一种从降香檀气生根中获取含有β-柏木烯和柏木醇的倍半萜类物质的方法

技术领域

本发明属于降香檀技术领域，具体涉及一种从降香檀气生根中获取含有β-柏木烯和柏木醇的倍半萜类物质的方法。

背景技术

降香檀(Dalbergia odorifera T.chen)又名海南黄花梨，是兼具药用和经济价值的珍稀红木。目前，降香檀的野生资源较为稀缺，降香檀成材缓慢，苗木种植业的兴盛仅能初步解决降香檀资源枯竭的问题，还不足以推动下游药物、香料、文玩等产业的发展。因此，缩短降香檀培育周期，挖掘新的药用部位和药用成分对降香檀资源的深度开发十分重要。

将现代农业技术、生物技术引入中药种植业，是进行传统资源保护和新资源开发的有效途径，也可为后续的基础研究提供良好的材料体系。气雾栽培是一种现代农业栽培技术，具有利于根器官的生长发育和培育周期短的优势。目前，我国的气雾栽培产业多集中在蔬菜种植上，对于木本药用植物的培养少见报道，因此，将气雾培引用到降香檀根培养上，是降香檀新资源开发的有益尝试。此外，植物根中的次生代谢物具有多种生物活性，是中药新药开发的一大途径，作为中药降香的基源植物，降香檀幼苗根中的次生代谢物的组成、活性和合成机制也值得我们重点关注，相关问题的探讨将为了解降香檀药效成分，扩大药用部位提供一定的参考。

目前对降香檀化学成分的研究多集中在心材上，相关研究表明，降香檀心材富中含挥发油和黄酮类成分，挥发油的主要成分为反式-橙花叔醇，还包含有(E)-β-金合欢烯、(3Z,6E)-α-法尼烯、没药烯、黄檀素、红没药烯、α-法尼烯、dihydro-3-(2-methyl-2-propenyl)-2,5-furandione7-(2,6-dimethyl-hepta-1,5-dienyl)-3,8,8-trimethyl-bicyclo[4.2.0]oct-2-en木犀草素、2,4-二甲基-2,6-庚二烯醛、(±)α-红没药醇等化合物。值得关注的是，目前关于降香檀幼苗根部化学成分的研究较少，有待进一步补充。

因此，本发明拟以降香檀幼苗气生根为对象，探讨气雾栽培在降香檀资源开发方面的应用前景，同时为了解降香檀药效成分提供参考信息。

发明内容

本发明的目的在于提供一种从降香檀气生根中获取含有β-柏木烯和柏木醇的倍半萜类物质的方法。

本发明的目的还在于提供β-柏木烯或柏木醇在制备具有促进拟南芥生长的试剂中的应用，以及β-柏木烯或柏木醇在制备对肺癌细胞具有抑制作用的药物中的应用。

本发明的上述第一个目的可以通过以下技术方案来实现：一种从降香檀气生根中获取含有β-柏木烯和柏木醇的倍半萜类物质的方法，包括以下步骤：

(S1)选取一年生降香檀土培苗作为移栽苗，剪去全部侧根和部分主根，消毒后洗净，用IBA+NAA蘸根，转入气雾培养体系进行培养，其中前期采用纯水生根诱导培养，后期使用营养液进行营养培养；

