一种IgM抗体制剂及其用途

本申请是2023年3月16日提交的，发明名称为“一种IgM抗体制剂及其用途”的中国专利申请202310253628.1的分案申请。

技术领域

本发明属于生物医药技术领域。具体而言，本发明涉及一种IgM抗体制剂及其用途。

背景技术

IgM抗体是在免疫系统接触免疫原后最早表达的抗体，也是分子量最大的一类免疫球蛋白，主要分布在血清中。经典的分泌型IgM通过J链形成五聚体，但也存在不含J链的六聚体形式。额外的结合位点提供了多价的结合能力，因此与IgG抗体相比，它有更高的亲和能力和更广谱的结合性能，能够引发机体更强的抗原中和作用和免疫调理作用。五聚体IgM结构中的J链能够起到稳定抗体结构的作用，其主要功能是通过和聚合免疫球蛋白受体(pIgR)相互作用从而将IgM抗体转运到黏膜表面。因此在相关呼吸道疾病的预防和治疗中，五聚体IgM具有潜在的应用价值。

选择合理的制剂处方对更好地发挥药物疗效至关重要。IgM是一种抗体蛋白，为保证蛋白质的生物学活性，制剂处方必须至少保证蛋白质的氨基酸核心序列的构象完整，同时防止蛋白质发生降解或聚集等化学、物理变化。蛋白聚集作为一个重要的生物药检测指标，在生物制药开发与生产过程中都需要受到严格的控制，因为聚集不仅会影响产品质量，还有可能导致过度的免疫反应。

影响蛋白质聚集的因素有很多，包括蛋白结构、环境温度、生产过程以及缓冲液组成成分等。常规包含轻重链的IgM分子量在900KD左右，即使将抗体可变区替换为只包含重链可变区的纳米抗体，其完整分子量亦可达600KD。巨大的分子量使得IgM分子极不稳定，容易发生聚集，沉降等现象。因此，研究如何提高IgM抗体制剂的稳定性、减少抗体蛋白聚集，对于IgM抗体药物的研发与应用具有重要意义。

发明内容

本申请的目的在于提供一种重组IgM抗体制剂。该制剂使得其中的IgM抗体蛋白具有良好的溶解性和稳定性，能够有效减少IgM抗体蛋白的聚集。

一方面，本发明提供一种IgM抗体制剂，所述制剂包含IgM抗体，所述制剂还包含缓冲剂、稳定剂、渗透压调节剂和表面活性剂中的一种或多种。

在一些实施方案中，所述IgM抗体的浓度为约0.1-50mg/mL。

在一些实施方案中，所述缓冲剂选自醋酸缓冲体系、组氨酸-醋酸缓冲体系、组氨酸-盐酸缓冲体系和枸橼酸缓冲体系。在一些实施方案中，所述缓冲剂的浓度为约2-30mM。

在一些实施方案中，所述稳定剂选自甘露醇、海藻糖、山梨醇、蔗糖、盐酸精氨酸、脯氨酸、甘氨酸和甲硫氨酸。在一些实施方案中，所述稳定剂的浓度为约16-50mg/mL。

在一些实施方案中，所述渗透压调节剂选自葡萄糖、氯化钠、硫酸钠。在一些实施方案中，所述渗透压调节剂的浓度为约40-200mM。

在一些实施方案中，所述表面活性剂选自聚山梨酯20和聚山梨酯80。在一些实施方案中，所述表面活性剂的浓度为约0.04-2mg/mL。

在一些实施方案中，所述制剂的pH为约4.7-7.0。

在一些实施方案中，所述制剂包含：

IgM抗体约1-20mg/mL；

枸橼酸缓冲体系约10-20mM；

山梨醇约20-35mg/mL；

NaCl约40-60mM；

聚山梨酯20约0.2-0.4mg/mL；

和水；并且

所述制剂的pH为约5.6-6.4。

在一些实施方案中，所述制剂包含：

IgM抗体约1mg/mL或约5mg/mL；

枸橼酸缓冲体系约20mM；

山梨醇约30mg/mL；

NaCl约60mM(3.5mg/mL)；

聚山梨酯20约0.3或0.4mg/mL；

和水；并且

所述制剂的pH为约6.0。

在一些实施方案中，所述IgM抗体为纳米抗体融合蛋白形成的IgM抗体，所述纳米抗体融合蛋白为包含纳米抗体和Fc片段的融合蛋白，所述纳米抗体和Fc片段可任选地通过连接基连接。在一些实施方案中，所述IgM抗体为纳米抗体融合蛋白形成的IgM抗体，所述纳米抗体融合蛋白为包含纳米抗体和Fc片段的融合蛋白，其中所述纳米抗体为特异性结合SARS-CoV-2RBD的纳米抗体，所述Fc片段选自人源IgM的Fc片段，所述纳米抗体和Fc片段可任选地通过连接基连接。

在一些实施方案中，所述制剂为鼻喷剂、口服制剂、栓剂或胃肠外制剂的形式。

一方面，本发明提供本发明所述的制剂在制备用于预防或治疗新冠病毒感染的药物中的用途，其中所述新冠病毒为SARS-CoV-2原始毒株和/或SARS-CoV-2变异毒株。

