烟酰胺在提高糙皮侧耳生长性能中的应用

技术领域

本发明属于食用菌技术领域，涉及糙皮侧耳的栽培，特别是指烟酰胺（NAM）在提高糙皮侧耳生长性能中的应用。

背景技术

平菇学名糙皮侧耳

高温是限制食用菌生长发育的主要非生物胁迫因子之一，高温胁迫可抑制食用菌的生长，引起活性氧大爆发，导致脂质过氧化、损伤细胞结构，降低漆酶、纤维素酶等酶的活性，高温胁迫还会导致菌丝产生色素，爆发木霉病，造成栽培生产的巨大损失。提高糙皮侧耳抵御高温胁迫的能力有助于提高糙皮侧耳产量。专利CN112126632A公开了一种提高糙皮侧耳菌产漆酶活性的方法，该方法利用含有混合金属离子的诱导培养基进行培养，获得高漆酶活性的糙皮侧耳；专利CN103449914A公开了利用海藻糖延长草皮侧耳菌种寿命的应用；然而关于高温条件下的食用菌生长并没有相关的研究。为了提高糙皮侧耳菌在高温胁迫条件下的性能，本申请进行了深入的研究。

发明内容

针对上述技术问题，本发明提出一种烟酰胺在提高糙皮侧耳生长性能中的应用，解决了高温胁迫下糙皮侧耳的生长问题。

本发明的技术方案是这样实现的：

本申请的目的之一在于，保护烟酰胺在提高糙皮侧耳热胁迫抗性中的应用。

本申请的目的之二在于，保护烟酰胺在提高糙皮侧耳热胁迫恢复能力中的应用。

本申请的目的之三在于，保护烟酰胺在提高糙皮侧耳生长速率中的应用。

本申请的目的之四在于，保护烟酰胺在促进糙皮侧耳菌丝生长中的应用。

本申请的目的之五在于，保护烟酰胺在提高糙皮侧耳菌丝中漆酶活性中的应用.

上述的应用中热胁迫条件下，在糙皮侧耳的培养基/培养料中添加烟酰胺，糙皮侧耳菌丝中的漆酶活性提高至原来的6.28倍。

上述的应用，所述烟酰胺通过调控乙酰化修饰水平，实现糙皮侧耳的应用。

上述烟酰胺通过Sirt2介导调控乙酰化修饰水平。

实现上述应用的操作步骤为：向培养基/培养料中添加烟酰胺，然后再接种糙皮侧耳菌液进行培养。

进一步的，上述烟酰胺的添加浓度为1-10mM。

培养基的配方为：酵母浸粉5g/L、葡萄糖20 g/L、VB

培养料的配方为：质量比1:1.3的干料和水，其中干料包括88%棉籽壳、10%麦麸和2%的石灰。

本发明具有以下有益效果：

（1）本发明首次研究糙皮侧耳中的乙酰化水平的变化，乙酰化修饰在大型真菌中的作用还未见报道，解析食用菌对热胁迫的响应机制，可为抗热栽培技术创新寻找路径。

（2）本发明首次在糙皮侧耳平板基质以及栽培基质中添加烟酰胺来提高糙皮侧耳抵御高温胁迫的能力。

（3）本发明在培养基中添加不同浓度的烟酰胺能够明显提高糙皮侧耳菌丝高温胁迫恢复生长速率。

（4）本发明在培养基中添加烟酰胺能够明显提高糙皮侧耳菌丝现原基的时间。

（5）本发明首次发现去乙酰化酶SIRT2能够去乙酰化GST来提高GST酶活，GST可清除活性氧，保护植物细胞膜结构和蛋白质活性，在抗逆胁迫响应机制中起到重要作用。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为糙皮侧耳热胁迫不同时间总蛋白乙酰化水平变化图。

图2为乙酰化蛋白组筛选关键调控蛋白（SIRT2和GST）；其中A为GO富集；B为蛋白结构域富集；C为本研究中确定的关键调控蛋白。黑点表示靶蛋白赖氨酸乙酰化位点的数量和位置。

图3为外源添加SIRT底物NAM正常培养与热胁迫条件下对糙皮侧耳平板菌丝生长与热胁迫后恢复生长的影响；其中A为添加低浓度SIRT底物NAM正常培养平板菌丝生长速度；B为添加低浓度SIRT底物NAM 40℃热胁迫培养平板菌丝恢复生长速度；C为添加高浓度SIRT底物NAM正常培养平板菌丝生长速度；D为添加高浓度SIRT底物NAM 40℃热胁迫培养平板菌丝恢复生长速度。