(S2)将乙烯利溶液加入气雾培营养液中，对营养培养后的气雾培小苗进行胁迫处理；

(S3)选取胁迫处理后的降香檀气雾苗侧根，冻干后研磨成粉，加入乙酸乙酯涡旋浸提多次，离心取上清液，浓缩后，得待测样品；

(S4)将待测样品采用GC-MS检测，鉴定获得含有β-柏木烯和柏木醇的挥发性物质。

在上述从降香檀气生根中获取含有β-柏木烯和柏木醇的倍半萜类物质的方法中：

可选地，步骤(S1)中消毒采用质量百分含量为0.08～0.12％的KMnO

更佳地，可选地，步骤(S1)中消毒采用质量百分含量为0.10％的KMnO

可选地，步骤(S1)中用浓度为0.8～1.2g/L的IBA+NAA蘸根8～12s，其中IBA与NAA的质量份配比为1：1。

更佳地，步骤(S1)中用浓度为1.0g/L的IBA+NAA蘸根10s，其中IBA与NAA的质量份配比为1：1。

可选地，步骤(S1)中转入气雾培养体系进行培养28～32天，其中前期6～8天采用纯水生根诱导培养，后期剩余天数使用营养液进行营养培养。

更佳地，骤(S1)中转入气雾培养体系进行培养30天，其中前7天采用纯水生根诱导培养，后期23天使用营养液进行营养培养。

可选地，步骤(S1)中营养液为花多多15号营养液，其浓度为0.4～0.6g/L。

更佳地，步骤(S1)中营养液为花多多15号营养液，其浓度为0.5g/L。

可选地，步骤(S2)中将乙烯利溶液加入气雾培营养液的终浓度为4～6wt％，对营养培养后的气雾培小苗进行胁迫处理的时间为13～16天。

更佳地，步骤(S2)中将乙烯利溶液加入气雾培营养液的终浓度为5wt％，对营养培养后的气雾培小苗进行胁迫处理的时间为13～16天。

本发明通过实验结果表明，5wt％的乙烯利可以诱导降香檀气生根中挥发性成分的积累。

可选地，步骤(S2)中所述降香檀气雾苗侧根与乙酸乙酯的用量关系为：1g：4～6mL，浸提温度为3～5℃，每次浸提时间为22～26h，浸提次数为2～4次。

更佳地，步骤(S2)中所述降香檀气雾苗侧根与乙酸乙酯的用量关系为：1g：5mL，浸提温度为4℃，每次浸提时间为24h，浸提次数为3次。

可选地，步骤(S3)中GC-MS检测条件为：色谱柱HP-5ms，30m×0.25mm×0.25μm；起始温度35℃，保持5min，以8℃/min升至300℃，保持5min；进样量1μL；进样口温度250℃；四极杆温度150℃；离子源温度230℃；电离方式EI；电子能量70eV；载气为He，纯度为99.99％，流速为1mL/min；质量扫描范围35～450AMU；溶剂延迟3min，将得到的图谱和质谱数据用Willy和NIST标准质谱库进行搜库对比，定性各组分，并以面积归一化法计算各组分相对含量。

作为本发明一种优选的实施方式，本发明通过培养条件的筛选建立了完整的降香檀气雾培养体系：选取一年生降香檀土培苗作为移栽苗，剪去全部侧根和部分主根，用0.1％ KMnO

其中气雾培养体系可以采用现有技术中公开的常规气雾培养体系，优选采用本申请发明人早期发明的气雾培养体系，申请号为CN202120640461.0等。

本发明的上述第二个目的可以通过以下技术方案来实现：β-柏木烯或柏木醇在制备具有促进拟南芥的生长的试剂中的应用。

可选地，所述β-柏木烯和柏木醇的浓度低于5μmol/L，更佳为5μmol/L。

本发明通过实验对β-柏木烯和柏木醇的促生长活性进行了验证，结果表明，5μmol/L的β-柏木烯和柏木醇可以促进拟南芥的生长，具体表现为总生物量的增加，侧根数目的增多，而且高浓度的β-柏木烯并没有抑制拟南芥的生长，反而起到了促进作用，可以作为生长调节剂使用。

本发明还进一步提供了β-柏木烯或柏木醇在制备对肺癌细胞具有抑制作用的药物中的应用。

可选地，所述β-柏木烯和柏木醇的浓度大于200μmol/L，更佳为400～600μmol/L。

在抗肿瘤方面，本发明择了肺癌株系H1299和A549进行考察，实验结果表明，高浓度(大于200μmol/L，更佳为400～600μmol/L)的β-柏木烯和柏木醇对肺癌细胞有明显的抑制作用，并且抑制效果随着给药时间的增加而增长。

