一种神经母细胞瘤恶病质小鼠模型的建立方法

技术领域

本发明涉及恶病质模型技术领域，具体为一种神经母细胞瘤恶病质小鼠模型的建立方法。

背景技术

恶病质，字面意思是“恶劣的状况”，它可发生于多种疾病，包括肿瘤、AIDS、严重创伤、手术后、呼吸不良及严重的败血症等，其中以肿瘤伴发的恶病质最为常见，也称为肿瘤恶病质，恶病质是晚期肿瘤患者常见的临床综合征，会严重影响患者生活质量和治疗效果，增加患者死亡率。

而神经母细胞瘤是儿童最常见的颅外肿瘤，是婴幼儿最常见的肿瘤，它属于神经内分泌性肿瘤，可以起源于交感神经系统的任意神经脊部位。其最常见的发生部位是肾上腺，但也可以发生在颈部、胸部、腹部以及盆腔的神经组织，神经母细胞瘤的初发症状不典型，因此在早期诊断有所困难。比较常见的症状包括疲乏，食欲减退，发烧以及关节疼痛。肿瘤所导致的症状取决于肿瘤所处的器官以及是否发生转移，对于低危组神经母细胞瘤患者(最常见于婴幼儿)，靠单纯的观察或者是手术治疗往往可以取得很好的效果；但是高危组神经母细胞瘤患者，即使综合各种强化的治疗方案，预后仍然不理想。

因此对于神经母细胞瘤的早期确诊及相关药物的使用一直是我们临床实践研究的方向，而目前所使用的诊疗方式基本采用的是体格检查，由于肿瘤起源的部位不同，因此所产生的临床症状也各不相同。比如来源于腹部交感神经的肿瘤患者会表现为出现腹痛、腹泻等症状；实验室检查、疾病早期如果怀疑为神经母细胞瘤的，需要患者完善血液和尿液检查；影像学检查、腹部超声检查可以帮助明确诊断，尤其对于出现反复腹痛、腹胀、腹泻等临床表现，怀疑为神经母细胞瘤的患者行腹部超声检查，可以寻找腹部起源的肿瘤。另外CT检查也是应用较为广泛的检查手段，主要用于寻找腹部、胸部和盆腔的神经母细胞瘤，可以观察肿瘤的位置、数量和体积大小等。而本发明旨在模拟恶病质患者的生理状态，结合病症模型，用于神经母细胞瘤的病理研究及诊断。

发明内容

(一)解决的技术问题

针对现有技术的不足，本发明建立的神经母细胞瘤小鼠模型能够充分地模拟出恶病质的病症特征，可以适用于后期研究神经母细胞瘤恶病质机理研究及治疗研究等领域。

(二)技术方案

为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：一种神经母细胞瘤恶病质小鼠模型的建立方法，包括如下步骤：

(1)材料准备，包括NB细胞和实验小鼠；

(2)构建模型，对实验小鼠进行实验组和对照组的分类，并对实验组进行接种，得到恶病质小鼠模型，小鼠在接种前应在饲养条件下适应一段时间；

(3)动物监测，监测内容包括小鼠体重、肿瘤大小、膳食量及饮水量,接种后每三/四天测一次，从第四次开始，每天进行测试；

所述监测内容还包括小鼠运动功能和生化体现，同时对小鼠进行网格测试，监测其脂肪质量和肌肉质量,得到小鼠行为实验模型。

优选的，恶病质小鼠的判断标准为体重下降、食欲不振、脂肪和肌肉萎缩；实验终点为平均肿瘤直径超过20mm或小鼠体重减少20％或小鼠出现感染、行动迟缓等不良临床表型。

优选的，所述对照组选用6只小鼠，实验组6只小鼠，在实验组小鼠皮下注射神经母细胞瘤细胞，在对照组注射PBS和基质胶溶液，PBS和基质胶溶液各50％。

优选的，从小鼠注射的第三天开始测量摄食量，饮水量，体重，肿瘤体积，中间测量三次的脂肪的具体数据(通过低磁场小动物体成分分析仪)，进行三次小鼠行为实验(网格测试：通过观察小鼠的抓握力度来反馈肌肉的力量)，当小鼠体重减少达到20％或平均肿瘤直径超过20mm时处死，并解剖获取心尖血样本存样，取出肿瘤以及肿瘤间质液存样，将腿部肌肉取下与对照组一起摆放拍照(为了呈现明显的肌肉减少)，取出性腺脂肪，肾周脂肪，腹股沟皮下脂肪以及肠系膜脂肪与对照组摆放一起拍照后存样(以便后期制作脂肪染色的切片，观察脂肪的变化)，最后对所得的数据进行分析并画图。

