一种诱导沉香愈伤组织形成的方法

技术领域

本发明属于植物组织培养技术，具体涉及一种诱导沉香愈伤组织形成的方法。

背景技术

沉香大多都是由白木香形成。白木香(Aquilaria sinensis L.)，是瑞香科沉香属植物。沉香具有极好的药用价值和经济价值。作为药材它是中国传统名贵中药的一种，具有行气止痛、温中止呕、纳气平喘等功效。作为工艺品，可被做成手串，雕饰；作为香料，可做香水的定香剂。但是，作为药材使用的树脂部分使用传统的“结香”方法，具有周期长、比例低、品质参差不齐等缺陷，这就使得野生沉香资源稀缺。部分高品质沉香的售价可高于黄金价格，达数万元/克。人们发现，正常生长的白木香树木并不会产生“沉香”。只有树木受到外界伤害，抑或是病原菌侵害的时候，沉香树脂才会被合成并在创面积累。自然的结香过程一般十分漫长，可长达数十甚至数百年，所以天然沉香遭到大量采集后难以短时间内再生，致使野生沉香资源日渐稀缺。而人工种植的白木香常面临存活率低、结香率低等问题。因此，探究诱导沉香愈伤组织形成的方法，对提高沉香的产量具有很大帮助。

现有的白木香培育方式大多为扦插，嫁接等基本繁殖方法，需要耗费大量的人力物力资源。长久以来，人们利用物理、化学与生物等方法尝试提高人工培育的沉香的结香成功率、产量与品质，但效果均不稳定，加之其背后的成因仍不明确，进一步加大了人工沉香结香的难度，在试验过程中需要保证苗木资源供应充足。因此，利用现代科学技术手段，提高沉香愈伤组织的形成，有助于解决人工种植沉香结香难问题。

近年来，随着生物技术手段的进步，组织培养在植物培育中的应用也逐渐占据主要地位，因为其具有速度快，数量多等优点。而现有的针对沉香组织培养技术很少。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的是提供一种诱导沉香愈伤组织形成的方法，本发明选择沉香苗顶部幼嫩无病害的组织作为外植体，利用叶盘法诱导愈伤培养得到愈伤组织，愈伤组织更高效更稳定，可突破沉香木结香的技术瓶颈。

本发明采取的具体技术方案是：

一种诱导沉香愈伤组织形成的方法，所述方法包括如下步骤：

（1）外植体的选择：从白木香苗的上部摘取健康无病害的叶片作为外植体，或者，选择白木香苗当年生枝条顶部的直径2cm以上的绿色茎段，诱导其腋芽萌发后，待其伸长至2cm左右，将其从原始茎段上取下于培养基中继续培养，获得无菌苗，摘取无菌苗上的叶片作为外植体；

（2）外植体的处理：

选择从白木香苗的上部摘取健康无病害的叶片作为外植体：用自来水将叶片表面的灰尘和杂质冲洗干净后，将洗净的外植体收集在容器里，置于超净工作台中，然后进行消毒处理；

无菌苗上的叶片无需进行消毒处理：

（3）愈伤诱导培养：

选择从白木香苗的上部摘取健康无病害的叶片作为外植体：用剪刀将消毒后叶片剪成面积为0.5-1.0cm

选择无菌苗上的叶片作为外植体：将无菌苗上的叶片直接取下剪成面积为0.5-1.0cm

所述愈伤诱导培养基为：1/2 MS + ZT 0.5 mg/L + 2,4-D 0.1-0.3 mg/L+蔗糖30g/L+Agar 7g/L pH=5.8；

（4）愈伤继代培养：

叶盘培养至30d，边缘愈伤进一步膨大，将其从原始叶盘上剥离，置于愈伤继代培养基中培养，所述愈伤继代培养基为：1/2 MS + ZT 0.5 mg/L + 2,4-D 0.1-0.3 mg/L+蔗糖30g/L+Agar 7g/L pH=5.8 pH=5.8。

进一步地，步骤（2）所述的消毒处理为：先使用75%乙醇浸泡30s，用无菌水清洗2遍；再将外植体用0.1%的升汞消毒8min，无菌水清洗5遍，叶片于滤纸上晾干至表面无明显水迹。

