保持粉质胚乳的源于“三光”的变体水稻品系“三光(SA)-FLO3”

[技术领域]

本发明涉及新颖的“三光(Samkwang)(SA)-flo3”，其为源于“三光”的具有粉质胚乳的突变品系及其用途。更具体地，本发明包括适于独占生产干磨米粉的具有粉质胚乳的“三光(SA)-flo3”，并且涉及用于育种水稻品种的方法、组合物、试剂盒、以及用于测定在下一代水稻品种中水稻粉质胚乳特性的方法，以及包含作为活性成分的水稻品种、其种子或其提取物的食品组合物。

[背景技术]

传统上，大米是韩国的主食，但由于消费条件的变化，自20世纪80年代以来，对米饭的需求一直持续下降。因此，为了提高国产水稻的竞争力并扩大消费，开发用于多种用途的水稻品种以及相关的加工技术是重要的。

为了促进水稻加工行业的高附加值，诸如小麦粉的米粉必须分布在市场和百货公司，并且必须按照各加工产品组的质量标准供应多种等级的米粉。然而，由于米粒的硬度(籽粒硬度)，韩国最常用的碾米方法是通过将米浸泡在水中并粉碎的浸水法进行湿磨。然而，湿磨具有通过产生约500升米水以生产100kg米粉而引起水污染的问题。此外，为了分配米粉，需要额外的工艺，例如灭菌、干燥等。因此，为了通过水稻加工工业的振兴来扩大消费，不断地提出了开发适于干磨的专用米粉产品的必要性。

因此，农村振兴厅已经开发了“Suweon 542”，其能够仅通过使用小麦磨粉机进行干磨来生产高品质米粉，这是由于用叠氮化钠(NaN

此外，农村振兴厅开发了新颖的水稻品种“Garumi 1”和“Garumi2”，其具有降低的胎生萌发、优异的抗病性和对晚季栽培的优异适应性，同时含有适于使用干磨生产米粉的粉质胚乳。

[公开]

[技术问题]

本发明通过开发‘三光(SA)-flo3’来完成，‘三光(SA)-flo3’由于粉质胚乳的低籽粒硬度而能够容易地由小麦磨粉机碾磨，在来自‘三光’的通过叠氮化钠突变的固定品系(总共约5,000)中，其是最高品质的稻米。

[技术方案]

本发明的一目的是提供‘三光(SA)-flo3’水稻品种，其为源于具有粉质胚乳特性的‘三光’的突变品系，保藏号为KACC 98101P。

本发明的另一目的是提供用于育种‘三光(SA)-flo3’的方法，‘三光(SA)-flo3’是‘三光’水稻品种的突变品系。

本发明的另一目的是提供用于测定下一代‘三光(SA)-flo3’中水稻粉质胚乳特性的组合物，其包含能够在对应于水稻标准基因组(IRGSP 1.0)中染色体5的19,721,940bp的位置处检测单核苷酸多态性(SNP)标志物的试剂。

本发明的另一目的是提供包含该组合物的用于测定下一代‘三光(SA)-flo3’中稻米粉质胚乳特性试剂盒。

本发明的另一目的是提供用于测定下一代‘三光(SA)-flo3’中水稻粉质胚乳特性的方法，其包括：在对应于水稻标准基因组(IRGSP 1.0)中染色体5的19,725,941bp的位置处检测SNP标志物。

本发明的另一目的是提供食品组合物，其包含作为活性成分的水稻品种、其种子或其提取物。

[有益效果]

本发明提供的‘三光(SA)-flo3’具有粉质胚乳特性，并且是与原始品种‘三光’在农业特性上相似的突变品系，因此由于其高的干磨效率，能够有利地用作多种稻米加工食品的新材料。

[附图简要说明]

图1a是显示了于2020年通过在国立农业科学院(Wanju-gun,Jeonbuk)的作物育种部门的试验田中繁殖而达到成熟阶段的本发明提供的新品种‘三光(SA)-flo3’和原始品种‘三光’的照片。