附图说明

图1为纳米抗体融合蛋白形成的IgM结构示意图。

图2为IgM抗体的SDS-PAGE鉴定结果图。

具体实施方式

下面通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案。本领域技术人员应该明了，所述具体实施方式仅仅是帮助理解本发明，不应视为对本发明的具体限制。

另外，为了更好的说明本发明，在下文的具体实施方式中给出了众多的具体细节。本领域技术人员应当理解，没有某些具体细节，本发明同样可以实施。在一些实施例中，对于本领域技术人员熟知的原料、元件、方法、手段等未作详细描述，以便于凸显本发明的主旨。

IgM抗体制剂

本发明涉及一种IgM抗体制剂，所述制剂包含IgM抗体，所述制剂还包含缓冲剂、稳定剂、渗透压调节剂和表面活性剂中的一种或多种。

在一些实施方案中，IgM抗体制剂包含缓冲剂，在任选的实施方案中，所述制剂还包含稳定剂、渗透压调节剂和表面活性剂中的一种或多种。

在一些实施方案中，IgM抗体制剂包含缓冲剂。在一些实施方案中，IgM抗体制剂包含稳定剂。在一些实施方案中，IgM抗体制剂包含缓冲剂和稳定剂。在一些实施方案中，IgM抗体制剂包含缓冲剂、稳定剂和渗透压调节剂。在一些实施方案中，IgM抗体制剂包含缓冲剂、稳定剂、渗透压调节剂和表面活性剂。

本申请通过上述各组分相互配合，从而使IgM抗体在处方中具有良好的溶解性和稳定性，本发明的制剂处方能够有效降低抗体蛋白的聚集倾向，提高储藏有效期。在一些实施方案中，IgM抗体制剂的渗透压接近人体等渗状态，符合制剂渗透压标准，例如，符合鼻制剂渗透压标准，与人体鼻腔内的生理环境更适应，对鼻腔环境的刺激更小，方便患者通过鼻喷给药，让呼吸道快速产生免疫力，交联结合病毒形成聚集颗粒，阻断病毒RBD与ACE2的结合。在一些实施方案中，本发明的IgM抗体制剂在新冠病毒感染的预防及治疗中都有很大的应用潜力。

在一些实施方案中，IgM抗体的浓度为小于或等于约50mg/mL。在一些实施方案中，IgM抗体的浓度为约0.1-50mg/mL。在一些实施方案中，IgM抗体的浓度为约5-50mg/mL。在优选的实施方案中，IgM抗体的浓度为约1-50mg/mL。在优选的实施方案中，IgM抗体的浓度为约0.1mg/mL、0.5mg/mL、1mg/mL、2mg/mL、3mg/mL、4mg/mL、5mg/mL、6mg/mL、7mg/mL、8mg/mL、9mg/mL、10mg/mL、11mg/mL、12mg/mL、13mg/mL、14mg/mL、15mg/mL、16mg/mL、17mg/mL、18mg/mL、19mg/mL、20mg/mL、21mg/mL、22mg/mL、23mg/mL、24mg/mL、25mg/mL、26mg/mL、27mg/mL、28mg/mL、29mg/mL、30mg/mL、31mg/mL、32mg/mL、33mg/mL、34mg/mL、35mg/mL、36mg/mL、37mg/mL、38mg/mL、39mg/mL、40mg/mL、41mg/mL、42mg/mL、43mg/mL、44mg/mL、45mg/mL、46mg/mL、47mg/mL、48mg/mL、49mg/mL和50mg/mL。在优选的实施方案中，IgM抗体的浓度为小于或等于约20mg/mL。在优选的实施方案中，IgM抗体的浓度为约0.1-20mg/mL、1-20mg/mL、1-15mg/mL、1-10mg/mL、1-9mg/mL、1-8mg/mL、1-7mg/mL、1-6mg/mL、1-5mg/mL、1-4mg/mL、1-3mg/mL、1-2mg/mL、5-20mg/mL、5-15mg/mL、5-10mg/mL、5-9mg/mL、5-8mg/mL、5-7mg/mL和5-6mg/mL。在更优选的实施方案中，IgM抗体的浓度为约1-20mg/mL或5-20mg/mL。在最优选的实施方案中，IgM抗体的浓度为约1mg/mL或约5mg/mL。

在一些实施方案中，缓冲剂选自醋酸缓冲体系、组氨酸-醋酸缓冲体系、组氨酸-盐酸缓冲体系和枸橼酸缓冲体系。在优选的实施方案中，缓冲剂选自枸橼酸缓冲体系(例如，枸橼酸-枸橼酸钠缓冲剂)。

在一些实施方案中，缓冲剂的浓度为约2-30mM。在优选的实施方案中，缓冲剂的浓度为约2mM、3mM、4mM、5mM、6mM、7mM、8mM、9mM、10mM、11mM、12mM、13mM、14mM、15mM、16mM、17mM、18mM、19mM、20mM、21mM、22mM、23mM、24mM、25mM、26mM、27mM、28mM、29mM和30mM。在优选的实施方案中，缓冲剂的浓度为约2-25mM、2-20mM、2-15mM、2-10mM、10-30mM、10-25mM、10-20mM、10-15mM、15-30mM、15-25mM、15-20mM、20-30mM、20-25mM和25-30mM。在更优选的实施方案中，缓冲剂的浓度为约10-20mM。在最优选的实施方案中，缓冲剂的浓度为约20mM。