图4为添加最适浓度NAM对袋栽糙皮侧耳菌丝生长及热胁迫后恢复生长的影响；其中A为正常培养袋栽菌丝生长速度；B为40℃热胁迫培养培养袋栽菌丝恢复生长速度。

图5为外源添加NAM正常培养与热胁迫条件下对糙皮侧耳现原基的影响。

图6为外源添加NAM对糙皮侧耳基质降解酶活性的影响；其中A为外源添加NAM对漆酶活性的影响；B为外源添加NAM对滤纸纤维素酶活性的影响；C为外源添加NAM对羧甲基纤维素酶活性的影响。

图7为外源添加NAM对糙皮侧耳氧化还原稳态的影响；其中A为外源添加NAM菌丝H

图8为SIRT2通过去乙酰化GST提高其活性；其中A为SIRT2去乙酰化GST1及GST1突变体对其酶活的影响；B为SIRT2去乙酰化GST2及GST2突变体对其酶活的影响。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例，对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有付出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

本发明的供试菌株为糙皮侧耳菌株

固体GYE培养基成分为：酵母浸粉5g/L、葡萄糖20 g/L、VB

液体GYE培养基成分为：酵母浸粉5g/L、葡萄糖20 g/L、VB

固体SA培养基成分为：蔗糖20g/L，天冬酰胺0.88g/L，磷酸二氢铵2.0g/L, L-缬氨酸1.0g/L，三水磷酸氢二钾0.224g/L，磷酸二氢钾0.803 g/L，七水硫酸镁0.99g/L，氯化钙0.02g/L，微量元素溶液5mL/L，维生素核苷酸溶液5mL/L，琼脂粉2%。

实施例1

本实施例为了检测糙皮侧耳热胁迫不同时间总蛋白乙酰化水平变化，采用以下步骤：

（1）糙皮侧耳固体菌种制备。在超净工作台中用直径5mm无菌打孔器打取糙皮侧耳边缘菌丝块，接种到 GYE 固体平板上，25℃黑暗培养至菌丝长满板。

（2）将满板平板放入 40℃培养箱中高温胁迫0h、0.5h、1h、2h、4h、8h、12h、24h，然后将收集菌丝，每个处理3板，3次重复。

（3）将收集的菌丝液氮速冻研磨加入蛋白提取液提取总蛋白。

（4）用提取的总蛋白进行western blot 实验，乙酰化抗体检测总蛋白乙酰化水平的变化。

结果如图1所示，由图1可知随着热胁迫时间的增加，糙皮侧耳菌丝乙酰化水平呈现先降低后升高的趋势。0-0.5h乙酰化水平降低，0.5h以后乙酰化水平逐渐增加，24h可见到乙酰化水平明显增加。

实施例2

本实施例从蛋白质组学筛选乙酰化的关键调控蛋白：

（1）糙皮侧耳固体菌种制备。在超净工作台中用直径5mm无菌打孔器打取糙皮侧耳边缘菌丝块，接种到 GYE 固体平板上，25℃黑暗培养至菌丝长满板。

（2）将满板平板放入 40℃培养箱中高温胁迫0h和24h，然后将收集菌丝，每个处理3板，3次重复。

（3）将收集的菌丝液氮速冻送公司进行乙酰化修饰定量蛋白质组学测序。

（4）对组学结果进行分析，筛选关键调控蛋白。

分析结果见图2，GO富集（图2A）和蛋白结构域富集（图2B）分析显示，谷胱甘肽转移酶（GST）和氧化还原相关的一些蛋白被乙酰化修饰。因此把重点放在氧化还原相关的蛋白上，从乙酰化组学数据库中筛选到了如图2C所示的几个氧化还原相关蛋白及乙酰化酶和去乙酰化酶。由此可见，乙酰化修饰在糙皮侧耳遭遇热胁迫时发挥重要的功能。

实施例3

本实施例对添加烟酰胺后正常培养和热胁迫培养的糙皮侧耳平板菌丝生长与热胁迫后恢复生长的影响进行了研究，步骤如下：

（1）糙皮侧耳固体菌种制备。在超净工作台中用直径5mm无菌打孔器打取糙皮侧耳边缘菌丝块，接种到 GYE 固体平板上，25℃黑暗培养至菌丝长满板。

（2）含不同浓度烟酰胺的培养基平板制作。在超净工作台中向融化好的固体GYE培养基中加入用超纯水配制好的烟酰胺母液（2M），使培养基中外源烟酰胺浓度分别为0mM、0.25mM、0.5mM、1mM、2mM、4mM、10mM、20mM、30mM、40mM和50mM，摇匀后倒板。用直径5mm无菌打孔器打取上糙皮侧耳边缘菌丝块，接种至含有不同浓度烟酰胺的GYE培养基平板中，25℃黑暗培养。

