一种青光眼非人灵长类动物模型的构建方法

技术领域

本发明属于生物医药技术领域，涉及一种实验动物疾病模型的构建方法，特别是涉及一种青光眼非人灵长类动物模型的构建方法。

背景技术

青光眼(Glaucoma)是一组以视乳头萎缩及凹陷、视野缺损及视力下降为共同特征的疾病，病理性眼压增高、视神经供血不足是其发病的原发危险因素，视神经对压力损害的耐受性也与青光眼的发生和发展有关。在房水循环途径中任何一环发生阻碍，均可导致眼压升高而引起的病理改变，但也有部分患者呈现正常眼压青光眼。是导致人类失明的三大致盲眼病之一。青光眼的发病机制至今尚未完全阐明，而对青光眼患者研究具有很大的局限性，因此通过动物模型研究其机制和防治是一种有效的研究手段。

目前，最经典的非人灵长类青光眼模型是激光激射小梁网诱导的青光眼模型。该模型具有非侵入性、炎症反应轻等特点，但缺点是需要反复多次造模达到持续性高眼压，实验周期长，而且实验仪器的成本也较高。

现有记载中，专利文献CN102229959A中记载了一种原发性开角型青光眼致病基因动物模型及其构建方法，将人OPTN(E50K)突变基因克隆到带有视网膜启动子c-kit的表达载体中，构建得到重组哺乳动物表达载体，然后将重组哺乳动物表达载体导入到小鼠体内，筛选鉴定获得转基因小鼠。专利文献CN105943186A中记载了一种慢性高眼压动物模型的建立方法，通过手术放置材料堵塞其房水流出通道，造成眼压升高视神经损害的青光眼动物模型，使升高的眼压维持稳定，更加易于获得和操作，得到的模型眼压升高稳定、波动小，高眼压持续时间长，目标眼压可控等优点。但这些方法有其明显的缺陷，首先转基因小鼠模型所涉及的基因技术复杂，技术壁垒高，成本高昂，操作难度大，成功率低。除灵长类动物外，大多数动物的房角结构都明显不同于人的房角结构，从种系发育角度啮齿目(鼠)相差更大。小鼠的眼球过小难于进行常规的眼科检查，眼压变化及病理进展缺乏数据支撑，目前这种模型尚在研究摸索中，且不成熟，以至难于应用眼科用药的评价。其次通过手术放置特殊材料堵塞小梁网的青光眼模型所涉及的手术需要专业眼科显微镜辅助，专业性高，技术难度大，成功率低，手术风险大容易造成感染出血，专利中涉及的手术细节(纤维导管插入schlemm管并做360度或270度绕行)更是难于实现，而且极容易造成脉络膜损伤，插入的聚丙烯材料容易造成过敏反应导致前房浑浊和炎性渗出，进而影响眼科检查，同时因动物眼睛小，手术难度更大，模型成功率难以确定，此专利也缺乏相关眼压数据和临床眼科检查数据支撑，难以应用于药物评价。

非人灵长类动物的眼睛与人眼的结构最为相似，同时由于大动物的眼球体积优势，可以直接应用人的眼科学检测手段。因此用非人灵长类动物做模型相比其它实验动物(啮齿动物)能更好的模拟临床青光眼病程的发生、发展，和其他动物相比，研究结果也最易推广到人，对人类疾病的临床诊断和治疗有直接指导意义。

前房注射外来物诱导青光眼在啮齿类和灵长类动物中有广泛应用，外来物质有很多比如，糜蛋白酶、甲基纤维素、复方卡波姆、乳胶微球、磁珠、透明质酸钠、血影细胞等；上述外来物诱导的青光眼主要缺陷为：外来物附着角膜、漂浮前房或覆盖瞳孔；会引起前房炎症反应，有炎性渗出物，导致前房浑浊；最终导致影像学检查受阻，无法清晰检查眼底变化；可导致眼前节病变：虹膜周边与后部小梁网发生前粘连、角膜周围新生血管、虹膜萎缩、虹膜晶状体粘连、色素沉积于角膜内皮和晶状体表面等；其他方法诱导的青光眼，需要多次注射且眼压不稳定或者持续时间短暂，同时多次注射会引起角膜损伤和感染风险。