一种神经母细胞瘤恶病质小鼠模型的建立方法的实验流程，包括如下步骤：

S1，选用AJ雌性小鼠12只，6周龄，体重约为18.5±2.5g；

S2，对S1所用的小鼠中随机选出6只作为实验组在左后方皮下接种神经母细胞瘤细胞(Neuro-2a细胞系)，细胞稀释浓度为106个细胞每毫升溶液(50％PBS，50％基质胶),小鼠接种剂量为每只接种0.1ml，接种过程需要用异氟烷麻醉，剩余6只作为对照组同样在左后方皮下接种50％PBS，50％基质胶溶液0.1ml，无细胞；

S3，对S2小鼠观察三天后按照体重及肿瘤大小进行标记与分笼，标记采用打耳洞法和尾部标记法联用方式；6只对照组，6只实验组选择单笼饲养(每周换一次鼠笼、垫料、饲料与水)；

S4，对S3小鼠以接种细胞第三天为基线用天平测量体重数据(估读到小数点后两位)(对照组、实验组的12只小鼠接种后第3、6、9、12、13、14、15、16、17、18、19天分别测量体重)；

S5，对S3小鼠以接种细胞第三天开始测量肿瘤体积(对照组、实验组的12只小鼠接种后第3、6、9、12、13、14、15、16、17、18、19天分别测量)肿瘤体积测量用游标卡尺，测量指标为：长度和宽度；

S6，对S3小鼠以接种细胞第四天开始测量膳食量与饮水量(对照组、实验组的12只小鼠接种后分别从第4天开始每周测量两次，并分别求出平均值)；

S7，对S3小鼠以接种细胞第三天为基线测试3次肌肉力量测试(即网格测试)，(对照组、实验组的12只小鼠接种后第4、14、18天测试)(注：第3天基线，第14天为小鼠体重下降5-8％，第20天为实验终点)(实验操作：将小鼠放置于网格架中央并翻转后盖于鼠笼底座之上，观察小鼠抓握行为，并记录小鼠掉落时间)；

S8，对S3小鼠以接种细胞第三天为基线进行三次小鼠肌肉和脂肪含量分析(低磁场小动物体成分分析仪)，对照组、实验组的12只小鼠接种后第4、14、20天检测)；

S9，对上述步骤小鼠第20天进行动物解剖，选择两只小鼠拍摄解剖后肌肉脂肪实体照(一只来自对照组，一只来自实验组)，分别取出两只小鼠的性腺，肠系膜，腹股沟皮下及肾周脂肪放置于称量纸指定位置上拍摄对比图，分别取下两只小鼠双侧小腿放置于称量纸上拍摄对比图，其他小鼠不拍照，样品收集同上；

S10，对S4、S5、S6、S7、S8所得的数据整理后采用画图软件画图并进行相应的统计分析。

一种神经母细胞瘤恶病质小鼠模型的建立方法所建立的模型能够充分地模拟出恶病质的病症特征，可以适用于后期研究神经母细胞瘤恶病质机理研究及治疗研究。

(三)有益效果

与现有技术相比，本发明提供了一种神经母细胞瘤恶病质小鼠模型的建立方法，具备以下有益效果：本发明采用实验组和对照组的方式建立恶病质小鼠模型，并监测接种后小鼠的一系列状况得到小鼠行为实验模型，通过模型数据的反馈结果能够模拟出恶病质的病症特征，为后期研究神经母细胞瘤恶病质机理研究及治疗研究提供很好的临床前模型。

