一种人类ALK-E6;A20融合基因检测用DNA标准品及其制备方法、应用
文献发布时间:2024-04-18 19:59:31
技术领域
本发明属于生物技术领域,具体涉及一种人类ALK-E6;A20融合基因检测用DNA标准品及其制备方法、应用。
背景技术
间变性淋巴瘤激酶(ALK)融合基因型肺癌已成为继表皮生长因子(EGFR)突变型肺癌之后的又一个肺癌分子亚型,具有明确的分子靶点、靶点检测技术及上市的靶向药物。
间变淋巴瘤激酶(anaplastic lymphoma kinase,ALK)是一个由细胞外配体结合区、跨膜区及胞内的酪氨酸激酶区组成的1,620个氨基酸的跨膜蛋白,属于胰岛素受体家族。棘皮动物微管相关样蛋白4(echinoderm microtubule-associated protein like 4,EML4)属于棘皮动物微管相关样蛋白家族,由N末端碱基区(疏水的棘皮动物微管相关蛋白区以及WD重复区(WD-repeat region)3部分构成。研究证明在EML4-ALK融合基因中,以上3个部分都与肿瘤的形成有关,其中N末端碱基区的作用最为重要。
检测ALK融合基因突变情况对肿瘤的发生发展和对肿瘤个体化治疗和预后均具有重要的指导意义。近几年来,在肺癌的分子靶向治疗领域,研究热点一直集中在EGFR、K-ras和VEGF等靶点上,涌现出许多针对这些靶点的分子靶向药物。ALK融合基因,与EGFR突变,K-ras突变的不共存现象以及含有该基因患者的鲜明临床特征,提示该靶点是肺腺癌特异性较高的分子标记物。小分子酪氨酸激酶抑制剂克唑替尼(Crizotinib)对含有ALK融合基因突变的肺癌患者疗效显著。克唑替尼是一种ATP竞争性酪氨酸激酶抑制剂,既可特异性靶向抑制ALK,也可抑制c-MET和ROS1等信号通路。克唑替尼分别于2011年和2013年被美国食品与药品管理局(FDA)和中国国家食品药品监督管理总局(CFDA)批准上市,用于治疗EML4-ALK表达的局部晚期或转移性NSCLC患者。
临床实践证明NSCLC各组织类型间存在分子靶向药物疗效上的差异。对于EGFR阴性或基因状态未知,或EGFR基因突变且使用EGFR-TKI治疗后出现原发或继发耐药的患者,建议行ALK融合基因检测。2012年,据美国国家综合癌症网(NCCN)NSCLC临床指南推荐,晚期NSCLC患者开始治疗前应进行EML4-ALK检测,并建议阳性患者首先接受克唑替尼治疗。大约40%的ALK阳性NSCLC患者对克唑替尼原发耐药。新一代ALK抑制剂色瑞替尼的I期临床研究结果显示其对克唑替尼耐药及存在中枢神经系统转移病灶的患者具有较好的疗效。
在大约5%的NSCLC患者中被发现。ALK重排的阳性率大约为3~5%,在腺癌、从未吸烟或少量吸烟的患者中EML4-ALK融合的几率更高一种。
EML4-ALK融合基因定位于2号染色体的短臂上(2p21和2p23),相隔约12Mb,其5’端为EML4的片段,3’端为ALK的片段,由倒置后的EML4基因片段与残余的ALK片段连接,倒位融合。EML4基因可在多个位点发生断裂,断开后的氨基末端片段取代了ALK的胞外域及跨膜域,直接与位于ALK第20外显子的胞内催化域相连,形成多种EML4-ALK融合基因突变体。融合后的EML4启动子位于ALK酪氨酸激酶的上游,从而使融合基因活化,表达EML4-ALK融合蛋白EML4-ALK的信号转导通路为PI3-K/Akt、STAT3/5、Ras-MEK和PLC-γ/PIP2等,这些通路与细胞存活、增殖和迁移密切相关,EML4胞外结构形成的二聚体使ALK受体持续磷酸化,进而激活持续以上细胞信号通路。
在NSCLC中,EML4与ALK基因的融合点不同,有超过15种变异类型,最常见的变异体是V1(E13;A20)和V3(E6;A20)。EML4在13号外显子处断裂形成一个3.6kb的片段,与ALK在20号外显子处断裂形成的297bp的片段融合,形成E13;A20。同样,EML4的6号外显子与ALK的20号外显子衔接形成E6;A20,此种融合方式可形成两种转录本,分别有EML4 exon 6ins33;ALK exon 20和EML4 exon 6;ALK exon 20。EML4-ALK基因融合可促使ALK基因引起致癌融合蛋白的表达,引起基因表达和信号的激活和失调,进而促使表达这些蛋白的肿瘤细胞增殖和存活。