在一些实施方案中，稳定剂选自甘露醇、海藻糖、山梨醇、蔗糖、盐酸精氨酸、脯氨酸、甘氨酸和甲硫氨酸。在优选的实施方案中，稳定剂选自山梨醇、蔗糖和海藻糖。在更优选的实施方案中，稳定剂选自山梨醇。

在一些实施方案中，稳定剂的浓度为约1-60mg/mL。在一些实施方案中，稳定剂的浓度为约16-50mg/mL。在优选的实施方案中，稳定剂的浓度为约1mg/mL、2mg/mL、3mg/mL、4mg/mL、5mg/mL、6mg/mL、7mg/mL、8mg/mL、9mg/mL、10mg/mL、11mg/mL、12mg/mL、13mg/mL、14mg/mL、15mg/mL、16mg/mL、17mg/mL、18mg/mL、19mg/mL、20mg/mL、21mg/mL、22mg/mL、23mg/mL、24mg/mL、25mg/mL、26mg/mL、27mg/mL、28mg/mL、29mg/mL、30mg/mL、31mg/mL、32mg/mL、33mg/mL、34mg/mL、35mg/mL、36mg/mL、37mg/mL、38mg/mL、39mg/mL、40mg/mL、41mg/mL、42mg/mL、43mg/mL、44mg/mL、45mg/mL、46mg/mL、47mg/mL、48mg/mL、49mg/mL、50mg/mL、51mg/mL、52mg/mL、53mg/mL、54mg/mL、55mg/mL、56mg/mL、57mg/mL、58mg/mL、59mg/mL和60mg/mL。在优选的实施方案中，稳定剂的浓度为约1-50mg/mL、1-40mg/mL、1-35mg/mL、1-30mg/mL、1-25mg/mL、1-20mg/mL、1-15mg/mL、1-10mg/mL、1-5mg/mL、10-50mg/mL、10-40mg/mL、10-35mg/mL、10-30mg/mL、10-25mg/mL、10-20mg/mL、10-15mg/mL、15-50mg/mL、15-40mg/mL、15-35mg/mL、15-30mg/mL、15-25mg/mL、15-20mg/mL、16-50mg/mL、16-40mg/mL、16-35mg/mL、16-30mg/mL、16-25mg/mL、16-20mg/mL、20-50mg/mL、20-40mg/mL、20-35mg/mL、20-30mg/mL、20-25mg/mL、25-50mg/mL、25-40mg/mL、25-30mg/mL、27-33mg/mL、30-50mg/mL、30-40mg/mL和30-35mg/mL。在优选的实施方案中，稳定剂的浓度为约20-40mg/mL。在更优选的实施方案中，稳定剂的浓度为约20-35mg/mL。在最优选的实施方案中，稳定剂的浓度为约30mg/mL。

在一些实施方案中，渗透压调节剂选自葡萄糖、氯化钠和硫酸钠。在优选的实施方案中，渗透压调节剂选自氯化钠。

在一些实施方案中，渗透压调节剂的浓度为约40-200mM。在一些实施方案中，渗透压调节剂的浓度为约20-200mM。在优选的实施方案中，渗透压调节剂的浓度为约20mM、25mM、30mM、35mM、40mM、41mM、42mM、43mM、44mM、45mM、46mM、47mM、48mM、49mM、50mM、51mM、52mM、53mM、54mM、55mM、56mM、57mM、58mM、59mM、60mM、61mM、62mM、63mM、64mM、65mM、66mM、67mM、68mM、69mM、70mM、75mM、80mM、85mM、90mM、100mM、110mM、120mM、130mM、140mM、150mM、160mM、170mM、180mM、190mM和200mM。在优选的实施方案中，渗透压调节剂的浓度为约20-100mM、20-90mM、20-80mM、20-70mM、20-60mM、30-90mM、30-80mM、30-70mM、30-60mM、30-50mM、30-40mM、40-80mM、40-70mM、40-60mM、40-50mM、50-70mM和50-60mM。在更优选的实施方案中，渗透压调节剂的浓度为约40-65mM。在更优选的实施方案中，渗透压调节剂的浓度为约55-65mM。在更优选的实施方案中，渗透压调节剂的浓度为约40-60mM。在最优选的实施方案中，渗透压调节剂的浓度为约60mM。

在一些实施方案中，IgM抗体制剂的渗透压为约300-700mOsm。在一些实施方案中，IgM抗体制剂的渗透压为约300-356mOsm。在一些实施方案中，IgM抗体制剂的渗透压为约320-356mOsm。在一些实施方案中，本发明的制剂接近人体等渗状态，满足鼻喷制剂渗透压要求，方便患者通过鼻喷雾方式给药，让呼吸道快速产生免疫力，从而阻断新冠病毒RBD与ACE2的结合。