与现有技术对比，本发明具有以下有益效果：

(1)本发明通过激素诱导条件和营养液培养条件的筛选，建立了降香檀气雾培养体系；

(2)本发明还探讨了胁迫诱导降香檀气生根产生挥发性成分的可行性，结果表明，5wt％的乙烯利可以显著促进降香檀气生根中倍半萜成分的积累；

(3)本发明还进一步对β-柏木烯和柏木醇的生物活性进行验证，实验结果表明，低浓度β-柏木烯和柏木醇对拟南芥生长有促进作用，并且高剂量给药可以抑制肺癌细胞的增殖；

(4)因此，本发明通过建立降香檀气雾培养体系，在较短的培养周期内获得大量、优质的气生根，对降香檀气生根进行胁迫处理，初步探究乙烯利对气生根挥发性成分的影响，并验证主要挥发性成分倍半萜类物质β-柏木烯和柏木醇的生物活性。

附图说明

以下通过附图对本发明作进一步的说明。

图1为实施例1中降香檀气雾培移栽前处理；

图2为实施例1中降香檀在不同激素诱导下的生根情况；

图3为实施例1中降香檀在不同种类营养液培养下的生根情况；

图4为实施例1中降香檀在不同浓度营养液培养下的生根情况；

图5为实施例1中采用5wt％乙烯利胁迫的第10天、13天、16天、19天和25天降香檀小苗侧根的生根情况；

图6为实施例1中各样本总离子叠加图；

图7为实施例1中降香檀气生根中的总倍半萜类含量时间变化；

图8为实施例2中β-柏木烯对拟南芥生长的影响，其中(A)图为β-柏木烯促根效果展示图，(B)图为拟南芥主根长度统计图，(C)图为拟南芥侧根数目统计图，(D)图为拟南芥总生物量统计图；

图9为实施例2中柏木醇对拟南芥生长的影响，其中(A)图为β-柏木烯促根效果展示图，(B)图为拟南芥主根长度统计图，(C)图为拟南芥侧根数目统计图，(D)图为拟南芥总生物量统计图；

图10为实施例2中β-柏木烯和柏木醇的抗肺癌活性，其中(A)图为β-柏木烯给药组H1299细胞活力，(B)图为β-柏木烯给药组A549细胞活力，(C)图为柏木醇给药组H1299细胞活力，(D)图为柏木醇给药组A549细胞活力。

具体实施方式

以下采用的原料或试剂，如无特殊说明，均为市售产品或按照常规方法获得。

实施例1

以下原料和设备优选但不限于：

降香檀一年生实生苗购自广州大森林种苗场。

水雾栽培机参阅申请号：CN202120640461.0。

高锰酸钾、吲哚丁酸(IBA，Sigma)、萘乙酸(NAA，Sigma)、花多多1(花多多茵语品牌店)、花多多10(花多多茵语品牌店)、花多多15(咏春园艺)。

1、气雾箱和实生苗的移栽前处理

使用二氧化氯消毒液对定植杯，定植棉进行浸泡消毒，并对气雾箱的箱体及循环系统进行喷雾消毒，之后使用纯水清洗，以使气雾箱内尽可能处于无菌状态。选择生长状态良好的降香檀苗，对小苗进行剪叶，调整株高的处理，并用清水浸泡、清洗小苗的土生根系，之后剪去根系中多余的侧根和部分主根，并将处理好的根系用0.1％ KMnO

降香檀气雾培移栽前处理如图1所示。

2、降香檀气生根的诱导

实验设计了3个激素种类(IBA、NAA、IBA+NAA等质量比例复配)，3个浓度梯度(0.5g/L、1g/L、1.5g/L)共9个诱导处理组，1个空白对照组作为气生根的诱导方案。

具体操作为，将消毒后的降香檀小苗按照实验分组进行激素蘸根处理，处理时间为10s，随后将降香檀小苗转入气雾培养系统进行生根培养，20天后统计生根率(/％)，生根数目(/条)。