发明内容

本发明的主要目的是提供一种青光眼非人灵长类动物模型的构建方法，以解决背景技术中存在的问题。

为实现以上目的，本发明提供以下技术方案：

一种青光眼非人灵长类动物模型的构建方法，包括以下步骤：

A、对非人灵长类动物的眼球前房注射乳化硅油；

B、7-8周后检测，即构建得到青光眼非人灵长类动物模型。

进一步的，所述乳化硅油的直径为4-10μm，粘度为800mPa.s。

进一步的，步骤A中，所述乳化硅油按质量百分比由：4.5％二甲基硅油、0.027％油酸、0.115％甘油、0.75％吐温20、0.0005％EDTA，余量为超纯水构成。

进一步的，本发明提供的乳化硅油的制备步骤为：

S1：二甲基硅油、油酸混合组成油相；甘油、吐温20、EDTA、超纯水混合组成为水相；

S2：两相分别加热55-65℃后，将水相少量多次地加入油相中手动搅拌均匀；

S3：在高速搅拌下混合高速剪切10000-20000rpm，总计时间10-20分钟；

S4：利用NaOH调整乳化硅油的pH到7.5-8.5；

S5：吸走软磷脂所在下层水溶液，加入等体积超纯水，离心分层后再吸走下层；重复10-15次后吸走游离的软磷脂，吸走下层水层，留下硅油层作为初乳；

S6：观察初乳性状，检测，得硅油滴直径为4-10μm。

优选的，步骤A中，所述乳化硅油稀释≥8倍使用，注射次数为>1次。

优选的，步骤A中，所述乳化硅油的注射次数为大于1次时，每次注射间隔时间为≥1周。优选的，所述每次乳化硅油的注射量为≥50μl。

进一步的，本发明所述非人灵长类动物包括食蟹猴、恒河猴或狨猴等。本发明构建获得的青光眼动物模型可以应用在青光眼治疗药物评价中。

与现有技术相比，本发明具有如下的有益效果：

本发明通过采用特定乳化方法制备出大小适中的乳化硅油阻塞小梁网，进而诱导出眼压稳定的青光眼模型；乳化方法简单，成本低，质控稳定；乳化硅油密度适中具有良好分散性，不会聚集成团阻塞瞳孔或附着角膜；乳化硅油直径大小适合小梁网孔，少次注射即可完全阻塞小梁网引起稳定持续的理想眼压；乳化硅油免疫原性低，不会引起前房炎性反应；单次注射量和注射频率可以控制目标眼压和持续时间，进而模拟急性和慢性开角型原发性青光眼；有持续眼压数据和临床影像学(OCT,ERG，眼底镜，超声)支撑，重复性和成功率高。

本发明的动物模型与传统模型相比，不需要反复使用昂贵的造模仪器，也不需要对动物进行多次造模造成动物的反复损伤，使用的试剂成本低廉易得，造模时间短，可以极大的节约人力、物力及时间成本，降低新药总体临床前阶段研发费用。

附图说明

图1不同只食蟹猴(动物1、2、3)右眼前房三次注射10倍稀释乳化硅油50μl与左眼的眼压变化图；

图2降眼压药噻吗洛尔使用后对模型的降压效果图；

图3食蟹猴右眼前房四次注射20倍稀释乳化硅油50μl与左眼的眼压变化图；

图4食蟹猴右眼前房四次注射7倍稀释乳化硅油50μl与左眼的眼压变化图；

图5食蟹猴1号模型眼压升高后光学相干断层扫描(OCT)的结果图；

图6食蟹猴2号模型眼压升高后光学相干断层扫描(OCT)的结果图；

图7食蟹猴3号模型眼压升高后光学相干断层扫描(OCT)的结果图；

图8食蟹猴1号模型眼压升高后眼底镜扫描的结果图；

图9食蟹猴2号模型眼压升高后眼底镜扫描的结果图；

图10食蟹猴3号模型眼压升高后眼底镜扫描的结果图；

图11食蟹猴模型眼压升高后眼电生理学的结果图；(A图代表10倍稀释乳化硅油右眼前房注射后左右眼振荡电位改变图，跟正常左眼相比，右眼振荡电位；B图代表10倍稀释乳化硅油右眼前房注射后左右眼明适应视网膜电图，跟正常左眼相比，右眼振幅明显降低)；