体外诊断试剂作为预防、诊断、治疗监测、预后观察、健康状态评价以及遗传性疾病预测的重要工具,其质量控制非常重要。调查显示,即使卫生部从2002年开始即对临床基因扩增检验实验室进行规范化管理,提出质量保证要求,但仍存在部分检验科各自为阵,缺乏统一的标准、室内质控及其分析形式化等问题。体外诊断试剂标准物质对于控制体外诊断试剂产品质量、保证临床检测结果准确度,起着十分关键的作用。由于存在很多制约因素,现阶段诊断试剂国家标准物质供应尚不能完全满足注册、生产和质量控制的需要。
发明内容
为了解决以上问题,本发明的目的是提供一种人类ALK融合基因突变检测用DNA标准品产品,该产品标准品准确度高、均匀度良好。本发明首次建立了人类ALK融合基因突变检测用DNA标准品产品。
本发明还提供了人类ALK融合基因突变检测用DNA标准品产品的制备方法。
本发明为了实现上述目的所采用的技术方案为:
本发明提供了一种人类ALK(E6;A20)融合基因突变检测用DNA标准品,所述ALK(E6;A20)融合基因的序列为(如SEQ IN NO.1所示):
GCCTTATGACCTAGGCTGAATGACAATGTCTCTGAGTGGTTTTCTACTCTAAATATAGTAACTAGTATCCTCCTGGCTGATCAGGGGGTGGGGAGCTCCTTCAGTGTCCATCACGATGGTGAAAGCTCGCCCCCACCCCTAGACGTCACTTCTAGCTCCCACATGCT。
本发明所提供的的人类ALK(E6;A20)融合基因突变检测用DNA标准品具体为:
本发明所制备的上述标准品中,其中:
所述NCIH2228 gDNA的基因序列(如SEQ IN NO.2所示)为:
CTGGTCCGAAAACTTTTTTTTTTTTTTTTAAATAGAGTCGGCGGTATGTGATAGGAAGAGCAGTGAATGGGGAATAACTGTGTTTAGTGGTTGGTCCTG GCTCTTATGCATAATAGCCTTATGACCTAGGCTGAATGACAATGTCTCTGAGTGGTTTTCTACTCTAAATATAGTAACTAGTATCCTCCTGGCTGATCAGGGGGTGGGGAGCTCCTTCAGTGTCCATCACGATGGTGAAAGCTCGCCCCCACCCCTAGACGTCACTTCTAGCTCCCACATGCTTCCACCGGCGCAGCTCCTGTTTGGCTCCCACCCTATGTAATGCACTAGCCCACTCTTCCCCAAACCAGCCC
所述HEK293 gDNA的序列(如SEQ IN NO.3所示)为:CTGGTCCGAAAACTTTTTTTTTTTTTTTTAAATAGAGTCGGCGGTATGTGATAGGAAGAGCAGTGAATGGGGAATAACTGTGTTTAGTGGTTGGTCCTGGCTCTTATGCATAATAGCCTTATGACCTAGGCTGAATGACAATGTCTCTGAGTGGTTTTCTACTCTAAATATAGTAACTAAAAGCTTATTTCACATGACTACTGAAGGATGAAATAATATATATGAAATATAAATTGAAATATAGTGGCATCTAC进一步的,所述标准品测定用引物探针组为:
检测位点上游引物(如SEQ IN NO.4所示):
5’CAGTGAATGGGGAATAACTGTGTT 3’
检测位点下游引物(如SEQ IN NO.5所示):
5’GCCAGGAGGATACTAGTTACTATATTTAGA 3’
检测位点探针-FAM(如SEQ IN NO.6所示):
5’TAGTGGTTGGTCCTGGCTCTTATGC 3’-BHQ1
内参上游引物(如SEQ IN NO.7所示):