图1b是显示了由本发明提供的新品种'‘三光(SA)-flo3’和原始品种‘三光’的穗的照片。

图1c是显示了本发明提供的新品种的去壳稻米和糙米的外观的照片。为了提供粉质胚乳，显示了糙米及其横截面的胚乳。

图2是测定在‘Os05g0405000-02’的外显子7中确认的‘三光’和‘三光(SA)-flo3’之间的[G/A]SNP位置(19,721,943bp)处的核苷酸序列的结果，‘Os05g0405000-02’的外显子7是包含推测的‘cyOsPPDK’(细胞内的丙酮酸磷酸双激酶蛋白)的ORF(开放读码框)。是一种决定面粉胚乳的基因。证实了本发明提供的“三光”(原始品种和粘稻)具有[G]基，而“三光(SA)-flo3”具有[A]基。

图3是显示由本发明的dCAPS引物组扩增的片段的核苷酸序列和限制酶(RsaI)消化位点的图。

图4示出了使用本发明的四引物ARMS引物组作为方法的‘三光’和‘三光(SA)-flo3’的电泳结果。

图5示出了使用本发明的dCAPS引物组和限制性内切酶(RsaI)作为方法的‘三光’和‘三光(SA)-flo3’杂交后代的电泳结果。具体地，由于F

图6示出了使用本发明的dCAPS引物组和限制性内切酶(RsaI)作为方法的具有相似遗传背景的国产水稻品种的电泳结果(1.Goun,2.Ungwang,3.Josaengheukchal,4.Odae1,5.Shinunbong 1,6.Manna,7.Geumo 3,8.Hwangeumbora,9.Nunkeunheukchal,10.Asemi,11.Ondami,12.Jungmo 1032,13.Jinok,14.Baekilmi,15.Asemi 1,16.Haedam Rice,17.Mihyangbyeo,18.Shindongjin,19.Sujin,20.Hojin,21.Heukhyang,22.Junam,23.Goami,24.Dongjin 1,25.Hyangmibyeo 1,26.Nokyang,27.SegaeJinmi,28.Hanareum3,29.Hanareum 4,30.Geumgang 1,31.Mokwoo,32.Mokyang)。

图7示出了使用本发明的四引物ARMS引物组作为方法的‘三光’和‘三光(SA)-flo3’杂交后代的电泳结果。具体地，由于F

图8是使用商业试剂盒(淀粉损坏测定试剂盒，Megazyme)处理并着色的样品的照片，处理以测量由试验小麦研磨机生产的米粉的受损淀粉含量，并且着色以使用分光光度计定量受损淀粉含量。混合并使用由试验小麦研磨机‘Buhler MLU-02’的6级分系列(B1,R1,B2,R2,B3,R3)生产的所有米粉。平均测得受损坏淀粉含量‘三光’为12.0％、‘三光(SA)-flo3’为6.0％以及‘Garumi 2’为4.9％。

[优选实施方案的详细描述]

在下文中，将详细描述本发明。同时，这里公开的每一描述和实施方案能够分别应用于其他描述和实施方案。也就是说，在此公开的各种元件的所有组合都落入本发明的范围内。此外，本发明的范围不受下面描述的具体描述的限制。

此外，本领域普通技术人员仅使用常规实验就能够认识到或确认与本文所述的本发明的特定方面的许多等同物。此外，这些等同物也包括在本发明中。

本发明的一方面提供了‘三光(SA)-flo3’水稻品种，其为源于具有粉质胚乳特性的‘三光’的突变品系，保藏号为KACC 98101P。

如本文所用，术语“粉质胚乳“系指具有类似于糯米的浑浊和不透明外观的性质并具有松散的淀粉颗粒排列的突变体。干磨和湿磨被用于生产米粉。干磨是简单的方法，但是存在损坏的淀粉增加的问题，而湿磨提高了加工性能，但是浸泡和干燥所需的时间和成本是限制因素。为了促进水稻加工工业的振兴，需要使具有适合各种用途的特性的加工品种多样化，并开发出研磨品质优良的品种，并且这种粉质胚乳特性是能够克服常规干磨问题的重要特性之一。