图12 10倍稀释乳化硅油右眼前房注射后小梁网HE染色图；

图13 10倍稀释乳化硅油右眼前房注射后视盘HE染色图；

图14 10倍稀释乳化硅油右眼前房注射后神经纤维层HE染色图。

图15食蟹猴右眼前房四次注射10倍稀释乳化硅油20μl与左眼的眼压变化图；

具体实施方式

下面结合具体实施例和附图对本发明进行详细说明。以下实施例将有助于本领域的技术人员进一步理解本发明，但不以任何形式限制本发明。应当指出的是，对本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进。这些都属于本发明的保护范围。

术语“二甲基硅油”：聚二甲基硅氧烷(Polydimethylsiloxane)是一种疏水类的有机硅物料，也称为二甲基硅油；

术语“油酸”：油酸(Oleic acid)是一种单不饱和Omega-9脂肪酸，存在于动植物体内，化学式C

实施例1

一种青光眼非人灵长类动物模型的构建方法，构建食蟹猴模型，包括以下步骤：

1、按质量百分比：4.5％二甲基硅油、0.027％油酸、0.115％甘油、0.75％吐温20、0.0005％EDTA，余量为超纯水，准备相应质量的乳化硅油制备原料。

2、乳化硅油的制备：二甲基硅油、油酸混合组成油相；甘油、吐温20、EDTA、超纯水混合组成为水相；两相分别加热55-65℃后，将水相少量多次地加入油相中手动搅拌均匀；在高速搅拌下混合高速剪切10000-20000rpm，总计时间10-20分钟；利用NaOH调整乳化硅油的pH到7.5-8.5；吸走软磷脂所在下层水溶液，加入等体积超纯水，离心分层后再吸走下层；重复10-15次后吸走游离的软磷脂，吸走下层水层，留下硅油层作为初乳；观察初乳性状，检测，得硅油滴直径为4-10μm，紫外线灭菌后备用。

3、将上述制备获得的乳化硅油使用水稀释10倍，获得粘度为800mPa.s的乳化硅油，进行食蟹猴眼部前房注射，乳化硅油的注射次数为1-3次，乳化硅油的注射次数为大于1次时，每次注射间隔时间为1-2周，单次乳化硅油的注射量为50-200μl，优选为注射3次，单次注射量50μl，7-8周后检测，即构建得到青光眼非人灵长类动物模型。

对比例1

其他步骤同实施例1，区别在于注射次数为：4次，注射量为：20ul。

对比例2

其他步骤同实施例1一致，区别在于，将制备获得的乳化硅油稀释7倍，粘度为625mPa.s的乳化硅油注射次数为4次，注射量为50ul。

对比例3

其他步骤同实施例1一致，区别在于，将制备获得的乳化硅油稀释20倍，获得粘度为432mPa.s的乳化硅油注射次数为4次，注射量为50ul。

表1不同实施例和对比例建模效果

试验例

1.乳化硅油制备

a)全程操作避免强光直射，尽量避免空气混合；

b)二甲基硅油(45g)、油酸(0.27g)混合组成油相；甘油(1.15g)、吐温20(7.5g)、EDTA(0.005g)、超纯水(100mL)混合组成为水相；

c)二甲基硅油和油酸在55-65℃两相加热后，甘油、吐温20、EDTA、超纯水混合组成为水相，将水相少量多次地加入油相中手动搅拌均匀，(加一点水后搅拌均匀再加下一次水，至少分5次加水，10-20分钟充分搅拌均匀)；