5’AACCACCAGAACATTGTTCGC 3’
内参下游引物(如SEQ IN NO.8所示):
5’GTCTCTCGGAGGAAGGACTTGA 3’
内参探针-VIC(如SEQ IN NO.9所示):
5’GCATTGGGGTGAGCCTGCAAT 3’-BHQ1。
本发明还提供了一种人类ALK(E6;A20)融合基因突变检测用DNA标准品的制备方法,包括以下步骤:
(1)提取含有ALK(E6;A20)融合基因的NCIH2228细胞系基因组DNA以及野生型HEK293细胞系基因组DNA作为模板,通过Sanger测序对ALK(E6;A20)基因融合位点和野生型细胞系基因组DNA进行测序验证;
(2)对EML4-AKL融合位置碱基序列进行分析,设计引物探针;
(3)采用数字PCR的方法对NCIH2228细胞系DNA和HEK293野生型细胞系DNA的ALK(E6;A20)融合基因突变频率进行测定,分别重复3次,取3次测定的平均值,作为NCIH2228细胞系的突变频率;
(4)按照不同比例将NCIH2228细胞系DNA和HEK293野生型细胞系DNA进行混合,分别获得1%、2%和5%突变频率的ALK(E6;A20)融合基因DNA标准品,采用数字PCR法进行基因突变频率验证,以及进行标准品均匀性验证。
进一步的,所述数字PCR的扩增体系为:
。
本发明的有益效果为:
(1)本发明制备的人类ALK融合基因突变检测用DNA标准品产品,产品标准品准确度高、均匀度良好。本发明首次建立了人类ALK融合基因突变检测用DNA标准品产品;
(2)本发明中ALK(E6;A20)融合基因突变检测定量标准品,量值准确,适用性好。可用于数字PCR或其他方法的验证和性能评估。
附图说明
图1为显示数字PCR方法测定HEK293野生型细胞系ALK(E6;A20)融合基因突变频率二维散点图;
图2为显示数字PCR方法测定NCIH2228细胞ALK(E6;A20)融合基因突变频率二维散点图;
图3为显示数字PCR方法测定配制标准品ALK(E6;A20)-1%融合基因突变频率二维散点图;
图4为显示数字PCR方法测定配制标准品ALK(E6;A20)-2%融合基因突变频率二维散点图;
图5为显示数字PCR方法测定配制标准品ALK(E6;A20)-5%融合基因突变频率二维散点图。
具体实施方式
下面通过具体的实施例对本发明的技术方案作进一步的解释和说明。
实施例1
1、细胞系和培养基
NCIH2228细胞系购自北京北纳创联生物技术研究院,所需的培养基为1640+10%FBS,5%CO
2、DNA提取以及Sanger测序
采用康为世纪公司的基因组纯化试剂盒提取细胞系的基因组DNA,采用NanoDrop法微量紫外分光光度计测定基因组在260nm、280nm处的吸光值,OD260/OD280在1.7~1.9之间,DNA纯度符合要求。Qubit荧光计进行细胞基因组DNA浓度测定,分别重复三次,取平均数作为细胞基因组DNA的最终浓度。基因组定量结果见表1,基因组纯度验证见表2。采用Sanger测序对基因组DNA进行验证,测序导出序列如下:
NCIH2228细胞系DNA的ALK(E6;A20)融合基因测序序列如下(未划线部分为EML4基因片段,下划线部分为ALK基因片段):
CTGGTCCGAAAACTTTTTTTTTTTTTTTTAAATAGAGTCGGCGGTATGTGATAGGAAGAGCAGTGAATGGGGAATAACTGTGTTTAGTGGTTGGTCCTGGCTCTTATGCATAATAGCCTTATGACCTAGGCTGAATGACAATGTCTCTGAGTGGTTTTCTACTCTAAATATAGTAACTA
HEK293野生型细胞系DNA的EML4基因测序序列如下:(划线部分为EML4基因融合片段)
CTGGTCCGAAAACTTTTTTTTTTTTTTTTAAATAGAGTCGGCGGTATGTGATAGGAAGAGCAGTGAATG