含有粉质胚乳特性的水稻有利于干磨，并且干磨能够生产水污染最小的米粉，对环境友好，并且能够降低加工成本。

本发明的水稻品种是通过使用叠氮化钠(NaN

2021年7月5日，根据布达佩斯条约，将‘三光(SA)-flo3’水稻品种由位于国立农业科学院农村振兴厅的韩国农业培养物保藏中心的国内保藏转移为国际保藏，国际登记号为KACC 88004BP。

水稻品种可以具有以下特性：

(a)抽穗期：8月14日±10日

(b)杆长(cm)：76±20

(c)穗长(cm)：19±10

(d)分蘖数(个数)：15±5

(e)糙米的千粒重(g)：18.5±5.0

(f)糙米的长度(mm)：5.09±3.00

(g)糙米的宽度(mm)：2.97±2.00

(h)糙米的长宽比：1.72±0.50

(g)‘三光(SA)-flo3’的粉质胚乳基因(flo4-6)的基因型

(h)存在于cyOsPPDK(细胞内的丙酮酸磷酸双激酶蛋白)基因—粉质胚乳基因—的ORF的外显子7中的SNP序列是A

(i)重3.0±0.34kg的种子的籽粒硬度

(j)正常季节培养的抽穗期始于8月14日直至结束

(k)种子粉的平均尺寸为65.3±0.86μm

(l)种子粉的损坏的淀粉比率为6.0％。

本发明的另一方面提供了用于育种‘三光(SA)-flo3’的方法，所述‘三光(SA)-flo3’是‘三光’水稻品种的后代的突变品系。

本文所用的术语如上所述。

该方法可以包括：(a)将‘三光’种子浸入叠氮化钠(NaN

(b)在每一已建立品系的种子中选择具有粉质胚乳的水稻品种。

步骤(a)可以通过将‘三光’种子浸入叠氮化钠(NaN

步骤(a)中叠氮化钠溶液的浓度没有特别限制，但作为实例，它可以是10mM至200mM，作为另一实例，它可以是50mM至150mM，作为另一实例，它可以是100mM。

步骤(a)中的浸渍温度没有特别限制，但是作为实例，它可以是15℃至30℃，并且作为另一实例，它可以是25℃。

步骤(a)的浸渍时间没有特别限制，但作为实例，它可以是1至12小时，作为另一实例，它可以是3至9小时，并且作为另一实例，它可以是6小时。

步骤(b)可以通过在每一已建立品系的种子中选择具有粉质胚乳的水稻品种来进行。

在实例中，在步骤(b)中，繁殖在步骤(a)中建立的突变品系的每一种子，并且目视选择表达与‘Suweon 542(粉质)’的胚乳类似的品系。

在本发明中，步骤(a)和(b)可以根据粉质胚乳、突变品系等特性的变化进行适当的改变。

本发明的另一方面提供了用于测定‘三光(SA)-flo3’水稻子代的粉质胚乳特性的组合物，其包含能够在对应于水稻标准基因组(IRGSP 1.0)中染色体5的19,721,940bp的位置处检测单核苷酸多态性(SNP)标志物的试剂。

本文所用的术语如上所述。

如本文所用，术语“多态性”可以在一个基因座中存在两个或多个等位基因时发生，并且术语“单核苷酸多态性(SNP)”可以在多态性位点中的单个核苷酸不同时发生。如本文所用，术语“等位基因”系指存在于同源染色体的相同基因座上的基因的几种形式，并且SNP具有两种类型的等位基因(双等位基因)。

在本发明中，SNP存在于衍生自位于染色体5上由SEQ ID NO:1表示的‘三光(SA)-flo3’的多核苷酸序列(ch；19,718,538～19,726,410)的3,403(19,721,940bp)位置处。更具体地，3,403位置处的G被A取代，因此，它可以指甘氨酸(Gly,G)—354位置处的氨基酸—突变为天冬氨酸(Asp,D)。