d)在高速搅拌下混合高速剪切(10000-20000rpm)，总计时间10-20分钟；e)利用NaOH调整乳剂pH到7.5-8.5；

f)吸走软磷脂所在下层水溶液，加入等体积超纯水，离心分层后再吸走下层；

重复10-15次后吸走游离的软磷脂，吸走下层水层，留下硅油层作为初乳；g)观察初乳性状，确认分散性；显微镜下观察硅油滴大小，得硅油滴直径为4-10μm；

h)初乳用紫外辐照灭菌，使用前4℃分装保存。

2.前房注射：

a)动物舒泰全身诱导麻醉后，利多卡因眼球表面麻醉加异氟烷呼吸麻醉，眼睑撑开；

b)聚维碘酮冲洗眼球及结膜消毒，生理盐水冲洗清洁；

c)20G针穿过颞侧角膜缘和巩膜交界处的角膜层，到达前房；

d)将50微升10倍稀释的乳化硅油注射进前房；

e)固定注射器在合适的位置，稳定针头，松开针座判断无明显回弹即可抽离注射器，并用棉签按压注射点以减少硅油渗漏；

f)抗生素软膏涂抹眼睛局部给药，防止感染；

g)注射频率：眼压升高前每1-2周一次，眼压降低到正常值继续硅油前房注射。

3.IOP(眼压)检测：

a)根据产品说明，使用iCare眼压仪监测双眼眼压，每次均需要反复测量3次，取平均值(所有数值均需记录)；如出现某一次明显过高/低的眼压值(+-30％以上)则增加1次测量；

b)注意iCare眼压计测量探头的使用次数和更换频率；

c)早上固定时间点(8-9am)，动物舒泰诱导麻醉后，利多卡因前房点滴加异氟烷呼吸深度麻醉；

d)IOP检测：眼压每周三次。

4.影像学

a)光学相干光断层成像(OCT)检查：视网膜断层扫描(OCT)：水平、放射、环行扫描方式检查视盘深浅对比，盘沿面积、杯/盘面积比、视杯形成测量指数、视网膜神经纤维层厚度、视野检测、视盘内血管扭曲程度；

b)眼底镜：视网膜动脉损伤；

c)裂隙灯：角膜和前房结构。

5.神经电生理学：闪光视网膜电图(FERG)

闪光视网膜电图(flash electroretinogram，FERG)是视网膜神经元受到光刺激时，在角膜端纪录到的一组电位变化，它的波形产生，是视网膜多种神经元共同作用的结果。

6.病理：

造模(眼压升高)6周后，动物摘取眼球，福尔马林固定液固定，HE染色。

原发性开角型青光眼其特点是眼压虽然升高，房角始终是开放的，即房水外流受阻于小梁网-Schlemm管系统，组织学检查提示小梁网增厚，网眼变窄或闭塞，Schlemm管壁内皮细胞的空炮减少等病理改变。临床主要表现为眼压偏高，随病情发展眼压逐渐增高，眼前段前房深浅正常或较深，房角开放，视网膜神经纤维层缺失等。

建模结果如下：

图1是三只食蟹猴造模过程中眼压的变化图,第一只动物眼压变化图，动物右眼前房三次注射10倍稀释硅油后眼眼压缓慢升高到50mmHg，随后缓慢下降到正常眼压后第四次前房给予10倍稀释硅油眼压再次缓慢升高至40mmHg左右；第二只动物眼压变化图，动物右眼前房三次注射10倍稀释硅油后眼眼压缓慢升高到60mmHg，随后缓慢下降到正常眼压后第四次前房给予10倍稀释硅油眼压再次缓慢升高至35mmHg左右；第三只动物眼压变化图，动物右眼前房两次注射10倍稀释硅油后眼压缓慢升高到55mmHg，之后眼压一直稳定维持在30mmHg之上。

图2是第四只食蟹猴眼压变化及降眼压药噻吗洛尔的降压效果图，动物右眼前房两次注射10倍稀释硅油后眼压缓慢升高并维持在33mmHg；注射后的29天开始给降眼压药(一次一滴，一天两次)，给药后眼压缓慢下降至正常值，表明药物具有良好降压效果。

图3是第五只食蟹猴20倍稀释硅油注射50ul后眼压变化图，动物右眼前房在同样的时间点四次注射20倍稀释硅油后眼压依然维持在正常范围，表明20倍稀释硅油无法诱导高眼压。