降香檀在不同激素诱导下的生根情况如图2所示，在各激素处理组中，IBA+NAA等比例复配组的诱导效果最好，IBA组次之，NAA组稍差，最佳的诱导方案为1.0g/L的IBA+NAA，单株气雾苗生根数目为87.5(75.3～96.3)条，如表1所示。

表1激素诱导生根统计表(M(P25～P75))

3、降香檀气生根的营养液条件筛选

营养液条件的筛选主要涉及营养元素配比和营养液浓度两方面的考量。首先，为探究营养元素配比对降香檀气生根生长的影响，实验选取了花多多通用肥1号，花多多高氮肥10号，花多多高磷肥15号作为研究对象，对降香檀气雾苗进行了为期30天的培养，其中前7天为纯水培养，后23天为0.5g/L的不同种类营养液培养，降香檀在不同种类营养液培养下的生根情况如图3所示。

降香檀在不同浓度营养液培养下的生根情况如图4所示，考察指标包含地下部分，包括总根长、根鲜重。实验对促生长效果最佳的营养液进行浓度筛选，共设计了0.5g/L、1.0g/L和1.5g/L三个浓度，并且尝试将培养周期延长到40天，其中前20天统一加入低浓度(0.1g/L)的营养液进行培养，后20天则加入设计浓度的营养液培养，考察指标包括总根长(/m)和鲜重(/g)。

对于生根数目，总根长和鲜重的统计，实验选择单株重复的生物学统计方法。

结果表明，花多多15号组的培养效果显著优于花多多10号组和花多多1号组，单株气生根的鲜重为0.88(0.71～1.10)g，总根长为3.08(2.27～5.67)m(表2)。

表2营养液种类对气生根生长的影响(M(P25～P75))

营养液浓度对气雾苗的生长十分重要，以磷元素为例，过高浓度的磷元素会对植物产生毒性，抑制植物生长。为得到更好的培养效果，对花多多15号的浓度进行了筛选，考察指标为鲜重和总根长的M(P25～P75)值，实验结果表明，在0.5g/L的培养条件下，降香檀气生根的鲜重为1.84(1.36～2.56)g，总根长为6.41(5.60～8.58)m，培养效果显著高于其它培养组，是较为适合的培养浓度。(表3)。

表3营养液浓度对气生根生长的影响(M(P25～P75))

气雾栽培是一种新型的无土栽培技术，核心环节包括移栽苗的选择，生根诱导和营养培养等。本发明在降香檀的气雾栽培中，实验选择了一年生的降香檀幼苗作为移栽材料，并且保留了部分主根以求缩短气生根发生的时间。

而在生根诱导方面，实验主要评价了IBA、NAA、IBA+NAA等比例复配的诱导效果，最佳的诱导方案为1.0g/L的IBA+NAA。

值得关注的是，在上述三种诱导方案中，NAA处理组的诱导效果较弱，NAA是诱导愈伤组织产生不定根的重要激素，对降香檀气生根的发生过程进行观察，实验发现，降香檀气生根发源于主根的中柱并突破皮层长到气雾环境中，此过程中并无愈伤组织的参与，因此推测降香檀气生根的发生方式是削弱NAA诱导效果的主要原因，在进行诱导激素的选择时应充分考虑到插穗的生根方式，若以根为插穗进行扦插时，应避免单独施用NAA或适当减少NAA在复配激素中的用量。

此外，在营养培养阶段，主要评价了不同元素配比、不同营养液浓度对降香檀气生根生长的影响，实验结果表明，0.5g/L的花多多15号(高磷)水溶肥具有较好的培养效果。磷元素是参与植物能量代谢和核酸代谢的重要元素，可以推动植物的早期发育，由于植物对磷元素的需求会随着生长状态的改变而变化，因此动态调整营养液浓度也将成为后续降香檀培养条件优化的方向。值得关注的是，对降香檀气生根长周期(40天)培养过程进行观察，随着培养时间的延长部分气生根出现了不同程度的染菌和老化，这对后续实验的开展十分不利，因此，实验将最终的培养周期缩短到了30天。