在本发明中，能够检测SNP标志物的试剂可以是能够扩增多核苷酸的引物或能够与多核苷酸特异性杂交的探针，所述多核苷酸由10至300个碱基组成，所述碱基含有存在于由SEQ ID NO:1表示的多核苷酸序列的3,403位置处的单核苷酸多态性位点。

具体地，能够检测SNP标志物的试剂可以是由SEQ ID NO:4至SEQ ID NO:7表示的引物组成的引物组，但不限于此。

如本文所用，术语“引物”系指具有游离3’羟基的短核酸序列，其能够与互补模板形成碱基对，并用作模板链复制的起始点。引物的合适长度可以根据使用目的而变化，并且通常可以由15至30个核苷酸组成。引物序列不必与模板完全互补，但应足够互补以与模板杂交。引物可以与含有多态性位点的DNA序列杂交以扩增含有多态性位点的DNA片段。为了本发明的目的，引物可以扩增与粉质胚乳特性密切相关的单核苷酸多态性位点，并且可以是例如由SEQ ID NO:4至SEQ ID NO:7表示的引物组成的引物组，但不限于此。

引物组可以由与SEQ ID NO:4至SEQ ID NO:7所示的每一核苷酸序列具有优选80％或更多序列同源性，更优选90％或更多序列同源性，甚至更优选95％或更多序列同源性，最优选99％或更多序列同源性的任一核苷酸序列组成，但是可以包括但不限于任何核苷酸序列，只要它能够扩增上述SNP位点即可。

本发明的引物或探针可以使用亚磷酰胺固体支持物方法或其他广泛已知的方法化学合成。这些核酸序列也可以用本领域已知的任何方法修饰。该等修饰的非限制性实例包括甲基化、封装、用其类似物替换一个或多个天然核苷酸、以及核苷酸间的修饰，例如，对不带电的偶联物(例如甲基膦酸酯、磷酸三酯、氨基磷酸酯、氨基甲酸酯等)或带电的偶联物(例如硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯等)的修饰。

本发明的另一方面提供了用于测定‘三光(SA)-flo3’水稻子代的粉质胚乳特性的试剂盒，其包括组合物。

本文所用的术语如上所述。

本发明的试剂盒，除了上述组合物外，还可以包括DNA聚合酶、dNTP、以及促进PCR的PCR缓冲液。此外，该试剂盒还可以包括电泳所必需的成分，以证实PCR产物的扩增，或已知品种的鉴定标准。

本发明的另一方面提供了用于测定‘三光(SA)-flo3’水稻子代的粉质胚乳特性的方法，其包括：在对应于水稻标准基因组(IRGSP 1.0)中染色体5的19,725,941bp的位置处检测SNP标志物。

本文所用的术语如上所述。

在水稻的标准基因组(IRGSP 1.0)中，在对应于染色体5的19,721,940bp的位置处的SNP标志物可以具有A碱基。

检测SNP标志物的步骤可以包括：

(a)基于从样品中分离的基因组DNA作为模板，使用由SEQ ID NO:4至SEQ ID NO:7表示的引物组成的引物组进行PCR；以及

(b)确认由PCR扩增的产物。

本发明的另一方面提供了包含作为活性成分的水稻品种、其种子或其提取物的食品组合物。

本文所用的术语如上所述。

具体地，水稻品种是如上所述的‘三光(SA)-flo3’。

本发明的品种的种子能够干磨生产出具有细颗粒并且对淀粉颗粒损害小的优质米粉，因此，含有作为活性成分的该水稻品种的食品组合物具有价格竞争力和优异的质地。

本发明的食品组合物可以包括由水稻品种的种子生产的米粉。

米粉可以通过干磨生产。

本发明的食品组合物包括所有类型的加工的米制品、功能食品、营养补充剂、健康功能食品和食品添加剂。这种类型的食品组合物能够根据本领域已知的常规方法制备成各种形式。

例如，可以通过加工本发明提供的水稻品种或其种子来制备加工的米制品(例如，米饼/面条(米饼、米饼汤的米饼、炒米饼的米饼、面条、拉面、生面条、传统米饼)，大米点心(饼干、旅行饼干、点心、韩国传统糖果、炒米、焦米)，米粉(生米粉、α米粉、湿米粉)，酒(浑浊的米酒/YAG-JJU、烧酒、啤酒、米酒)，调味食品(太妃糖、发酵大豆糊、醋)，和其他大米加工产品(粥、甜米饮料、小吃添加剂、酒糟、混合粒粉、大米饮料，大米面包，加工的熟米)。