在一些实施方案中，表面活性剂选自聚山梨酯20和聚山梨酯80。在优选的实施方案中，表面活性剂选自聚山梨酯20。

在一些实施方案中，表面活性剂的浓度为约0.04-2mg/mL。在优选的实施方案中，表面活性剂的浓度为约0.04mg/mL、0.05mg/mL、0.1mg/mL、0.15mg/mL、0.2mg/mL、0.25mg/mL、0.3mg/mL、0.35mg/mL、0.4mg/mL、0.45mg/mL、0.5mg/mL、0.55mg/mL、0.6mg/mL、0.65mg/mL、0.7mg/mL、0.75mg/mL、0.8mg/mL、0.85mg/mL、0.9mg/mL、0.95mg/mL、1mg/mL、1.1mg/mL、1.2mg/mL、1.3mg/mL、1.4mg/mL、1.5mg/mL、1.6mg/mL、1.7mg/mL、1.8mg/mL、1.9mg/mL和2mg/mL。在优选的实施方案中，表面活性剂的浓度为约0.04-1.5mg/mL、0.04-1mg/mL、0.04-0.5mg/mL、0.04-0.4mg/mL、0.04-0.3mg/mL、0.04-0.2mg/mL、0.04-0.1mg/mL、0.1-1mg/mL、0.1-0.5mg/mL、0.1-0.4mg/mL、0.1-0.3mg/mL、0.1-0.2mg/mL、0.2-1mg/mL、0.2-0.5mg/mL、0.2-0.4mg/mL、0.2-0.3mg/mL、0.3-1mg/mL、0.3-0.5mg/mL、0.3-0.4mg/mL、0.4-1mg/mL和0.4-0.5mg/mL。在更优选的实施方案中，表面活性剂的浓度为约0.1-0.4mg/mL。在更优选的实施方案中，表面活性剂的浓度为约0.2-0.4mg/mL。在最优选的实施方案中，表面活性剂的浓度为约0.3或0.4mg/mL。

在一些实施方案中，IgM抗体制剂的pH为约4.7-7.0。在优选的实施方案中，制剂的pH为约4.7、4.8、4.9、5.0、5.1、5.2、5.3、5.4、5.5、5.6、5.7、5.8、5.9、6.0、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9和7.0。在优选的实施方案中，制剂的pH为约4.9-6.8、4.9-6.7、4.9-6.6、4.9-6.5、4.9-6.4、4.9-6.3、4.9-6.2、4.9-6.1、4.9-6.0、4.9-5.9、4.9-5.8、4.9-5.7、4.9-5.6、4.9-5.5、4.9-5.4、4.9-5.3、4.9-5.2、4.9-5.1、4.9-5.0、5.3-6.8、5.3-6.7、5.3-6.6、5.3-6.5、5.3-6.4、5.3-6.3、5.3-6.2、5.3-6.1、5.3-6.0、5.3-5.9、5.3-5.8、5.3-5.7、5.3-5.6、5.3-5.5、5.3-5.4、5.4-6.6、5.4-6.5、5.4-6.4、5.4-6.3、5.4-6.2、5.4-6.1、5.4-6.0、5.4-5.9、5.4-5.8、5.4-5.7、5.4-5.6、5.4-5.5、5.5-5.6、5.6-6.6、5.6-6.5、5.6-6.4、5.6-6.3、5.6-6.2、5.6-6.1、5.6-6.0、5.6-5.9、5.6-5.8、5.6-5.7、5.7-5.8、5.8-6.6、5.8-6.5、5.8-6.4、5.8-6.3、5.8-6.2、5.8-6.1、5.8-6.0、5.8-5.9、5.9-6.6、5.9-6.5、5.9-6.4、5.9-6.3、5.9-6.2、5.9-6.1、5.9-6.0、6.0-6.6、6.0-6.5、6.0-6.4、6.0-6.3、6.0-6.2、6.0-6.1、6.1-6.6、6.1-6.5、6.1-6.4、6.1-6.3、6.1-6.2、6.2-6.6、6.2-6.5、6.2-6.4、6.2-6.3、6.3-6.6、6.3-6.5、6.3-6.4、6.4-6.6、6.4-6.5和6.5-6.6。在优选的实施方案中，制剂的pH为约5.3-6.8。在更优选的实施方案中，制剂的pH为约5.4-6.6。在更优选的实施方案中，制剂的pH为约5.6-6.4。在更优选的实施方案中，制剂的pH为约5.8-6.2。在更优选的实施方案中，制剂的pH为约6.0-6.4。在最优选的实施方案中，制剂的pH为约6.0。

