一种小分子抑制剂在抑制S-RNase活性及提高苹果自花结实性中的应用

技术领域

本发明涉及基因工程领域，具体一种小分子抑制剂在抑制S-RNase活性及提高苹果自花结实性中的应用说是一种小分子抑制剂在抑制S-RNase活性中的应用。

背景技术

自花不结实现象指的是在蔷薇科植物和十字花科植物中具有相同基因型的花粉管无法进入子房完成授粉或者花粉无法被柱头识别的现象。自花不结实一般分为两种类型，分别是配子体自花不结实和与胞子体自花不结实。大多数蔷薇科植物是配子体自交不亲和，而大多数十字花科植物是胞子体自交不亲和，S-RNase在自花不结实中发挥着极其重要的作用。S-RNase一般会在蔷薇科植物的花柱中高度表达，这种酶在某些情况下表现出细胞毒性，具体表现在对于具有相同基因型的花粉管具有抑制生长的作用。由于S-RNase的存在，导致同一品种或者具有相同基因型的花粉无法完成受精。自交不亲和对于植物适应恶劣环境以及保持基因的多样性具有重要作用，但是给农业生产造成不小的麻烦。比如苹果园中需要设置合理的授粉树，授粉树在授粉期间必须有足够的花粉，还要保证传粉生物的授粉不能受到恶劣环境的影响，因此天气因素也必须要考虑到。因此当授粉条件不好的时候，使苹果可以在人为的干预条件下完成自花授粉就是一项有研究意义的项目。

虚拟筛选技术作为药物先导化合物研发的最用力的工具之一，可以为S-RNase抑制剂的研发提供强有力的保证。相比有传统的高通量筛选，它目的性极强，而且能快速实现目标。通过计算机辅助药物设计，采用虚拟筛选的方法可以发现现有小分子可作为S-RNase抑制剂的新用途。

发明内容

针对现有技术中存在的缺陷，本发明的目的在于提供一种小分子抑制剂在抑制S-RNase活性中的应用。本发明采用虚拟筛选的方法获得了可以特异性抑制S-RNase活性的化合物，这些化合物可以特异性地与S-RNase活性位点结合，导致S-RNase失活，从而打破苹果自交不亲和现象。

为达到以上目的，本发明采取的技术方案是：

一种小分子抑制剂在抑制S-RNase活性中的应用，其特征在于，所述小分子抑制剂为：T4A2456，结构式如下所示：

上述小分子抑制剂能够抑制S-RNase活性，使自交不亲和的苹果品种能够进行自花结实。

一种喷施剂，其特征在于，含有上述小分子抑制剂。

在上述方案的基础上，所述喷施剂成分还包括渗透剂与粘着剂。

在上述方案的基础上，所述的小分子抑制剂浓度为1000μM，渗透剂浓度为0.5%wt，粘着剂浓度为0.1% wt。

在上述方案的基础上，所述渗透剂为吐温20，粘着剂为有机硅。

本发明所述的一种小分子抑制剂在抑制S-RNase活性中的应用，其有益效果为：

本发明发现一种小分子抑制剂可以特异性结合并抑制苹果S-RNase活性，促进自花授粉花粉管生长，实现苹果闭花授粉即可坐果结实的高产效果。

附图说明

本发明有如下附图：

图1 为S1-RNase与AlphaFold V2解析的Sg'-RNase 序列的对比（方框内为活性位点）；

图2 为S1-Rnase（a）与Sg'-RNase（b）三维结构对比；

图3 为S1-RNase三维结构的拉式图；

图4 为S1-RNase三维结构的Verify3D分布；

图5 为S1-RNase蛋白三维结构的活性中心以及活性位点；

图6 为T4A2456酶活性曲线。

具体实施方式

以下结合附图对本发明作进一步详细说明。

本发明通过虚拟筛选的方式得到了可以特异性抑制S-RNase活性的化合物，这些化合物可以特异性地与S-RNase活性位点结合，导致S-RNase失活，从而打破苹果自交不亲和现象，可以作为开发一种调节苹果自花结实性药剂的先导化合物。筛选得到化合物T4A2456。

虚拟筛选的过程详述如下：

1.同源建模：

以现有的已经解析的其他类型的RNase三维空间结构，通过swiss-model同源建模得到苹果S1-RNase三维空间结构.方法包括以下步骤：

1）在NCBI网站查阅苹果S1-RNase蛋白质氨基酸序列，将该序列在swiss-model搜索，得到两个蛋白质三维空间结构，选取其中同源性最高的AlphaFold V2解析的Sg'-RNase三维结构作为母板，得到序列相似性高达94.25%的三维结构，以其作为苹果S1-RNase的三维结构，以pdb格式保存。图1为苹果S1-RNase与Sg'-RNase蛋白序列对比。