（3）平板试验中糙皮侧耳菌丝生长速率及高温胁迫后恢复生长速率测定。接种好的平板25℃黑暗培养至平板的1/3时，围绕菌丝边缘在平板底部画线，并记录日期。记录后将平板放入 40℃培养箱中高温胁迫24h，然后将平板放回25℃培养箱中继续培养至其中一组菌丝满板，画线并记录日期。测量各组的菌丝的生长长度，并计算菌丝生长速率以及恢复生长速率（生长速率（cm/d）=菌丝生长长度（cm）/菌丝生长天数（days）；恢复生长速率（cm/d）=菌丝恢复生长长度（cm）/菌丝恢复生长天数（days））。每个处理5板，3次重复。

结果如图3所示，由图3A和B可见，实验组低浓度的糙皮侧耳菌丝恢复生长速率均高于对照组，除烟酰胺浓度为10mM实验组的恢复生长速率与对照组间无显著差异（P>0.05），其它各实验组低浓度的恢复生长速率均显著高于对照组（P<0.05）。由图3C和D可见，实验组低浓度的糙皮侧耳菌丝恢复生长速率均高于对照组，除烟酰胺浓度为2mM和4mM实验组的恢复生长速率与对照组间无显著差异（P>0.05），0.25、0.5、1和2mM实验组的恢复生长速率均显著高于对照组（P<0.05）。由此可见,在培养料中添加一定量的烟酰胺可提高糙皮侧耳菌丝生长速率，且可提高糙皮侧耳菌丝抗高温胁迫的能力。

实施例4

本实施例研究添加最适浓度NAM对袋栽糙皮侧耳菌丝生长及热胁迫后恢复生长的影响，步骤如下：

（1）平菇液体菌种制备。在超净工作台中用直径5mm无菌打孔器打取平菇边缘菌丝块，接种至200mL GYE液体培养基中（含有8~10颗玻璃珠），25℃、160rpm摇瓶培养至菌液成浓稠小米粥状（约需5～7天）。按照5%（V/V）的接种量，将制备好的平菇液体菌种进行扩大培养。

（2）不同浓度烟酰胺栽培袋的制作。将烟酰胺浓度设置为：0mM、1mM。培养料配方为料：水=1：1.3，其中干料的配方为：棉籽壳88%、麦麸10%、石灰2%。充分搅拌均匀至手握成型且不出水的状态，室温放置半个小时。按照500g湿料/袋的量，将培养料装入14cm×28cm×0.004cm的聚丙烯折角袋中，塑料套环封口，126℃高压蒸汽灭菌3 h。灭菌结束后，将料袋取出冷却至室温。将相应质量的烟酰胺粉末加入摇好的液体菌种中，然后接种至冷却的菌袋。

（3）袋栽平菇菌丝高温胁迫后恢复生长速率测定。待菌丝长至接近菌袋中部时，将菌袋放入40℃培养箱中高温胁迫处理48h，然后将菌袋放回至25℃培养箱中继续培养至某一组菌丝满袋，测量各组的菌丝恢复生长长度，并进一步计算菌丝恢复生长速率（恢复生长速率（cm/d）= 恢复生长长度（cm）/恢复生长天数（days））。每个处理10袋，3次重复。

结果如图4所示，由图4A可见，实验组添加1mM烟酰胺的平菇菌丝生长速率显著高于对照组（P<0.05）。由图4B可见，实验组添加1mM烟酰胺的平菇菌丝恢复生长速率显著高于对照组（P<0.05）。由此可见，在培养料中添加一定量的烟酰胺可促进菌丝生长，提高平菇菌丝抗高温胁迫的能力。

实施例5

本实施例对添加烟酰胺对糙皮侧耳高温胁迫对菌丝生长的影响，采用以下步骤：

（1）糙皮侧耳固体菌种制备。在超净工作台中用直径5mm无菌打孔器打取糙皮侧耳边缘菌丝块，接种到 GYE 固体平板上，25℃黑暗培养至菌丝长满板。

（2）含不同浓度烟酰胺的现原基培养基平板制作。在超净工作台中向融化好的固体SA培养基中加入用超纯水配制好的烟酰胺母液（2M），使培养基中外源烟酰胺浓度分别为0mM和1mM，摇匀后倒板。用直径5mm无菌打孔器打取上糙皮侧耳边缘菌丝块，接种至含有不同浓度烟酰胺的SA培养基平板中，25℃黑暗培养。

