21A)，籽粒宽与糙米宽无显著差异(图21B)；与野生型相比，RIF2两个过表达株系的千粒重显著上升(图22)。

实施例7

RIF2过表达株系的种子发芽表型鉴定

1)选取同一时期收获的RIF2过表达与野生型的成熟度一致且饱满度良好的水稻种子，使用40℃烘箱将种子烘干，破除种子休眠后，选取50粒健康饱满的成熟种子，在蒸馏水中浸泡24h后(每隔12h换一次水)均匀排列于已浸湿的两层发芽纸上，种子间间距约2cm，然后在上层盖上一层发芽纸,卷成宽松纸卷,两端用皮筋扣住，套上半封口的一次性塑封袋,直立放置于光照培养箱(发芽箱温度30℃，16h光照、8h黑暗)中，并设置3次生物学重复。

2)以胚根超过整粒种子长且胚芽超过半粒种子长为标准来判断种子是否完成发芽，在放入培养箱后，每隔24小时统计种子发芽数，计算当天种子发芽率，连续考察七天。发芽率为每天总的的发芽数除以水稻种子总数的百分值。发芽指数是衡量种子萌发速度和能力的重要指标，与种子活力正相关，计算方式为：GI＝∑(Gt/Dt)式中Dt为发芽日数，Gt为与Dt相对应的每天发芽种子数。根长与芽长代表种子生物量，根长与芽长越长种子整体苗长越长，种子活力越高。

3)选取合适的时间进行拍照

通过对野生型日本晴与RIF2过表达株系OERIF2纯合株系的种子进行发芽实验并对表型拍照观察。连续7天动态考察种子发芽表型，结果发现，过表达株系OERIF2的种子七天动态发芽率(图23)与发芽指数(图24)显著低于野生型；连续七天对同一时间萌发的突变体与野生型种子的发芽状态进行考察，每天进行拍照考察(图25)，并对同一天发芽的种子进行每天根长与芽长的测量，通过绘制根长(图26)与芽长的动态折线图发现(图27)：与野生型日本晴种子发芽过程中的根长与芽长相比，同时间发芽的RIF2过表达株系种子的根长与芽长无显著差异。

最后，还需要说明的是，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者设备所固有的要素。

尽管已描述了本发明的优选实施例，但本领域内的技术人员一旦得知了基本创造性概念，则可对这些实施例作出另外的变更和修改。所以，所附权利要求意欲解释为包括优选实施例以及落入本发明范围的所有变更和修改。

显然，本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和范围。这样，倘若本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其等同技术的范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变型在内。