综上，实验通过培养条件的筛选建立了完整的降香檀气雾培养体系，具体如下，选取一年生降香檀土培苗作为移栽苗，剪去全部侧根和部分主根，用0.1％KMnO

4、降香檀气生根的胁迫处理

将40wt％的乙烯利溶液加入气雾培营养液中，调整浓度至5wt％，之后对已生长30天的气雾培小苗施加该营养液进行胁迫处理，为保证乙烯利浓度，期间每3天更换一次营养液，并于胁迫的第10天、13天、16天、19天和25天进行取样和化学检测，每组胁迫样品为3株小苗侧根的混样，生根情况如图5所示。

5、样品制备

取样：挑选3株胁迫处理后的降香檀气雾苗，洗净侧根，用滤纸吸干水分后，迅速剪下放于冻存管中，液氮速冻10min并置于-80度冰箱以待后续检测。

样品制备：将低温冻存的样品用液氮研磨成粉，称取1.00g粉末于10mL离心管中，加入5ml乙酸乙酯置于4℃浸提，提取时间为24h，为保证提取效率，期间涡旋3次。待提取结束后，离心并吸取上清液，氮吹仪浓缩至1mL，即得待测样品，实验重复三次。

6、GC-MS检测条件

色谱柱HP-5ms(30m×0.25mm×0.25μm)；起始温度35℃，保持5min，以8℃/min升至300℃，保持5min；进样量1μL；进样口温度250℃；四极杆温度150℃；离子源温度230℃；电离方式EI；电子能量70eV；载气He(99.99％)流速1mL/min；质量扫描范围35～450AMU；溶剂延迟3min。将得到的图谱和质谱数据用Willy和NIST标准质谱库进行搜库对比，定性各组分，并以面积归一化法计算各组分相对含量。

GC-MS检测结果显示，乙烯利诱导了降香檀气生根中倍半萜类成分的积累，并且随着胁迫时间的增长，降香檀气生根中的总倍半萜类含量出现了先上升后下降的趋势变化(图6-7)。其中，(+)-β-柏木烯和柏木醇的结构式如下：

不同胁迫时间倍半萜含量的比较：对各组样本中相对含量大于0.5％的倍半萜成分进行汇总分析，实验筛选到了包括β-柏木烯和柏木醇的17种倍半萜类物质，从整体上看，胁迫16天处理组所诱导出的倍半萜种类最丰富且含量最高，胁迫13天次之。

表4降香檀气生根倍半萜成分比较

本发明采用5wt％的乙烯利对降香檀气生根进行了胁迫处理和挥发性成分检测，以期为后续降香檀气生根资源的深度开发提供参考。实验结果表明，乙烯利胁迫促进了降香檀气雾苗的衰老，具体表现为落叶，根部黄化，并且随着胁迫时间的增加降香檀气生根中的倍半萜总含量出现了先上升后下降的趋势变化。

实施例2

在实施例1中获得的17种倍半萜类物质中，筛选其中两种具有较好应用前景的成分β-柏木烯和柏木醇进行功效实验，其中β-柏木烯和柏木醇可通过将实施例1中的上清液经柱层析，经洗脱液洗脱，对子馏分进行柱层析经色谱鉴定后分离获得，由于实施例1中获取的β-柏木烯和柏木醇份量很少，此处采用β-柏木烯和柏木醇标准品代替实施例1中分离获得的β-柏木烯和柏木醇进行以下实验：

其中：野生型拟南芥(Arabidopsis thaliana(L.)Heynh)的种子获赠于广州中医药大学何瑞老师课题组；H1299和A549细胞株系获赠于广州中医药大学刘永强老师课题组，β-柏木烯标品(普思科技)、柏木醇标品(麦克林)。

数据统计与分析：实验数据使用Excel 2019进行初步整理，并用SPSS26.0软件进行Shapiro-Wilk正态分布检验，随后对满足正态分布和方差齐性的数据进行单因素方差分析，多重比较采用LSD检验，所有结果以均值±标准差表示。对不符合正态分布的比较组进行独立样本克鲁斯卡尔-沃利斯检验(Kruskal-Wallis H Test)，结果以M(P25～P75)表示。此外，用GraphPad Prism 8进行统计图的绘制。