（3）平板试验中糙皮侧耳添加烟酰胺对现原基的影响。

接种好的平板25℃黑暗培养至接近满板时，记录日期。记录后将部分平板放入 40℃培养箱中高温胁迫24h。然后将所有平板放入15℃培养箱中观察拍照记录不同发育时期，并记录日期。统计各组进入不同时期的时间见表1，每个处理5板，3次重复。

表1 糙皮侧耳进入不同时期的时间表

照片结果如图5所示，由图5A可见，正常培养，添加NAM后的菌丝生长洁白浓密。由图5B可见，正常培养添加MAM之后，桑葚期及子实体期时间提前；热胁迫组添加NAM原基期、桑葚期、子实体期时间均提前。表明经过添加NAM处理，促进了糙皮侧耳桑葚期及子实体期提前，缩短生长周期，对于平菇生长是有利的。由此可见，在培养料中添加一定量的烟酰胺可提高平菇菌丝生长能力

实施例6

本实施例研究外源添加NAM对糙皮侧耳基质降解酶活性的影响，采用以下步骤：

（1）糙皮侧耳固体菌种制备。在超净工作台中用直径5mm无菌打孔器打取糙皮侧耳边缘菌丝块，接种到 GYE 固体平板上，25℃黑暗培养至菌丝长满板。

（2）含不同浓度烟酰胺的培养基平板制作。在超净工作台中向融化好的固体GYE培养基中加入用超纯水配制好的烟酰胺母液（2M），使培养基中外源烟酰胺浓度分别为0mM和1mM，摇匀后倒板，用无菌水浸泡灭菌的玻璃纸，用无菌镊子在冷却的平板上铺平。用直径5mm无菌打孔器打取上糙皮侧耳边缘菌丝块，接种至含有不同浓度烟酰胺的GYE培养基平板中，25℃黑暗培养。

（3）平板试验中添加烟酰胺后糙皮侧耳菌丝基质降解酶活性测定

接种好的平板25℃黑暗培养至平板满板，然后收集菌丝液氮速冻放入-80℃保存，按照相应的酶活测定方法测定漆酶、滤纸纤维素酶和羧甲基纤维素酶酶活。

结果如图 6所示，由图6A可见，糙皮侧耳菌丝漆酶活性在热胁迫下降低69.31%，正常情况下1mM NAM提高漆酶活性至原来1.68倍，热胁迫下效果更明显，添加NAM后漆酶活性提高至原来的3.25倍。由图6B可见，糙皮侧耳菌丝滤纸纤维素酶活性在热胁迫下降低86.48%，正常情况下1mMNAM提高滤纸纤维素酶活性至原来1.23倍，热胁迫下效果更明显，添加NAM后滤纸纤维素酶活性提高至原来的6.28倍。由此可见，在培养料中添加一定量的烟酰胺可提高糙皮侧耳菌丝抗高温胁迫的能力。由图6C可见，糙皮侧耳菌丝羧甲基纤维素酶活性在热胁迫下降低95.15%，正常情况下1mM NAM提高丝羧甲基纤维素酶活性至原来1.15倍，热胁迫下效果更明显，添加NAM后丝羧甲基纤维素酶活性提高至原来的4.86倍。由此可见，在培养料中添加一定量的烟酰胺可提高糙皮侧耳菌丝抗高温胁迫的能力。

实施例7

本实施例研究外源添加NAM对糙皮侧耳氧化还原稳态的影响，采用以下步骤：

（1）糙皮侧耳固体菌种制备。在超净工作台中用直径5mm无菌打孔器打取糙皮侧耳边缘菌丝块，接种到 GYE 固体平板上，25℃黑暗培养至菌丝长满板。

（2）含不同浓度烟酰胺的培养基平板制作。在超净工作台中向融化好的固体GYE培养基中加入用超纯水配制好的NAM母液（2M），使培养基中外源NAM浓度分别为0mM和1mM，摇匀后倒板，用无菌水浸泡灭菌的玻璃纸，用无菌镊子在冷却的平板上铺平。用直径5mm无菌打孔器打取上糙皮侧耳边缘菌丝块，接种至含有不同浓度NAM的GYE培养基平板中，25℃黑暗培养。