附图说明

图1A为神经母细胞瘤小鼠恶病质模型实验流程图；

图1B为小鼠体重变化折线图；

图1C为小鼠体内脂肪肌肉变化解剖图；

图2A为小鼠两周进食量柱状图；

图2B为小鼠两周饮水量柱状图；

图3A为小鼠总脂肪质量变化折线图；

图3B为小鼠总脂肪含量百分比变化折线图；

图4A为解剖获取的小鼠脂肪对比图；

图4B为小鼠肠系膜、肾周、皮下、性腺四个部位脂肪重量柱状图；

图5A为小鼠左右腿比目鱼肌与腓肠肌质量的柱状图；

图5B为小鼠肌肉力量测试(网格测试)结果折线图；

具体实施方式

为了更好地了解本发明的目的、结构及功能，下面结合附图，对本发明一种神经母细胞瘤恶病质小鼠模型的建立方法做进一步详细的描述。

本发明拟通过恶病质小鼠模型及小鼠行为实验模型模拟出恶病质的病症特征，可以适用于后期研究神经母细胞瘤恶病质机理研究及治疗研究。

本发明：一种神经母细胞瘤恶病质小鼠模型的建立方法，包括如下步骤：

(1)材料准备，包括NB细胞和实验小鼠；

(2)构建模型，对实验小鼠进行实验组和对照组的分类，并对实验组进行接种，得到恶病质小鼠模型，小鼠在接种前应在饲养条件下适应一段时间；

(3)动物监测，监测内容包括小鼠体重、肿瘤大小、膳食量及饮水量,接种后每三/四天测一次，从第四次开始，每天进行测试；

监测内容还包括小鼠运动功能和生化体现，同时对小鼠进行网格测试，监测其脂肪质量和肌肉质量,得到小鼠行为实验模型。

具体的，本发明一种神经母细胞瘤恶病质小鼠模型的建立方法的实验流程，包括如下步骤：

S1，选用AJ雌性小鼠12只，6周龄，体重约为18.5±2.5g；

S2，对S1所用的小鼠中随机选出6只作为实验组在左后方皮下接种神经母细胞瘤细胞(Neuro-2a细胞系)，细胞稀释浓度为106个细胞每毫升溶液(50％PBS，50％基质胶),小鼠接种剂量为每只接种0.1ml，接种过程需要用异氟烷麻醉，剩余6只作为对照组同样在左后方皮下接种50％PBS，50％基质胶溶液0.1ml，无细胞；

S3，对S2小鼠观察三天后按照体重及肿瘤大小进行标记与分笼，标记采用打耳洞法和尾部标记法联用方式；6只对照组，6只实验组选择单笼饲养(每周换一次鼠笼、垫料、饲料与水)；

S4，对S3小鼠以接种细胞第三天为基线用天平测量体重数据(估读到小数点后两位)(对照组、实验组的12只小鼠接种后第3、6、9、12、13、14、15、16、17、18、19天分别测量体重)；

S5，对S3小鼠以接种细胞第三天开始测量肿瘤体积(对照组、实验组的12只小鼠接种后第3、6、9、12、13、14、15、16、17、18、19天分别测量)肿瘤体积测量用游标卡尺，测量指标为：长度和宽度；体积计算公式为：长*宽2/2；

S6，对S3小鼠以接种细胞第四天开始测量膳食量与饮水量(对照组、实验组的12只小鼠接种后分别从第4天开始每周测量两次，并分别求出平均值)；分析值，测量一周进食量和饮水量的差值，再算出每天的平均值(g/mouse/day)；

S7，对S3小鼠以接种细胞第三天为基线测试3次肌肉力量测试(即网格测试)，(对照组、实验组的12只小鼠接种后第4、14、18天测试)(注：第3天基线，第14天为小鼠体重下降5-8％，第20天为实验终点)(实验操作：将小鼠放置于网格架中央并翻转后盖于鼠笼底座之上，观察小鼠抓握行为，并记录小鼠掉落时间)；

S8，对S3小鼠以接种细胞第三天为基线进行三次小鼠肌肉和脂肪含量分析(低磁场小动物体成分分析仪)，对照组、实验组的12只小鼠接种后第4、14、20天检测)；

S9，对上述步骤小鼠第20天进行动物解剖，选择两只小鼠拍摄解剖后肌肉脂肪实体照(一只来自对照组，一只来自实验组)，分别取出两只小鼠的性腺，肠系膜，腹股沟皮下及肾周脂肪放置于称量纸指定位置上拍摄对比图，分别取下两只小鼠双侧小腿放置于称量纸上拍摄对比图，其他小鼠不拍照，样品收集同上；