2.1拟南芥的药物共培养

采用药物共培养的方法评价β-柏木烯和柏木醇对拟南芥生长的影响。首先，将β-柏木烯加到灭菌后的1/2MS培养基中配制成终浓度为0μmol/L、5μmol/L、10μmol/L、15μmol/L、20μmol/L、25μmol/L、100μmol/L、300μmol/L的给药平板，然后用2％的NaClO对拟南芥的种子进行浸泡消毒，消毒时间为15min，接着用无菌水洗种6次以保证无NaClO残留，最后将处理好的种子接种到给药平板上，4℃春化两天，光照培养箱中培养15天。培养结束后，统计各处理组中拟南芥小苗的主根长(/cm)，侧根数目(/条)和总生物量(/mg)。实验选择单株重复的生物学统计方法，即在每个处理组中筛选出10个最具代表性的样本进行指标统计。柏木醇的操作同β-柏木烯。

2.2β-柏木烯和柏木醇对拟南芥生长的影响

在β-柏木烯处理组中，5μmol/L、10μmol/L、15μmol/L、100μmol/L、300μmol/L的给药浓度显著促进了拟南芥侧根的发生，并提高了植株的总生物量，其中最佳的浓度是5μmol/L，拟南芥的侧根数可达到39.50(27.50～51)条，总生物量可达到14.90(12.05～24.63)mg(图8)。

而在柏木醇处理组中，仅5μmol/L的药物浓度对拟南芥的生长起到了的促进作用，但作用效果不显著，此时拟南芥的侧根数目为19.5(8.75～27.25)条，总生物量为11.5(6.70～18.33)mg，并且当柏木醇浓度大于15μmol/L时，拟南芥主根的生长会受到显著抑制；大于50μmol/L时，拟南芥侧根的发生和植株总生物量会受到显著抑制(图9)。

2.3MTT法评价抗肺癌活性

采用MTT法评价β-柏木烯和柏木醇对细胞株系H1299、A549增殖的影响，进而探究两药的抗肺癌活性，实验分为空白组，对照组和给药组，每组处理3重复，具体的实验操作如下：

取处于对数生长期的两个细胞进行消化重悬，并通过细胞计数调整悬液浓度至8×10

2.4β-柏木烯和柏木醇的抗肺癌活性

MTT检测结果表明，大于200μmol/L尤其是400～600μmol/L的β-柏木烯和柏木醇可以显著抑制肺癌细胞H1299和A549的增殖，并且延长给药时间可以增强抑制效果(图10)。半数抑制浓度的计算结果显示，β-柏木烯对H1299和A549的半数抑制浓度分别为1043.644μmol/L和461.749μmol/L；柏木醇对H1299和A549的半数抑制浓度分别为147.463μmol/L和202.516μmol/L，相比之下，柏木醇的抗肺癌活性更好。

因此，本实施例对降香檀幼苗根部关键的次生代谢物β-柏木烯以及相关化合物柏木醇的生物活性进行了探讨，主要包括生长调节能力的评价和抗肿瘤能力的评价两部分。首先，在生长调节方面，实验对β-柏木烯和柏木醇的促生长活性进行了验证，结果表明，低于5μmol/L的β-柏木烯和柏木醇可以促进拟南芥的生长，具体表现为总生物量的增加，侧根数目的增多。高浓度的β-柏木烯并没有抑制拟南芥的生长，反而起到了促进作用。其次，在抗肿瘤方面，选择了肺癌株系H1299和A549进行考察，实验结果表明，高浓度的β-柏木烯和柏木醇对肺癌细胞有明显的抑制作用，并且抑制效果随着给药时间的增加而增长。

上述实施方式仅为本发明的优选实施方式，不能以此来限定本发明保护的范围，本领域的技术人员在本发明的基础上所做的任何非实质性的变化及替换均属于本发明所要求保护的范围。