在一些实施方案中，IgM抗体制剂包含：

IgM抗体约0.1-20mg/mL；

枸橼酸缓冲体系约10-30mM；

山梨醇约20-35mg/mL；

NaCl约40-65mM；

聚山梨酯20约0.1-0.4mg/mL；

和水；并且

所述制剂的pH为约5.6-6.4。

在一些实施方案中，IgM抗体制剂包含：

IgM抗体约1-20mg/mL；

枸橼酸缓冲体系约10-20mM；

山梨醇约20-35mg/mL；

NaCl约40-60mM；

聚山梨酯20约0.2-0.4mg/mL；

和水；并且

所述制剂的pH为约5.6-6.4。

在一些实施方案中，IgM抗体制剂包含：

IgM抗体约1mg/mL或约5mg/mL；

枸橼酸缓冲体系约20mM；

山梨醇约30mg/mL；

NaCl约60mM(3.5mg/mL)；

聚山梨酯20约0.3或约0.4mg/mL；

和水；并且

所述制剂的pH为约6.0。

IgM抗体

在一些实施方案中，IgM抗体为纳米抗体融合蛋白形成的IgM抗体，例如，IgM抗体为纳米抗体融合蛋白和J链形成的IgM抗体，所述纳米抗体融合蛋白为包含纳米抗体和Fc片段的融合蛋白，所述纳米抗体和Fc片段可任选地通过连接基连接。在一些实施方案中，IgM抗体为纳米抗体融合蛋白形成的IgM抗体，例如，IgM抗体为纳米抗体融合蛋白和J链形成的IgM抗体，所述纳米抗体融合蛋白为包含纳米抗体和Fc片段的融合蛋白，其中所述纳米抗体为特异性结合SARS-CoV-2RBD的纳米抗体，所述Fc片段选自人源IgM的Fc片段，所述纳米抗体和Fc片段可任选地通过连接基连接。

在优选的实施方案中，纳米抗体融合蛋白从N端到C端的结构如式(I)所示：

A-L-B(I)

其中，

A为纳米抗体，例如，特异性结合SARS-CoV-2RBD的纳米抗体；

B为人源IgM的Fc片段；

L为(GGGGS)m，其中，m＝0、1、2、3或4。

在优选的实施方案中，纳米抗体(例如，特异性结合SARS-CoV-2RBD的纳米抗体)包括以下CDR：氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示的CDR1，氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示的CDR2，以及氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示的CDR3。

在优选的实施方案中，纳米抗体(例如，特异性结合SARS-CoV-2RBD的纳米抗体)还包括4个框架区FR1-4，所述FR1-4与所述CDR1、CDR2和CDR3按顺序交错排列；更优选地，所述FR1-4分别如SEQ ID NO:4、5、6、7所示。

在优选的实施方案中，纳米抗体(例如，特异性结合SARS-CoV-2RBD的纳米抗体)具有如SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列。

在优选的实施方案中，人源IgM的Fc片段具有如SEQ ID NO:10所示的氨基酸序列。

在优选的实施方案中，纳米抗体融合蛋白具有如SEQ ID NO:9所示的氨基酸序列。

在优选的实施方案中，IgM抗体包含J链，所述J链具有如SEQ ID NO:11所示的氨基酸序列。

在一些实施方案中，IgM抗体是通过哺乳动物表达系统生产的重组IgM五聚体。IgM结构如图1所示，其抗体可变区区别于传统的H链及L链组合，而是采用新型冠状病毒(SARS-CoV-2)羊驼源纳米抗体R14。该纳米抗体通过用SARS-CoV-2RBD蛋白和SARS-CoV-2NTD蛋白同时免疫羊驼、构建抗体文库、利用噬菌体展示技术筛选而得，其氨基酸序列如SEQ ID NO:8(即，QVQLQESGGGLVQPGGSLRLSCAVSGFTLDYYAIGWFRQAPGKEREGVSCISSSDGST SYADSVKGRFTISRDNAKNTVYLQMNSLKPEDTALYYCAATPATYYSGRYYYQCPAG GMDYWGQGTQVTVSS)所示。

将氨基酸序列如SEQ ID NO:8所示的R14与氨基酸序列如SEQ ID NO:10(即，VIAELPPKVSVFVPPRDGFFGNPRKSKLICQATGFSPRQIQVSWLREGKQVGSGVTTDQVQAEAKESGPTTYKVTSTLTIKESDWLGQSMFTCRVDHRGLTFQQNASSMCVPDQDTAIRVFAIPPSFASIFLTKSTKLTCLVTDLTTYDSVTISWTRQNGEAVKTHTNISESHPNATFSAVGEASICEDDWNSGERFTCTVTHTDLPSPLKQTISRPKGVALHRPDVYLLPPAREQLNLRESATITCLVTGFSPADVFVQWMQRGQPLSPEKYVTSAPMPEPQAPGRYFAHSILTVSEEEWNTGETYTCVVAHEALPNRVTERTVDKSTGKPTLYNVSLVMSDTAGTCY)所示的人源IgM的Fc片段通过同源重组的方式融合后，可得到纳米抗体融合蛋白R14-Fc(SEQ ID NO:9所示，即QVQLQESGGGLVQPGGSLRLSCAVSGFTLDYYAIGWFRQAPGKEREGVSCISSSDGSTSYADSVKGRFTISRDNAKNTVYLQMNSLKPEDTALYYCAATPATYYSGRYYYQCPAGGMDYWGQGTQVTVSSVIAELPPKVSVFVPPRDGFFGNPRKSKLICQATGFSPRQIQVSWLREGKQVGSGVTTDQVQAEAKESGPTTYKVTSTLTIKESDWLGQSMFTCRVDHRGLTFQQNASSMCVPDQDTAIRVFAIPPSFASIFLTKSTKLTCLVTDLTTYDSVTISWTRQNGEAVKTHTNISESHPNATFSAVGEASICEDDWNSGERFTCTVTHTDLPSPLKQTISRPKGVALHRPDVYLLPPAREQLNLRESATITCLVTGFSPADVFVQWMQRGQPLSPEKYVTSAPMPEPQAPGRYFAHSILTVSEEEWNTGETYTCVVAHEALPNRVTERTVDKSTGKPTLYNVSLVMSDTAGTCY)。