进一步地，将消毒后叶片剪成面积为0.5-1.0cm

进一步地，所述愈伤诱导培养的培养环境为26±2℃，全黑暗培养。

进一步地，所述愈伤继代培养的培养环境为26±2℃，全黑暗培养，每30d继代一次。

进一步地，选择白木香苗当年生枝条顶部的直径2cm以上的绿色茎段，诱导其腋芽萌发获得无菌苗的具体方法为：

（1）用剪刀将茎段剪下以后，摘除上面的叶片，再截短为长约为2cm的小段，每段带有1-2个腋芽，取下以后浸泡在水中；用自来水冲洗干净外植体表面的灰尘和杂质后，收集在容器里，置于超净工作台中；

（2）将步骤（1）处理后外植体转入无菌三角瓶中，首先使用75%乙醇浸泡30s，用无菌水清洗2遍；再将外植体用0.1%的升汞消毒8min，无菌水清洗5遍，茎段于滤纸上晾干至表面无明显水迹；

（3）将晾干后的茎段芽点朝上接种在腋芽诱导培养基中，接种完成的腋芽培养基转入培养室中培养，待叶腋间的芽点长至1-2cm时，将腋芽从茎上切除获得无菌芽，转移至壮苗培养基中继续培养，培养至长成高度6-10cm的无菌苗。

进一步地，所述腋芽诱导培养培养环境为26±2℃，日光灯光源，光照强度为3000Lux，光照时长16h/天。

进一步地，所述的腋芽诱导培养基为：1/2 MS+6-BA 0.2 mg/L+NAA 0.1 mg/L+蔗糖30g/L+Agar 7g/L，pH=5.8。

进一步地，所述转移至壮苗培养基中继续培养，培养环境为26±2℃，日光灯光源，光照强度3000Lux，光照时长16h/天。

进一步地，所述的壮苗培养基为：1/2 MS + 蔗糖30g/L + Agar 7g/L，pH=5.8。

本发明的有益效果是：

本发明采用沉香苗顶部幼嫩无病害的组织作为外植体，并筛选出最优的培养基及培养条件，利用叶盘法诱导愈伤培养得到愈伤组织，解决了现有沉香愈伤组织培养周期长，培养速度慢的问题。

沉香作为药材有着重要的药用价值，通过愈伤组织培养，可以大规模生产含有药用成分的组织，用于药物的制备。

白木香愈伤组织可以产生多种代谢产物，如倍半萜、色酮、黄酮等，这些物质在香料、药物、化妆品等领域有广泛应用。

通过愈伤组织培养，可以进行基因转化，引入特定基因或调节基因表达，实现沉香植株的遗传改良，增强其抗病虫害、逆境适应等特性。

白木香是濒危植物，利用愈伤组织培养技术可以减少野生种群的采伐压力，保护植物资源。

附图说明

图1为外植体取样示意图（左）和顶部茎段（右）；

图2为成熟叶片（左）与幼嫩叶片（右）（红框为取材部位）；

图3为实施例1继代培养的愈伤组织；

图4为实施例1愈伤诱导培养出的愈伤组织效果图；

图5为实施例2培养的愈伤组织效果图；

图6为实施例3培养的愈伤组织效果图。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

实施例1：

一种诱导沉香愈伤组织形成的方法，包括如下步骤：

步骤A：从白木香苗的上部摘取健康无病害的叶片作为外植体；

步骤B：用自来水将叶片表面的灰尘和杂质冲洗干净后，将洗净的外植体收集在容器里，置于超净工作台中；

步骤C：将外植体转入无菌三角瓶中，首先使用75%乙醇浸泡30s，用无菌水清洗2遍。再将外植体用0.1%的升汞消毒8min，无菌水清洗5遍，叶片于滤纸上晾干至表面无明显水迹；

步骤D：用剪刀将消毒后叶片剪成面积为0.5-1.0cm

步骤E：接种完成的诱导培养基转入暗室中培养，培养环境为26±2℃，全黑暗培养，所述愈伤诱导培养基为：1/2 MS + ZT 0.5 mg/L + 2,4-D 0.3 mg/L+蔗糖30g/L+Agar7g/L pH=5.8。

步骤F：叶盘培养至30d，边缘愈伤进一步膨大，可将其从原始叶盘上剥离，置于愈伤继代培养基中培养，培养环境为26±2℃，全黑暗培养，每30d继代一次。所述愈伤继代培养基为：1/2 MS + ZT 0.5 mg/L + 2,4-D 0.3 mg/L+蔗糖30g/L+Agar 7g/L pH=5.8；培养至直径约2-3mm。