如本文所用，术语“健康功能食品”与用于特殊健康用途(FOSHU)的食品是相同的术语，并且系指被加工以除了营养供给之外还有效地发挥身体调节功能的食品，因此具有高的医学和医疗效果。特别地，术语“功能性”系指控制人体功能结构的营养素或为卫生目的提供有用的效果，例如生理效果等。

在本发明的食品组合物中，除了作为必需成分的‘三光(SA)-flo3’水稻品种、其种子或其提取物以外，可以包括的其他成分没有特别限制，并且各种草药提取物、食品补充添加剂或天然碳水化合物可以与常规食品一起被包含作为附加成分。此外，食品补充添加剂包括本领域常规的食品补充添加剂，例如矫味剂、调味剂、着色剂、填充剂、稳定剂等。

本发明的食品可以根据本领域常用的方法制备，并且在制备食品时可以加入本领域常用的原料和成分。此外，食品的配方没有特别限制，只要它被认为是食品的配方或食品即可。本发明的食品组合物可以制备成多种制剂，并且本发明的食品组合物使用食品作为原料，与一般药物不同，因此在其长期给予期间不会发生副作用，并且是高度便携的。

可以包含在本发明的食品组合物中的植物、其种子或其提取物的含量可以是例如基于最终制备的食品的0.01％至95％重量比，但不限于此。

[实施本发明的方式]

在下文中，将参考以下实施例和实验实施例更详细地描述本发明。然而，这些实施例和实验实施例仅用于说明目的，本发明的范围不受这些实施例和实验实施例的限制。

实施例1：具有粉质胚乳的新颖的水稻品种的选择

实施例1-1：‘三光’突变固定品系的固定品系的建立

用磷酸钾缓冲液稀释的叠氮化钠(NaN

实施例2：农艺性状的评价

在国立农业科学院(NICS)(Wanju)的试验田中，基于正常季节栽培施肥条件，对‘三光(SA)-flo3’品种的诸如茎长、穗长、分蘖数的主要农艺性状进行了评价。

如表1以及图1a和1b所示，作为比较实施例1中选择的‘三光(SA)-flo3’品种和原始品种(三光(Samkwang))的农艺性状的结果，证实了‘三光(SA)-flo3’品种相比于‘三光’具有低的籽粒硬度、每圆锥花序的小穗数、以及糙米的千粒重，但与中晚熟原始品种(三光)相比，其诸如抽穗期、茎长、穗长、分蘖数的农艺性状保持了相似的水平。

此外，在2020年11月8日，‘三光(SA)-flo3’被判定为适合专用中晚熟米粉品种的选择要求，并且2021年在对水稻新优良品系的局部适应性试验中被命名为‘Jeonju672’。

[表1]

2020年在国立农业科学院(Wanju,Jeonbuk)中在正常季节培养条件下进行的初级产量试验(PYT)中证实了‘三光(SA)-flo3’和原始品种(‘三光’)的主要农艺性状。

因此，于2020年10月29日在国立农业科学院农村振兴厅的韩国农业培养物保藏中心保藏‘三光(SA)-flo3’，登记号为KACC 98101P。

实施例3：具有粉质胚乳的水稻品种的选择

作为对实施例1-1中证实的‘三光’突变固定组的糙米外观进行评价的结果，选择了具有浑浊胚乳的品系。如图1c所示，可以在视觉上区分粉质胚乳和粘稻。

实施例3-1：胚乳F

为了对粉质胚乳进行遗传分析，于2020年6月在国立农业科学院的温室中公布了通过对来自原始品种‘三光’和‘三光(SA)-flo3’之间的杂交的F1植物进行自我施肥而生长的F2群体。对从‘三光’和‘三光(SA)-flo3’的杂交的F2种子的糙米进行目视评价，结果显示1,122个粘稻与363胚乳的分离比为3:1。从发育的F2群体中随机选择总共419个个体(338个粘稻和81个胚乳)，并确认作为遗传分析组，以寻找支配‘三光(SA)-flo3’的粉质胚乳特性的基因座。