（3）外源添加NAM对糙皮侧耳氧化还原相关指标测定。接种好的平板25℃黑暗培养至平板满板，然后收集菌丝液氮速冻放入-80℃保存，按照相应的测定方法测定H

结果如图7所示，由图7A可见，糙皮侧耳菌丝H

实施例8

本实施例研究SIRT2通过去乙酰化GST提高其活性，采用以下步骤：

去乙酰化酶SIRT2及靶蛋白谷胱甘肽转移酶GST1和GST2的原核表达及蛋白纯化。对从乙酰化组学数据筛选出的去乙酰化酶SIRT2和关键靶蛋白进行基因克隆，对pET-28a空载质粒和去乙酰化酶SIRT2和关键靶蛋白的CDS片段进行双酶切反应，用OMEG 胶回收试剂盒回收酶切产物。用T4连接酶将回收片段和载体酶连，然后将酶连产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，用菌落PCR进行阳性克隆筛选及质粒提取，参照大肠杆菌转化方法将1 μL 质粒转化大肠杆菌BL21表达菌株，并筛选鉴定阳性转化子。

挑取验证正确的转化子至含100 µg/mL Kana的新鲜LB液体培养基中，在37 ℃220 rpm的条件下活化约2 h，当菌液OD600在0.4到0.6之间时停止活化;在实验组中加入1mM IPTG溶液，在诱导温度37℃，220 rpm条件下诱导4h;诱导结束后将菌体在4 ℃ 6000rpm的条件下离心，把菌体收集到离心管中，弃掉上清，用适量PBS缓冲液重悬菌体，除去残留培养基，再次按上述条件离心，弃掉上清，用适量PBS缓冲液重悬菌体;用超声波细胞破碎仪破碎菌液至菌液澄清，在4 ℃ 6000 rpm的条件下离心，分别收集上清和沉淀，沉淀用适量PBS缓冲液重悬。放到4℃冰箱备用，然后SDS-PAGE验证蛋白大小。

取培养好的菌液2 mL 转接到200mL 含有200 μL Kana的液体LB中，37℃摇床，220rpm，培养至菌液OD600=0.4；加入1mM 的IPTG，放入37℃摇床220pm，诱导4h；将200mL诱导后的菌液4℃，8000rpm，3min，收集到50 mL 离心管中，加入20mL PBS Buffer重悬，4℃，8000rpm，2min；倒掉上清，再加入20mL PBS Buffer重悬，置于冰上备用；将收集好的菌液用超声破碎仪进行破碎;破碎完成后，4℃，8000rpm，离心30 min，将上清用孔径为0.22μm 的滤头过滤两遍，置于冰上备用；组装HisTrapTMHP 预装镍柱，在镍柱上方安装一个0.22μm的滤头，防止杂质堵塞镍柱，组装好之后用10mL的医用注射器吸取5mL的无菌水冲洗镍柱，再加入5mL的Binding Buffer 平衡镍柱；将制备好的细胞破碎上清液进行过柱上样，并重复过柱上样5次；分别依次吸取20mM、50mM、100mM、150mM、200mM、250mM、300mM、500mM 过柱洗涤蛋白，并用2mL 离心管依次收集洗脱液；洗脱完成后对镍柱进行清洗，先用5mL无菌水洗涤，再用5mL Binding Buffer 平衡镍柱，最后用2mL配制的 20%乙醇上柱封存，镍柱放到4℃冰箱保存，蛋白洗脱液用SDS-PAGE验证。

谷胱甘肽转移酶GST1和GST2的突变体的原核表达及蛋白纯化。用试剂盒对GST1和GST2根据组学数据检测到的乙酰化修饰位点进行定点突变，然后构建原核表达载体，进行蛋白纯化，方法步骤同上。

去乙酰化酶SIRT2和靶蛋白谷胱甘肽转移酶GST1和GST2及其突变体进行体外去乙酰化反应。纯化后的蛋白用BCA蛋白浓度测定试剂盒测定浓度，去乙酰化反应为10 ug GST蛋白，10 ug SIRT2蛋白，60uM NAD+，25uMTris-HCl (pH8.0)，137mM NaCl，2.7mM KCl， 1mMMgCl2，1mM DTT总体积50ul混匀， 30度反应4小时，对反应后的样品做WB检测乙酰化水平，并按照试剂盒说明测定GST及GST突变体酶活。

结果如图8所示，由图8A可见，SIRT2能够降低GST1和GST1K66R的乙酰化水平，且酶活显著升高，但是SIRT2不能降低GST1的突变体GST1K66R的乙酰化水平，不能升高突变体酶活。说明是SIRT2作用于GST1的K66位点来降低乙酰化水平进而提高酶活。由图8B可见,SIRT2能够降低GST2、GST2K206R和GST2K233R的乙酰化水平，且酶活显著升高，但是SIRT2对突变体GST2K206R的乙酰化水平没有影响，只对突变体GST2K233R有影响，且对GST2K206R的酶活也没有影响，只能增加突变体GST2K233R的酶活。说明SIRT2作用于GST2的K233位点而不是K206位点来降低乙酰化水平进而提高酶活。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。