一种尼拉帕尼中间体的检测方法

技术领域

本发明涉及一种尼拉帕尼中间体的检测方法，尤其涉及一种尼拉帕尼中间体中异构体杂质的检测方法。

背景技术

由美国Tesaro公司和默沙东公司共同研制的尼拉帕尼(Niraparib)是一种口服的多聚腺苷二磷酸(ADP)核糖聚合酶(PARP)抑制类药物，主要用于治疗女性高发复发性上皮卵巢癌、输卵管癌和原发性腹膜癌的靶向药物。其作为卵巢癌的重磅药物，兼容性好，受食物和药物的影响小，治疗效果显著。

手性药物的不同立体异构体在药效、药代及毒理等方面都可能存在差异，即在原料药质量研究时，应结合其工艺与各手性中心的稳定性确定需研究控制的立体异构体杂质。手性杂质作为有机杂质的一种，其质控的基本思路与有机杂质相似。在进行研究时，首先应该进行杂质溯源的分析，确定各手性异构体的风险程度，并制定相应的控制策略。

尼拉帕尼活性成分为游离碱，化学名称为2-(4-((3S)-3-哌啶-基)苯基)-2H-吲唑-7-甲酰胺，其分子结构中含有一个手性碳原子，其中S构型的化合物才具备药理活性。此手性碳来源于尼拉帕尼中间体，其游离碱的化学名称为(S)-4-(哌啶-3-基)苯胺，CAS号1196713-21-9，结构如下：

为确保临床用药的安全有效，产品质量控制必须与原物料的源头控制及生产的过程控制相结合才能切实控制产品的质量，因此，有必要对尼拉帕尼中间体(S)-4-(哌啶-3-基)苯胺或其盐的异构体杂质进行有效的分离、控制，与终产品的质量控制相结合，可达到全面控制产品光学纯度的目的，现有技术中未见针对(S)-4-(哌啶-3-基)苯胺及其盐中异构体的检测方法。

发明内容

发明目的：本发明旨在提供一种能够专属地针对尼拉帕尼中间体——(S)-4-(哌啶-3-基)苯胺或其盐中的异构体杂质，进行有效地洗脱、分离和定量检测的分析方法。

技术方案：本发明所述的尼拉帕尼中间体——(S)-4-(哌啶-3-基)苯胺或其盐的检测方法包括以下步骤：

(1)配制样品：将尼拉帕尼中间体样品溶于水后，加入有机溶剂配制至设定浓度即得；

(2)检测：采用正相色谱柱，以正己烷为流动A，碱性电荷迁移剂和低级烷基醇的混合溶液为流动相B，进行洗脱；

(3)分析：记录色谱图，计算结果。

其中，(S)-4-(哌啶-3-基)苯胺的盐包括其硫酸盐、草酸盐、樟脑磺酸盐、乙基磺酸盐、二苯甲酰酒石酸盐、酒石酸盐。

在步骤(1)中，配制的样品具体包含：

a、供试品溶液：将尼拉帕尼中间体溶于水后，加入有机溶剂定量稀释至设定浓度，得供试品溶液，供试品溶液的具体浓度为0.5mg/ml～2.5mg/ml；

b、定位溶液：将尼拉帕尼中间体和其对映异构体的对照品溶于水后，加入低级烷基醇定量稀释至设定浓度，得定位溶液。

在步骤(3)中，将待测供试品溶液和定位溶液分别进样，记录色谱图，按面积归一化法计算尼拉帕尼中间体的异构体杂质含量。

优选，步骤(2)中进行等度洗脱时，所述的流动相A的体积分数不低于85％，更优选为流动相A:流动相B＝85:15(V/V)。

优选，步骤(1)中所述的有机溶剂为甲醇、无水乙醇、异丙醇中的一种或多种。

优选，步骤(1)中所述的有机溶剂的体积分数不得高于90％。

考虑到硫酸、草酸、樟脑磺酸、乙基磺酸、二苯甲酰酒石酸、酒石酸溶于水或乙醇，而(S)-4-(哌啶-3-基)苯胺极性较大，需加入些许水才可溶解，步骤(1)中，有机溶剂的体积占比不得高于90％，优选的为无水乙醇。

优选，步骤(2)中所述的碱性电荷迁移剂选自二乙胺、三乙胺、乙醇胺中的一种或多种，碱性电荷迁移剂更优选为乙醇胺，乙醇胺体积分数优选为0.4％。

进一步优选，步骤(2)中所述的低级烷基醇为无水乙醇、异丙醇中的一种或两种混合，低级烷基醇更优选为异丙醇。

优选，步骤(2)中所述的碱性电荷迁移剂在流动相B中的体积分数为0.2％～0.5％。

优选，步骤(2)中所述的色谱柱以表面涂敷有直链淀粉-三(3,5-二甲基苯基氨基甲酸酯)为硅胶为填充剂，进一步优选的色谱柱规格为4.6*250mm，5μm，更优选的色谱柱为CHIRALPAKAD-H。