通过收集遗传分析组‘三光(SA)-flo3’和原始品种‘三光’的一部分叶子并修改CTAB方法(Murray and Thompson,1980)来提取DNA。通过在1％琼脂糖凝胶上电泳证实了提取的DNA，并在使用NanoDrop分光光度计(Thermo Fisher science,USA)定量后稀释至用于PCR反应的适当浓度。

实施例4：鉴定与‘三光(SA)-flo3’的粉质胚乳特性相关的单核苷酸多态性位点

实施例4-1：DNA的提取

在收集相应的幼叶后，通过CTAB方法(Murray&Thomason,1980)提取具有粉质胚乳特性的‘三光’和‘三光(SA)-flo3’的DNA。

通过在0.8％琼脂糖凝胶上电泳证实了提取的DNA，并在使用NanoDrop分光光度计(Thermo Fisher Scientific,USA)定量后稀释至5ng/μL用于PCR。

实施例4-2：‘三光’和‘三光(SA)-flo3’的PPDK1(OS05G045000-02)基因序列的比较

基于水稻标准基因组信息(IRGSP 1.0)，证实了位于染色体5上的候选基因PPDK1(丙酮酸磷酸双激酶1)的转录本信息，并分析了OS05G0405000-02(19,718,538-19,737,605bp)中PPDK1的核苷酸序列(SEQ ID NO:1，登录号MW349590)。如图2所示，发现了与粉质胚乳特性相关的SNP，即对应于IRGSP标准基因组中19,721,940bp的位置，在‘三光’中是‘G’而在‘三光(SA)-flo3’中是‘A’。更具体地，证实了在OS05G0405000-02的354位置处的氨基酸甘氨酸(Gly,G)突变为天冬氨酸(Asp,D)。

实施例5：用于测定粉质胚乳特性的引物组的制备

实施例5-1：dCAPS引物组的制备

对于实施例4中鉴定的SNP，使用dCAPS Finder 2.0(http://helix.wustl.edu/dcaps/dcaps/html)制备dCAPS引物。对于由dCAPS扩增的区域，通过在含有已确定为多态性的SNP(19,721,940bp)的染色体5中添加21bp的悬垂至19,718,217,67-19,721,944bp(197bp)来扩增总共218bp，并搜索具有1bp错配的引物。

[表2]

用于dCAPS引物的引物序列

使用10ng DNA、5pmol正向和反向引物、0.2mM dNTP混合物、1X PCR缓冲液[50mMKCl,10mM Tris-HCl(pH9.0),0.1％Triton X-100,1.5mM MgCl

作为限制性内切酶，使用切割‘5...GTAC...3’位点的RsaI，并且如图3所示，由于‘三光’具有由SNP产生的GTAC序列，因此其被设计为被限制性内切酶切割，并且‘三光(SA)-flo3’不被限制性内切酶切割。使用1X酶缓冲液[50mM乙酸钾，20mM Tris-乙酸盐，10mM乙酸镁，100μg/mL BSA],10ng PCR产物和5U RsaI(NEB,UK)，总计15uL，进行通过限制内切酶的处理。

将所得物在琼脂糖凝胶上电泳，然后测定基因型。

因此，如表3和图3所示，证实了尽管扩增了218bp的‘三光’和‘三光(SA)-flo3’，但是‘三光’被RsaI限制酶切割成175bp和43bp，而‘三光(SA)-flo3’不被切割。

[表3]