经统计，采用本实施例的方法，愈伤的诱导率为78.8%。

实施例2：

一种诱导沉香愈伤组织形成的方法，包括如下步骤：

步骤A：选择白木香苗当年生枝条顶部的直径2cm以上的绿色茎段作为外植体，以期通过器官发生途径诱导其腋芽萌发以获得无菌苗。顶部茎段的腋芽生长活力强，幼嫩且木质化程度轻，带病菌的几率更小，接种后不易污染；

步骤B：用剪刀将茎段剪下以后，摘除上面的叶片，再截短为长约为2cm的小段，每段带有1-2个腋芽，取下以后浸泡在水中；用自来水冲洗干净外植体表面的灰尘和杂质后，收集在容器里，置于超净工作台中；

步骤C：将外植体转入无菌三角瓶中，首先使用75%乙醇浸泡30s，用无菌水清洗2遍。再将外植体用0.1%的升汞消毒8min，无菌水清洗5遍，茎段于滤纸上晾干至表面无明显水迹；

步骤D：晾干后的茎段芽点朝上接种在诱导培养基中。接种完成的培养基转入培养室中培养，培养环境为26±2℃，日光灯光源，光照强度为3000Lux，光照时长16h/天。一个月内持续观察记录。期间及时清理污染的外植体，更换新培养基。所述的腋芽诱导培养基为：1/2 MS+6-BA 0.2 mg/L+NAA 0.1 mg/L+蔗糖30g/L+Agar 7g/L，pH=5.8；

步骤F：茎段接种10d后，叶腋间的芽点开始萌动，培养至30d，芽可长至1-2cm，此时将腋芽从茎上切除获得无菌芽，将其从原始茎段上切下，转移至壮苗培养基中继续培养，培养环境为26±2℃，日光灯光源，光照强度3000 Lux，光照时长16h/天，约45d后，芽的基部开始长出根系。所述的壮苗培养基为：1/2 MS + 蔗糖30g/L + Agar 7g/L，pH=5.8；

步骤G：无菌芽在壮苗培养基中培育60d左右，即可长成高度6-10cm的无菌苗，其叶片可直接切成叶盘用于愈伤的诱导，培养环境为26±2℃，全黑暗培养，所述愈伤诱导培养基：1/2 MS + ZT 0.5 mg/L + 2,4-D 0.3 mg/L+蔗糖30g/L+Agar 7g/L pH=5.8；

步骤H：叶盘培养至30d，边缘愈伤进一步膨大，可将其从原始叶盘上剥离，置于愈伤继代培养基中培养，培养环境为26±2℃，全黑暗培养，每30d继代一次。所述愈伤继代培养基为：1/2 MS + ZT 0.5 mg/L + 2,4-D 0.3 mg/L+蔗糖30g/L+Agar 7g/L pH=5.8；培养至直径约2-3mm。

经统计，采用本实施例的方法，愈伤的诱导率为90.34%。

实施例3：

与实施例2其它均相同，不同之处在愈伤诱导培养基中2,4-D浓度为0.1 mg/L。

经统计，采用本实施例的方法，愈伤的诱导率为47.6%。

对照例1：

与实施例1其它均相同，不同之处在于培养基的培养环境为：26±2℃，日光灯光源，光照强度3000Lux，光照时长16h/天。

经统计，采用本对照例的方法，愈伤诱导率仅为6.5%。

由实施例1-3和对照例1的培养结果可知，愈伤诱导培养基在实验过程中2,4-D浓度由0.1mg/L调整到0.3mg/L对于愈伤的诱导效果更好；叶片接种完成后的培养基在黑暗条件下比光照条件下生长效果更好；采用白木香苗当年生枝条顶部的直径2cm以上的绿色茎段培养的无菌苗的叶片作为外植体，无需经过消毒步骤，且诱导的愈伤质量更高，愈伤诱导率可达90%以上。

尽管已经对上述各实施例进行了描述，但本领域内的技术人员一旦得知了基本创造性概念，则可对这些实施例做出另外的变更和修改，所以以上所述仅为本发明的实施例，并非因此限制本发明的专利保护范围，凡是利用本发明说明书及附图内容所作的等效结构或等效流程变换，或直接或间接运用在其他相关的技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围之内。