纳米抗体融合蛋白R14-Fc和氨基酸序列如SEQ ID NO:11(即，QEDERIVLVDNKCKCARITSRIIRSSEDPNEDIVERNIRIIVPLNNRENISDPTSPLRTRFV YHLSDLCKKCDPTEVELDNQIVTATQSNICDEDSATETCYTYDRNKCYTAVVPLVYG GETKMVETALTPDACYPD)所示的J链在细胞中自组装即可形成重组的IgM五聚体抗体。

IgM抗体制剂剂型

在一些实施方案中，所述制剂为鼻喷剂、口服制剂、栓剂或胃肠外制剂的形式。

在优选的实施方案中，鼻喷剂选自气雾剂、喷雾剂和粉雾剂。

在优选的实施方案中，口服制剂选自片剂、粉末剂、丸剂、散剂、颗粒剂、细粒剂、软/硬胶囊剂、薄膜包衣剂、小丸剂、舌下片和膏剂。

在优选的实施方案中，胃肠外制剂为经皮剂、软膏剂、硬膏剂、外用液剂、可注射或可推注制剂。

IgM抗体制剂的用途

本发明还涉及本发明的制剂在制备用于预防或治疗新冠病毒感染的产品或药物中的用途，其中所述新冠病毒为SARS-CoV-2原始毒株和/或SARS-CoV-2变异毒株。

在优选的实施方案中，所述SARS-CoV-2变异毒株为Alpha(B.1.1.7)、Beta(B.1.351)、Gamma(P.1)、Kappa(B.1.617.1)、Delta(B.1.617.2)毒株、Omicron(B.1.1.529)亚型BA.1毒株、BA.2毒株。

缩略词描述

制剂处方检测

在对IgM抗体液体制剂处方筛选的一些实施例中，外观可见粒子观测中提及的乳光现象，是指胶体分散相或超显微粒子的漫反射效应。轻微乳光指在正常光照条件下为无色澄清透明溶液，放在澄明度仪器下为透明泛蓝光状态；严重乳光是指自然光条件下即可看到乳光；

下述实施例中的检测项目及检测方法：

(1)外观可见粒子观测：将样品置于可见光及澄明度仪中，肉眼观测溶液状态。

(2)纯度：分子排阻色谱(SEC)及非还原型十二烷基硫酸钠毛细管凝胶电泳(nrCE-SDS)检测。

(3)可见异物：灯检仪检测。

(4)蛋白浓度：紫外分光光度计检测，检测波长280nm。

(5)渗透压检测：渗透压摩尔浓度测定仪检测。

以下实施例中使用的IgM抗体为MR14(由纳米抗体融合蛋白R14-Fc(氨基酸序列如SEQ ID NO:9所示)与J链(氨基酸序列如SEQ ID NO:11所示)形成的五聚体形式的IgM，结构如图1所示)。通过哺乳动物宿主细胞CHO K1表达R14-Fc及J链，二者在细胞内进行自组装，形成五聚体形式的IgM抗体。

表达的细胞上清液蛋白通过纯化后，再经SDS-PAGE进行鉴定。其Native-Page结果如图2所示，Sample1为细胞池上清，Sample2为纯化后得到的IgM抗体。

实施例1：IgM抗体处方基础缓冲体系的筛选

本发明的IgM抗体经表达后，通过纯化和超滤得到置换在PBS缓冲液中的原液(浓度为约52mg/mL)，虽然换液时未产生沉淀，但溶液出现浑浊。申请人选择4种缓冲体系，经过pH调节制成6种处方，通过换液时外观可见粒子的观测结果来筛选适合的缓冲体系。

如表1所示，IgM抗体分子对缓冲体系敏感，将1滴原液滴到约5mL缓冲液中，除F6的枸橼酸缓冲体系外，F1的醋酸缓冲体系、F2和F3的组氨酸-醋酸缓冲体系以及F4和F5的组氨酸-盐酸缓冲体系均发生沉淀。进一步考察F6，申请人发现超滤管换液时缓冲液较难离心，表明IgM抗体分子对剪切力表现敏感。申请人尝试用分子筛换液，并加入不同的稳定剂保护分子使得免受剪切力影响。如F7-F11所示，枸橼酸缓冲体系加不同的稳定剂保护分子处方均能通过分子筛系统正常换液，换液后原液澄清；醋酸缓冲体系处方分子筛换液时堵柱子。