CHIRALPAKAD-H固定相中含有为亲水性糖苷结构和疏水性的苯环结构。尼拉帕尼中间体的分子结构中含有氨基，可以与固定相结构中的酰胺键形成较强的氢键作用；此外还含有苯环，可以和固定相中的苯环产生π-π电子作用。尼拉帕尼中间体为碱性化合物，会与手性柱中裸露的硅醇基发生次级作用，导致其峰形差。故流动相中添加碱性的电荷迁移剂来改善峰形。

优选，步骤(2)中，采用紫外检测器，所述检测的检测波长为210nm～240nm，更优选为240nm。

优选，步骤(2)中，所述的色谱柱的柱温为20℃～35℃，流动相的流速为0.8ml/min～1.2ml/min，进样量为5μl～10μl。更优选地，柱温为30℃，流速为1.0ml/min，进样量为5μl。

有益效果：与现有技术相比，本发明具有如下显著优点：

能够有效溶解尼拉帕尼中间体样品，降低了检验误差；通过有效地洗脱、分离和定量分析尼拉帕尼中间体中异构体杂质，从源头控制尼拉帕尼产品质量，为工业化生产提供简便、准确、快速、可靠的检测方法。

附图说明

图1为对比例1的定位溶液的HPLC检测色谱图；

图2为对比例2的定位溶液的HPLC检测色谱图；

图3为对比例3的定位溶液的HPLC检测色谱图；

图4为对比例4的供试品溶液的HPLC检测色谱图；

图5为对比例5的供试品溶液的HPLC检测色谱图；

图6为对比例6的供试品溶液的HPLC检测色谱图；

图7为实施例1的定位溶液的HPLC检测色谱图；

图8为实施例1的供试品溶液的HPLC检测色谱图；

图9为实施例2的供试品溶液的HPLC检测色谱图。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明的技术方案作进一步说明。

对比例1

1、检测方法

(1)配制定位溶液：分别取(S)-4-(哌啶-3-基)苯胺和对映异构体的对照品各约5mg，置20ml容量瓶中，先加水2ml使溶解，再加无水乙醇稀释至刻度。

(2)设置色谱条件：所用高效液相色谱仪为Agilent 1260液相色谱仪，色谱柱为CHIRALPAKAD-H(4.6*250mm，5μm)，进样量：10μl；流动相A：正己烷；流动相B：0.1％二乙胺-异丙醇；等度洗脱：流速：1.0ml/min，流动相A:流动相B＝90:10(V/V)；色谱柱柱温：30℃；紫外检测器的检测波长：210nm，运行35min。

(3)测定分析：定位溶液进样，记录色谱图，按面积归一化法计算尼拉帕尼中间体的异构体含量。

2、检测结果

由图1可见，CHIRALPAKAD-H对ZJ991117的对映异构体有很强的手性识别作用，保留较强，但峰形拖尾严重，不对称因子分别为1.60和1.58。

对比例2

1、检测方法

与对比例1的不同之处在于色谱条件流动相B为0.2％二乙胺-异丙醇；等度洗脱时流动相A:流动相B＝80:20(V/V)；其余分析条件均与对比例1相同。

2、检测结果

由图2可见，相比于对比例1，峰形有所改善，分离度为1.10。

对比例3

1、检测方法

与对比例2的不同之处在于色谱条件流动相B:0.2％乙醇胺-异丙醇；其余分析条件均与对比例2相同。

2、检测结果

由图3可见，峰形改善，且分离度为1.65。通过对比例1至3相比较，流动相中的碱性电荷迁移剂优选为乙醇胺。

对比例4

1、检测方法

(1)配制供试品溶液：取(S)-4-(哌啶-3-基)苯胺酒石酸盐约20mg，置10ml容量瓶中，先加水1ml使溶解，再加无水乙醇稀释至刻度。

(2)配制定位溶液：分别取(S)-4-(哌啶-3-基)苯胺酒石酸盐和对映异构体的对照品各约5mg，置20ml容量瓶中，先加水2ml使溶解，再加无水乙醇稀释至刻度。

(3)设置色谱条件：所用高效液相色谱仪为Agilent 1260液相色谱仪，色谱柱为CHIRALPAKAD-H(4.6*250mm，5μm)，进样量：10μl；流动相A：正己烷；流动相B：0.4％乙醇胺-异丙醇；等度洗脱：流速：1.0ml/min，流动相A:流动相B＝80:20(V/V)；色谱柱柱温：30℃；紫外检测器的检测波长：210nm，运行35min。