限制性内切酶RsaI的切割位点

实施例5-2：四引物ARMS引物组的制备

为了制备能够省略用于搜索的SNP的限制性酶处理步骤的引物，使用引物1(用于四引物ARMS-PCR的引物设计，http://primer1.soton.ac.uk/primer1.html)来开发四引物ARMS-PCR引物。如表4所示，选择了能够区分具有粉质特性的‘三光(SA)-flo3’的SNP的引物组，其无需限制性内切酶处理。

收集各自的叶子后，用CTAB(十六烷基三甲基溴化铵)法(Murray&Thomason,1980)提取具有粉质胚乳特征的‘三光’和‘三光(SA)-flo3’的DNA。

通过在0.8％琼脂糖凝胶上电泳证实了提取的DNA，并在使用NanoDrop分光光度计(Thermo Fisher Scientific,USA)定量后稀释至5ng/μL，用于PCR。

[表4]

用于四引物ARMS-PCR的引物序列

具体地，当使用Flo4-6四引物ARMS-PCR引物进行PCR时，发现具有G等位基因的‘三光’具有Flo4-6-外向-F和Flo4-6-外向-R的644bp的PCR片段以及与G等位基因结合的Flo4-6-内向-F(G)和Flo4-6-外向-R的377bp的片段，而具有A等位基因的‘三光(SA)-flo3’具有Flo4-6-外向-F和Flo4-6-外向-R的644bp的PCR片段以及与A等位基因结合的Flo4-6-内向-R(A)和Flo4-6-外向-F的308bp的PCR片段。

[表5]

四引物-ARMS切割的位点

使用10ng DNA、5pmol总共4个引物、0.2mM dNTP混合物、1X PCR缓冲液[50mM KCl,10mM Tris-HCl(pH9.0),0.1％Triton X-100,1.5mM MgCl

因此，如图4所示，通过使用制备的Flo4-6四引物ARMS-PCR引物进行PCR，可以获得‘三光(SA)-flo3’的特异性片段。换句话说，发现了通过这些差异能够有效地确定‘三光(SA)-flo3’的粉质胚乳特性。

实施例6：用于确定‘三光(SA)-flo3’的粉质胚乳特性的引物的效果的验证

实施例6-1：用于‘三光’ב三光(SA)-flo3’的F

在与实施例5相同的条件下，使用‘三光’和‘三光(SA)-flo3’作为父本和母本，分析‘三光’和‘三光(SA)-flo3’杂交的F

实施例6-2：用于国产水稻品种的dCAPS引物组的效果的验证

此外，为了证实在具有相似遗传背景的群体中的选择效果，在与实施例5相同的条件下分析了在韩国栽培的32个国产水稻品种的DNA(1.Goun,2.Ungwang,3.Josaengheukchal,4.Odae 1,5.Shinunbong 1,6.Manna,7.Geumo 3,8.Hwangeumbora,9.Nunkeunheukchal,10.Asemi,11.Ondami,12.Jungmo 1032,13.Jinok,14.Baekilmi,15.Asemi 1,16.Haedam Rice,17.Mihyangbyeo,18.Shindongjin,19.Sujin,20.Hojin,21.Heukhyang,22.Junam,23.Goami,24.Dongjin 1,25.Hyangmibyeo 1,26.Nokyang,27.SegaeJinmi,28.Hanareum 3,29.Hanareum 4,30.Geumgang 1,31.Mokwoo,32.Mokyang)。

因此，如图6所示，仅发现了具有粉质胚乳特征的‘三光(SA)-flo3’为B型，并且发现了所有其他均为A型。

因此，发现了本发明的SNP和dCAPS引物能够用于有效地测定粉质胚乳特性。此外，证实了确定粉质胚乳的SNP与‘Suweon 542’(粉质胚乳，flo7)不同。

实施例6-3：四引物ARMS引物组的效果的验证

在与实施例5相同的条件下，使用‘三光’和‘三光(SA)-flo3’作为父本和母本，分析‘三光’和‘三光(SA)-flo3’的杂交的F

实施例7：米粉的物理化学性质的分析

实施例7-1：籽粒硬度的分析

为了比较在‘三光(SA)-flo3’和对照组中是否很好地表达了粉质胚乳特性，由于其低的籽粒硬度而在施加压力时容易破裂，使用TA.XTplus质地分析仪(Stable MicroSystems Ltds.UK)测量籽粒硬度。具体地，使用直径为5mm的探针对糙米施加压力(文本速率；0.4mm/sec，触发力；40.0g)以测量籽粒断裂点处的压力，对每一样品重复50次，并计算平均值和标准偏差。