基于上述F1-F11换液过程的观察，选择枸橼酸缓冲体系作为IgM抗体的基础缓冲体系。

表1

实施例2：IgM抗体处方稳定剂筛选

在20mM枸橼酸缓冲体系处方中加入3.5mg/mL(60mM)NaCl以增加离子强度，同时起到调节渗透压的作用，使各处方达到人体等渗的状态。另选择甘露醇、海藻糖、山梨醇、蔗糖、盐酸精氨酸、脯氨酸、甘氨酸、甲硫氨酸等作为稳定剂，同时添加0.4mg/mL PS20作为表面活性剂，制成pH为5.3±0.1，蛋白浓度为50mg/mL的F12-F20处方。将F12-F20处方样品放置于40℃条件下进行加速稳定性研究，取样时间为Day0、Day3、1周(Day7)、2周(Day14)和3周(Day21)，分别进行外观可见粒子和分子排阻色谱(SEC)的检测。如表2所示，各个处方在40℃放置3周后，从可见粒子观测发现含有30mg/mL山梨醇的F12，含有60mg/mL蔗糖的F15，以及含有60mg/mL海藻糖的F16处方相对稳定。对F12、F15和F16处方分别在Day0、40℃一周、40℃两周的时间点取样。通过SEC检测蛋白纯度，结果如表3所示：F12、F15和F16处方中，蛋白主峰面积相比Day0分别下降31.5％、33.4％和29.8％，主要表现为高分子量聚集体(HMW)的增加。

申请人同时考察了40mg/mL甘露醇、海藻糖和山梨醇作为稳定剂，在pH为5.0条件下对39mg/mL本发明的IgM抗体蛋白的稳定效果(见处方F21-F23)。如表2所示，通过40℃加速1周的稳定性考察，发现以甘露醇为稳定剂的F21处方和以海藻糖为稳定剂的F22处方在40℃过夜后已经变浑浊，而以山梨醇为稳定剂的F23处方在40℃过夜后仅出现乳光。因此，山梨醇对IgM分子的稳定作用优于甘露醇和海藻糖。

F24、F25和F26处方是以30mg/mL的山梨醇为稳定剂，处方与F12相似，区别在于pH和蛋白浓度不同，40℃加速一周的可见粒子观测结果表明山梨醇对IgM分子具有较好的稳定作用。

多种稳定剂评估结果表明，山梨醇作为稳定剂对IgM抗体的稳定作用最优。

表2

表3

实施例3：IgM抗体处方稳定剂浓度筛选

考察稳定剂浓度以及盐浓度对IgM分子稳定性的影响。山梨醇稳定剂浓度设置为30、35和40mg/mL，渗透压调节剂NaCl浓度设置为40、50和60mM。按表4制成F27、F28和F29处方，将F27、F28和F29处方放置在40℃2周进行加速稳定性研究，分别进行外观可见粒子、蛋白浓度、渗透压、分子排阻色谱(SEC)和非还原十二烷基硫酸钠毛细管电泳(nrCE-SDS)的检测。

从可见粒子观测及蛋白浓度复测的结果来看(表4)，F27、F28和F29三种处方对IgM分子的稳定性效果相近，不同时间点的蛋白浓度复测结果无显著差异，渗透压范围为333-356mOsm。从nr CE-SDS以及SEC的纯度检测结果来看(表5)，改变稳定剂的浓度对IgM蛋白分子的稳定性无显著影响。

表4

表5

实施例4：IgM抗体处方pH优化

实施例2中F24-F26处方在40℃加速一周的可见粒子观测结果表明，IgM分子在pH＝5.3时较稳定，未出现沉淀。申请人在pH＝5.3基础上进行pH优化，F30-F34的基本处方均为20mM CA+3.5mg/mL(60mM)NaCl+30mg/mL山梨醇+0.4mg/mL PS20，蛋白浓度为50mg/mL，pH范围为5.2-6.0。将各处方溶液放置于40℃三周进行加速稳定性研究，分别从外观可见粒子、蛋白浓度、渗透压、分子排阻色谱(SEC)和非还原十二烷基硫酸钠毛细管电泳(nrCE-SDS)等方面进行评价。

如表6所示，可见粒子观测结果表明：IgM分子在不同pH条件下，稳定性存在差异，pH＝5.6-6.0的处方未出现严重乳光和浑浊现象。结合表7中各处方经过40℃ 3周的加速观察，pH＝5.6的F32处方SEC纯度检测主峰面积占比下降27.0％，pH＝5.8的F33处方主峰占比下降22.7％，pH＝6.0的F34处方主峰占比下降19.0％，表明IgM抗体分子在pH＝6.0的处方中更为稳定。

申请人在pH＝6.0基础进一步进行pH优化，F35-F39的基本处方仍为20mM CA+3.5mg/mL(60mM)NaCl+30mg/mL山梨醇+0.4mg/ml PS20，蛋白浓度为20mg/mL，pH范围为6.0-6.8，渗透压范围为320-339。

根据表8及表9中F35-F39处方的外观可见粒子观测结果、蛋白浓度复测结果、nrCE-SDS及SEC的纯度检测结果，仅有pH＝6.8的F39处方在40℃加速两周时观察到中量颗粒产生(5＜可见异物数量＜20)。随着pH从6.0逐步增加到6.8，F35-F39各处方中蛋白主峰占比下降幅度依次为7.1％、8.4％、10.1％、11.8％以及13.6％，IgM抗体的不稳定性逐渐加剧。结果表明，pH 6.0-6.4范围内蛋白主峰占比下降幅度小于10％，其中，pH＝6.0的F35处方更优。