图4是第六只食蟹猴7倍稀释硅油注射50ul后眼压变化图，动物右眼前房在同样的时间点四次注射7倍稀释硅油后眼压依然维持在正常范围，表明7倍稀释硅油无法诱导高眼压。

图15是第七只食蟹猴10倍稀释硅油注射20ul后眼压变化图，动物右眼前房在同样的时间点四次注射10倍稀释硅油后眼压依然维持在正常范围，表明10倍稀释硅油注射20ul同样无法诱导高眼压。

综上7只动物的眼压结果表明，适量10倍稀释乳化硅油可以诱导出高眼压，而7倍和20倍稀释乳化硅油对眼压无影响，同时表明噻吗洛尔具有明显降压效果也同时说明10倍稀释乳化硅油诱导的青光眼模型可以用于临床用药评价。

图5、6、7是上述第1到3只食蟹猴的OCT结果，其中1号动物是10倍稀释乳化硅油右眼前房注射后视神经纤维层厚度的改变，结果显示右眼鼻侧神经纤维层明显变薄；食蟹猴2号结果显示右眼鼻侧、鼻上侧及颞上侧神经纤维层明显变薄；食蟹猴3号结果显示除右眼鼻下侧外，其他区域神经纤维层明显变薄，综上三只动物OCT结果表明，10倍稀释乳化硅油可以诱导高眼压伴视神经层改变的青光眼模型。

图8、9、10是上述第1到3只食蟹猴的眼底镜结果，其中食蟹猴1号是10倍稀释乳化硅油右眼前房注射后前房、虹膜、角膜和玻璃体的改变，结果显示跟正常左眼对比，右眼前房角被硅油广泛堵塞，但前房清亮无炎性渗出，角膜折光正常，虹膜玻璃体无炎性改变；食蟹猴2号结果显示跟正常左眼对比，右眼前房角被硅油广泛堵塞，但前房清亮无炎性渗出，角膜折光正常，虹膜玻璃体无炎性改变；食蟹猴3号结果显示跟正常左眼对比，右眼前房角被硅油广泛堵塞，但前房清亮无炎性渗出，角膜折光正常，虹膜玻璃体无炎性改变；综上三只动物眼底镜结果表明，10倍稀释乳化硅油可诱导高眼压青光眼模型，但不会引起炎症等不良反应。

图11中A图是10倍稀释乳化硅油右眼前房注射后左右眼振荡电位改变图，跟正常左眼相比，右眼振荡电位，图11中B图是10倍稀释乳化硅油右眼前房注射后左右眼明适应视网膜电图，跟正常左眼相比，右眼振幅明显降低；综上电生理学结果表明，10倍稀释乳化硅油可诱导高眼压伴电生理改变的青光眼模型

图12、13、14是食蟹猴青光眼模型眼压升高后小梁网、视盘和神经纤维层的病理变化结果图，图12中A1是10倍稀释乳化硅油右眼前房注射后HE染色图，10倍放大图显示右眼前房角硅油广泛阻塞小梁网造成房水流出受阻进而引起眼压升高；图12中A2是10倍稀释乳化硅油右眼前房注射后视盘HE染色图，结果显示右眼视盘周边神经纤维层明显消失；图13结果显示右眼神经节细胞层细胞数量明显减少，图14结果显示右眼神经节细胞层细胞变性。

以上眼压和病理数据结果显示，通过右前房适量多次注射10倍稀释乳化硅油可以广泛阻塞小梁网导致房水流出通道受阻进而可引起持续性高眼压，同时眼底镜结果显示前房角正常，前房清亮无浑浊，角膜、虹膜、玻璃体无炎性反应，病理、OCT和视网膜电图结果显示视神经纤维层明显变薄及变性并伴有视野缺损且符合临床特点的的开角型青光眼模型，且通过肾上腺能受体阻滞剂噻吗洛尔三周连续治疗可以明显抑制房水生成降低眼压。因此本模型具有贴近临床表现的优势。

本发明具体应用途径很多，以上所述仅是本发明的优选实施方式。应当指出，以上实施例仅用于说明本发明，而并不用于限制本发明的保护范围。对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进，这些改进也应视为本发明的保护范围。