S10，对S4、S5、S6、S7、S8所得的数据整理后采用画图软件画图并进行相应的统计分析。

进一步的，研究发现整个实验周期内，从图1B可以看出实验组小鼠体重明显低于对照组小鼠体重，实验前期(即接种肿瘤细胞的第三天到第六天)实验组小鼠体重表现出小幅度上升趋势，但整体低于对照组小鼠体重，实验后期(即接种肿瘤细胞第六天后)实验组小鼠体重整体呈明显的下降趋势，对照组小鼠体重比较稳定，在实验后期两组小鼠体重表现出统计学差异(p＝0.0001)。参考图1C，对照组白色脂肪部位有明显萎缩。以上说明实验周期内神经母细胞瘤小鼠恶病质模型的建立是成功的；

参考图2A和图2B，在实验周期内研究发现，第一周实验组和对照组进食量没有显著差异，但是第二周实验组进食量显著低于对照组进食量(图2A，p<0.0001)；到第二周实验组饮水量也显著低于对照组饮水量(图2B，p＝0.0001)；

从实验结果说明恶病质小鼠与正常小鼠比较体重、进食量和饮水量降低，该结果与恶病质患者的体重下降、食欲下降、饮食量降低等症状契合，证明我们的模型能够模拟神经母细胞瘤恶病质患者的体重下降、食欲下降、进食量降低等症状。本发明将根据具体实施例对实验做进一步说明。

实施例1

对照组选用6只小鼠，实验组6只小鼠，在实验组小鼠皮下注射神经母细胞瘤细胞，在对照组注射PBS和基质胶溶液，PBS和基质胶溶液各50％。从小鼠注射的第三天开始测量摄食量，饮水量，体重，肿瘤体积，中间测量三次的脂肪的具体数据(通过低磁场小动物体成分分析仪)。研究发现，整个实验周期内实验组小鼠总脂肪质量低于对照组小鼠总脂肪质量(图3A)，实验组总脂肪质量整体呈下降趋势，对照组总脂肪质量稳定，试验后期表现出统计学差异性(p<0.0001)。整个实验周期内实验组小鼠总脂肪含量低于对照组小鼠总脂肪含量(图3B)，实验组总脂肪含量整体呈下降趋势，对照组总脂肪含量稳定，试验后期表现出统计学差异性(p<0.0001)。

实施例2

进行三次小鼠行为实验(网格测试：通过观察小鼠的抓握力度来反馈肌肉的力量)，当小鼠体重减少达到20％或平均肿瘤直径超过20mm时处死，并解剖获取心尖血样本存样，取出肿瘤以及肿瘤间质液存样，取出性腺脂肪，肾周脂肪，腹股沟脂肪以及肠系膜脂肪与对照组摆放一起拍照后存样，最后对所得的数据进行分析并画图；

解剖小鼠后取出肠系膜脂肪、肾周脂肪、腹股沟皮下脂肪和性腺脂肪实验组小鼠与对照组小鼠对比，肉眼观察实验组小鼠上述各类脂肪均小于对照组小鼠脂肪(图4A)，经称量求均值后发现，实验组小鼠腹股沟皮下、肠系膜、肾周、性腺脂肪重量(图4B)均显著低于对照组(p<0.05)，实验结果具有统计学意义。说明我们建立的模型能够模拟神经母细胞瘤恶病质患者体内脂肪减少的体征，更进一步证明我们的模型建立是成功的。

从图5A的结果表明实验组小鼠比目鱼肌和腓肠肌的质量比对照组小鼠比目鱼肌和腓肠肌质量低(p<0.01)。同时，实验组小鼠肌肉力量相比对照组减弱，表现为小鼠在网格上倒置的时间显著缩短(图5B，p<0.01)。以上说明我们的恶病质小鼠模型能够模拟恶病质的肌肉萎缩的体征。

可以理解，本发明是通过一些实施例进行描述的，本领域技术人员知悉的，在不脱离本发明的精神和范围的情况下，可以对这些特征和实施例进行各种改变或等效替换。另外，在本发明的教导下，可以对这些特征和实施例进行修改以适应具体的情况及材料而不会脱离本发明的精神和范围。因此，本发明不受此处所公开的具体实施例的限制，所有落入本申请的权利要求范围内的实施例都属于本发明所保护的范围内。