可见，在pH＝5.3-6.8范围内，IgM抗体具有良好的溶解度和稳定性，其中，pH＝6.0时更优。

表6

表7

表8

表9

实施例5：IgM抗体处方抗体浓度

选择IgM抗体浓度分别为5mg/mL、10mg/mL、15mg/mL和20mg/mL，并按照表10配制F40、F41、F42、F43、F44和F45处方。

表10中可见粒子观测结果和浓度复测结果表明，F40、F41、F42、F43、F44和F45处方经40℃加速2周后溶液依旧澄清，澄明度仪器中可看到正常的轻微乳光现象，不同时间点的浓度复测结果无显著差异，表明在不同的抗体浓度下，现有制剂处方都能更好地保证IgM良好的溶解度。表11中nr CE-SDS及SEC的纯度检测结果表明，随着蛋白浓度的增大，IgM分子不稳定性随之增加，但整体主峰下降幅度都在10％以内，表明现有制剂处方能够保证IgM良好的稳定性。表面活性剂及其不同浓度对IgM抗体的稳定作用无显著差别。

表10

表11

以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神和范围。

序列表

SEQ ID NO:1纳米抗体R14的VHH链的CDR1序列

GFTLDYYAIG

SEQ ID NO:2纳米抗体R14的VHH链的CDR2序列

CISSSDGSTSYADSVKG

SEQ ID NO:3纳米抗体R14的VHH链的CDR3序列

TPATYYSGRYYYQCPAGGMDY

SEQ ID NO:4纳米抗体R14的VHH链的FR1序列

QVQLQESGGGLVQPGGSLRLSCAVS

SEQ ID NO:5纳米抗体R14的VHH链的FR2序列

WFRQAPGKEREGVS

SEQ ID NO:6纳米抗体R14的VHH链的FR3序列

RFTISRDNAKNTVYLQMNSLKPEDTALYYCAA

SEQ ID NO:7纳米抗体R14的VHH链的FR4序列

WGQGTQVTVSS

SEQ ID NO:8纳米抗体R14的VHH链的氨基酸序列

QVQLQESGGGLVQPGGSLRLSCAVSGFTLDYYAIGWFRQAPGKEREGVSCISSSDGSTSYADSVKGRFTISRDNAKNTVYLQMNSLKPEDTALYYCAATPATYYSGRYYYQCPAGGMDYWGQGTQVTVSS

SEQ ID NO:9纳米抗体融合蛋白R14-Fc的氨基酸序列

QVQLQESGGGLVQPGGSLRLSCAVSGFTLDYYAIGWFRQAPGKEREGVSCISSSDGSTSYADSVKGRFTISRDNAKNTVYLQMNSLKPEDTALYYCAATPATYYSGRYYYQCPAGGMDYWGQGTQVTVSSVIAELPPKVSVFVPPRDGFFGNPRKSKLICQATGFSPRQIQVSWLREGKQVGSGVTTDQVQAEAKESGPTTYKVTSTLTIKESDWLGQSMFTCRVDHRGLTFQQNASSMCVPDQDTAIRVFAIPPSFASIFLTKSTKLTCLVTDLTTYDSVTISWTRQNGEAVKTHTNISESHPNATFSAVGEASICEDDWNSGERFTCTVTHTDLPSPLKQTISRPKGVALHRPDVYLLPPAREQLNLRESATITCLVTGFSPADVFVQWMQRGQPLSPEKYVTSAPMPEPQAPGRYFAHSILTVSEEEWNTGETYTCVVAHEALPNRVTERTVDKSTGKPTLYNVSLVMSDTAGTCY

SEQ ID NO:10人源IgM抗体的Fc序列

VIAELPPKVSVFVPPRDGFFGNPRKSKLICQATGFSPRQIQVSWLREGKQVGSGVTTDQVQAEAKESGPTTYKVTSTLTIKESDWLGQSMFTCRVDHRGLTFQQNASSMCVPDQDTAIRVFAIPPSFASIFLTKSTKLTCLVTDLTTYDSVTISWTRQNGEAVKTHTNISESHPNATFSAVGEASICEDDWNSGERFTCTVTHTDLPSPLKQTISRPKGVALHRPDVYLLPPAREQLNLRESATITCLVTGFSPADVFVQWMQRGQPLSPEKYVTSAPMPEPQAPGRYFAHSILTVSEEEWNTGETYTCVVAHEALPNRVTERTVDKSTGKPTLYNVSLVMSDTAGTCY

SEQ ID NO:11人源IgM抗体的J链序列

QEDERIVLVDNKCKCARITSRIIRSSEDPNEDIVERNIRIIVPLNNRENISDPTSPLRTRFVYHLSDLCKKCDPTEVELDNQIVTATQSNICDEDSATETCYTYDRNKCYTAVVPLVYGGETKMVETALTPDACYPD。