(4)测定分析：供试品溶液和定位溶液分别进样，记录色谱图，按面积归一化法计算尼拉帕尼中间体的异构体含量。

2、检测结果

提高乙醇胺浓度为0.4％时，主峰与异构体的分离度为2.11，但样品检测时，异构体峰有杂质干扰，如图4所示。

对比例5

1、检测方法

与对比例4的不同之处在于设置色谱条件：流动相A:流动相B＝85:15(V/V)；其余分析条件均与对比例4相同。

2、检测结果

提高流动相中正己烷的比例，来降低流动相的洗脱强度。主峰与异构体的分离度为3.23，且样品检测时，异构体峰无杂质干扰，如图5所示。通过对比例4至5相比较，筛选的流动相比例为正己烷:0.4％乙醇胺-异丙醇＝85:15(V/V)。但紫外检测器的采集波长为210nm时，色谱图基线波动较大，异构体占比为8.40％时，S/N为29.1，灵敏度差。

对比例6

1、检测方法

(1)配制供试品溶液：取(S)-4-(哌啶-3-基)苯胺酒石酸盐20mg，置10ml容量瓶中，先加水1ml使溶解，再加无水乙醇稀释至刻度。

(2)设置色谱条件：所用高效液相色谱仪为Agilent 1260液相色谱仪，色谱柱为CHIRALPAKAD-H(4.6*250mm，5μm)，进样量：5μl；流动相A：正己烷；流动相B：0.4％乙醇胺-异丙醇；等度洗脱：流速：1.0ml/min，流动相A:流动相B＝85:15(V/V)；色谱柱柱温：30℃；紫外检测器的检测波长：240nm，运行25min。

(3)测定分析：供试品溶液进样，记录色谱图，按面积归一化法计算尼拉帕尼中间体的异构体含量。

2、检测结果

由图6可知，采集波长改为最大吸收波长240nm后，其异构体占比为0.17％时，S/N为216。优选240nm波长为检测波长。此方法为最终检测方法。

实施例1

1、检测方法

(1)配制供试品溶液：取(S)-4-(哌啶-3-基)苯胺酒石酸盐约20mg，置10ml容量瓶中，先加水1ml使溶解，再加无水乙醇稀释至刻度。

(2)配制定位溶液：分别取(S)-4-(哌啶-3-基)苯胺酒石酸盐和对映异构体的对照品各约5mg，置20ml容量瓶中，先加水2ml使溶解，再加无水乙醇稀释至刻度。

(3)设置色谱条件：所用高效液相色谱仪为Agilent 1260液相色谱仪，色谱柱为CHIRALPAKAD-H(4.6*250mm，5μm)，进样量：5μl；流动相A：正己烷；流动相B：0.4％乙醇胺-异丙醇；等度洗脱：流速：1.0ml/min，流动相A:流动相B＝85:15(V/V)；色谱柱柱温：30℃；紫外检测器的检测波长：240nm，运行25min。

(4)测定分析：待测供试品溶液和定位溶液分别进样，记录色谱图，按面积归一化法计算尼拉帕尼中间体的异构体杂质含量。

2、检测结果

由图7定位溶液的色谱图可知，(S)-4-(哌啶-3-基)苯胺和其对映异构体的峰形较好，(S)-4-(哌啶-3-基)苯胺的保留时间为14.9min，其对映异构体保留时间为12.9min；二者的分离度为3.23。由图8供试品溶液的色谱图可知，(S)-4-(哌啶-3-基)苯胺酒石酸盐供试品溶液色谱图中异构体占比为0.083％时，S/N为99.6。此方法为最终检测方法。

对实施例1提供的分析测定方法进行方法学验证，结果如下表：

根据实施例1验证数据可知，本发明所述的尼拉帕尼中间体及异构体含量的测定方法，灵敏度高、专属性强、精密度高，且有良好色谱条件耐用性，可用于尼拉帕尼中间体中异构体的质量控制。

实施例2

1、检测方法

与实施例1的不同之处在于：

(1)配制供试品溶液：取(S)-4-(哌啶-3-基)苯胺草酸盐约20mg，置10ml容量瓶中，先加水1ml使溶解，再加无水乙醇稀释至刻度。

(2)配制定位溶液：分别取(S)-4-(哌啶-3-基)苯胺草酸盐和对映异构体的对照品各约5mg，置20ml容量瓶中，先加水2ml使溶解，再加无水乙醇稀释至刻度。

其余分析条件均与实施例1相同。

2、检测结果

由图9可知，(S)-4-(哌啶-3-基)苯胺和其对映异构体的峰形尖锐，异构体占比为0.37％，且其检测无干扰，异构体与其主峰的分离度为3.02。