通过序列比对可得出,NCIH2228细胞系含有ALK(E6;A20)融合基因,同时HEK293野生型细胞系无ALK(E6;A20)融合基因。
表1基因组定量结果
表2基因组纯度验证
根据测定结果NCIH2228细胞系DNA和HEK293细胞系DNA的OD260/OD280在1.7~1.9之间,因此DNA纯度符合要求。
3、对EML4-AK融合位置碱基序列进行分析,进行引物探针设计,利用PrimerPremier5软件设计,可以在正向链或者反向链设计,根据突变位点附近的SNP进行选择,保证引物探针内不含有高频的SNP位点。
ALK(E6;A20)融合基因序列(未划线部分为EML4基因片段,下划线部分为ALK基因片段)
CTGGTCCGAAAACTTTTTTTTTTTTTTTTAAATAGAGTCGGCGGTATGTGATAGGAAGAGCAGTGAATGGGGAATAACTGTGTTTAGTGGTTGGTCCTGGCTCTTATGCATAATAGCCTTATGACCTAGGCTGAATGACAATGTCTCTGAGTGGTTTTCTACTCTAAATATAGTAACTA
检测位点上游引物:5’CAGTGAATGGGGAATAACTGTGTT 3’
检测位点下游引物:5’GCCAGGAGGATACTAGTTACTATATTTAGA 3’
检测位点探针-FAM:5’TAGTGGTTGGTCCTGGCTCTTATGC 3’-BHQ1
内参上游引物:5’AACCACCAGAACATTGTTCGC 3’
内参下游引物:5’GTCTCTCGGAGGAAGGACTTGA 3’
内参探针-VIC:5’GCATTGGGGTGAGCCTGCAAT 3’-BHQ1
4、采用数字PCR方法测定NCIH2228细胞系DNA和HEK293野生型细胞系DNA的ALK(E6;A20)融合基因的突变频率,扩增体系如表1。首先将配制好的含有DNA模板的PCR反应液20μL加入到微滴发生卡标记“Sample”的孔内,再向标记“Oil”的孔内加入70μL微滴生成油,然后放入微滴发生器内生成微滴。微滴生成后转移至96孔板内,用加热仪将96孔板的封板膜封好,放置在普通PCR仪上进行扩增。扩增条件为:95℃,3min;40个循环包括95℃,30s,60℃,90s;98℃,5min。
表3 ALK(E6-A20)融合基因数字PCR扩增体系
PCR扩增结束后进行微滴的读取和数据分析。采用QuantaSofi软件进行数据的分析处理。
5、采用数字PCR的方法对NCIH2228细胞系DNA和HEK293野生型细胞系DNA的ALK(E6;A20)融合基因突变频率进行测定,分别重复3次,取3次测定的平均值,作为最终的突变频率。数字PCR测定突变频率二维散点图如图1-2,HEK293野生型细胞系DNA没有检测到FAM标记阳性的微滴,标明HEK293野生型细胞系的DNA中不含ALK(E6;A20)融合基因;NCIH2228细胞系DNA测定3个重复,测定结果如表2,通过计算得出ALK(E6;A20)融合基因突变频率为24.20%。
表4数字PCR测定结果
6、配制ALK(E6;A20)融合基因突变的定量标准品
根据ALK(E6;A20)融合基因突变频率进行定量标准品配制,如表5。
表5 ALK(E6;A20)融合基因突变的定量DNA标准品配制表
7、采用数字PCR方法验证不同ALK(E6;A20)融合基因的定量DNA标准品的突变频率,数字PCR测定突变频率二维散点图如图3-5,ALK(E6;A20)-1%、ALK(E6;A20)-2%、ALK(E6;A20)-5%三个标准品突变频率可接受波动范围如表6。采用数字PCR方法分别重复3次,取3次测定结果的平均值,作为DNA标准品的最终突变频率,测定结果如表7
表6ALK(E6-A20)标准品突变频率可接受波动范围
表7标准品突变频率测定
本发明中ALK(E6;A20)融合基因突变检测定量标准品,量值准确,适用性好。可用于数字PCR或其他方法的验证和性能评估。
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