2）通过同源建模得到的S1-RNase的蛋白三维结构GMQE值为0.93，其中GMQE一般位于0-1之间，数值越接近1越体现结构的可靠性。通过saves6.0进行可靠性评估，拉式图显示有93.75%的氨基酸处在最适区域，0.45%处于可被允许区，0.47%处于不合理区，图2为拉式图结果。结果通过Verify3D分析，verify scor>0表明该氨基酸残基构象合理，图3和图4表明86%的氨基酸残基构象合理。通过上述一系列分析证明经过同源建模得到的S1-RNase的蛋白三维结构合理。

2.虚拟筛选：

通过查阅文献得知S1-RNase属于T2-RNase家族，而且该家族酶活性具有高度保守性，都由两个组氨酸残基构成活性位点，活性位点以及活性区域如图4所示。

使用虚拟筛选软件Autodock Vina，将化合物库中的每一个小分子化合物以不同的姿势在蛋白质三维空间指定的位置进行分子对接。虚拟筛选的方法包括以下步骤：

1）首先对同源建模步骤中获得的苹果S1-RNase的三维结构pdb文件进行预处理：

选定His

2）使用上海陶术科技有限公司38764个小分子化合物库。使用openbabel将所有化合物格式转换为SDF格式的三维分子结构，之后使用Mona进行预处理，处理条件分别为Mv为230-390，Heavy atoms为30-55，LogP为1.3-4.1.处理后得到31764个化合物。

3）查阅文献得知苹果S1-RNase的HIS55是该蛋白质的一个活性位点，使用Autodock Tool将蛋白质的空间位置定义如下：center_x = -6.206400，center_y =-19.833400 ，center_z = 10.219900。之后使用北鲲云平台提供的Autodock Vina软件进行分子对接，设定参数如下：center_x =-6.206400，center_y = -19.833400 ，center_z =10.219900，size_x = 30，size_y = 30，size_z = 30，exhaustiveness = 8，cpu = 1。

4）分子对接完成后，选取对接分数最高的前100名，使用Autodock再次进行分子对接，选取对接结果中包含氢键的小分子化合物，共计57个小分子化合物。人工挑选出30个对接效果最好的小分子化合物待用。

3.S-RNase活性抑制测试：

S-RNase底物是RNA，故使用测定核酸酶活性的方式测定S-RNase的活性，S-RNase与底物核酸结合，260nm处吸光值会相应升高。在原核表达得到的S1-RNase、S2-RNase和S9-RNase中添加虚拟筛选得到的小分子化合物与底物酵母RNA，常温孵育，酶标仪测定30 min内吸光值IC50变化，以添加清水为负对照，添加2mM硫酸铜（S-RNase抑制剂）为正对照，最终筛选得到苹果S-RNase抑制剂T4A2456。

IC50值测定具体实验如下：

1）以酵母RNA作为底物，通过原核表达得到苹果S1-RNase、S2-RNase和S9-RNase。体系中加入75μL的酵母RNA，20μL的SRNase，5μL的化合物Mix，50μL的磷酸缓冲液。

2）将1）所述的体系加入96孔板中，使用酶标仪测定该体系在260nm处的吸光值，每1min测定一次，测定30min。根据吸光值变化来测定酶活性（1 min内吸光值增加0.001所需要的酶量被定义为一个核酸酶活性单位。计算公式：U=（ΔA260×1000×稀释倍数）/30）。设置T4A2456的1μM，5μM，10μM，20μM，100μM，200μM，1000μM，2000μM浓度梯度，在这些浓度梯度下，测定酶活性，绘制出酶活性曲线得到IC50值。图6中S-RNase酶活性曲线所示， S1-RNase、S2-RNase和S9-RNase随着化合物T4A2456添加浓度升高，其酶活均显著下降。

4.喷施试验结果

考虑到化合物T4A2456对于S-RNase的抑制效果较好，所以选择化合物T4A2456作为喷施试验的药品。按照一定浓度梯度（10μM ，50μM，100μM，200μM，500μM，1000μM），另外加入0.5% wt的吐温20（渗透剂）与0.1% wt的有机硅（粘着剂）配置成喷施药品之后，以喷施至富士苹果植株。

在大气球期采摘富士与金冠花粉，散粉后待用。在授粉前6小时喷施化合物，授粉后套袋，6小时候将该花粉涂抹于同品种的花的柱头上，之后套袋。15天后统计坐果率（如下表所示）

本说明书中未作详细描述的内容属于本领域专业技术人员公知的现有技术。