因此，如下表6所示，证实了在诸如原始品种‘三光’(9.2kg)的粘稻中，‘三光(SA)-flo3’的籽粒硬度(3.0kg)非常低，并且低于‘Garumi 2’(3.1kg)，它是用于干磨面粉生产的现有品种。

[表6]

由试验研磨机生产的米粉的籽粒硬度和理化性质

实施例7-2：使用干磨生产米粉

考虑到小麦的特性，即种皮被去壳(裸壳)，将糙米用于所有的水稻样品。使用‘Buhler MLU-202’实验室研磨机(Buhler Bros.Inc.Swiss)，在相同条件下，将‘三光(SA)-flo3’、‘三光’(原始品种)和对照组(Garumi2)干磨。作为参比，Buhler研磨机由三组粉碎辊(B1,B2,B3)和轧辊(R1,R2,R3)组成，每一辊与每条线的筛分过程连接，并且最终产生了6个来自副产物(糠，短)的面粉级分和每一级分线(B1,R1,B2,R2,B3,R3)。根据参考文献(Methods 26-10,26-20,26-21A,26-30A,26-31,26-41,Approved Methods oftheAmerican Association ofCereal Chemists(美国谷物化学师协会的认定方法),10thEdition.2000.St.Paul,USA)进行使用‘Buhler MLU-202’的干磨法。在本发明中，通过对从六个级分生产的所有米粉求和来评价通过干磨生产的米粉。

实施例7-3：米粉的籽粒硬度和物理化学性质的分析

使用激光衍射粒度分析仪(LS13320型，Beckman Clter,Inc.)来测量在相同条件下通过干磨生产的米粉的平均粒径和粒径分布(面粉的直径分布)。

因此，如下表7所示，证实了‘三光(SA)-flo3’(65.3μm)的米粉的平均粒径略大于先前开发的‘Garumi 2’的米粉的平均粒径(61.5μm)，并且显著小于原始品种‘三光’的米粉的平均粒径(91.1μm)。

根据米粉的大小，这种趋势在每一级分的平均粒径中保持良好，并且再次证实了，‘三光(SA)-flo3’能够仅使用干磨在类似于先前开发的‘Garumi 2’的水平上比其他水稻品种更精细地粉碎。

[表7]

试验研磨机生产的米粉的粒度分布比较

实施例7-4：米粉的受损淀粉比率的测量

当使用普通粘稻干磨生产米粉时，最大的问题是由于水稻的高籽粒硬度，淀粉颗粒的物理损坏。对淀粉颗粒的损坏极大地影响面团性质。此外，损坏的淀粉颗粒被快速地水合并容易地被α-或β-淀粉酶水解并转化成可发酵的糖，这促进了过度的发酵以及由于在加工过程中产生不适当的气体而减少了加工产物的体积(Starch Damage in Advances inCereal Science and Technology(谷物科学与技术中淀粉损坏的进展).Vol.VII.pp321-349,American Association of Cereal Chemists Inc.St.Paul,USA)。

因此，使用商业分析试剂盒(淀粉损坏测定试剂盒，Megazyme,Ireland)来评价在相同条件下通过干磨生产的米粉的受损淀粉比率。在该试剂盒中，将碾磨的米粉加入至酶反应溶液中进行反应，然后显色以使用分光光度计分析损坏的淀粉颗粒的量。

因此，如图8中所示，‘三光(SA)-flo3”的米粉中的受损淀粉比率(6.0％)与‘Garumi 2’(4.9％)没有显著差异，但是显著低于原始粘稻品种‘三光’(12.0％)。

基于上述结果，本发明的“三光(SA)-flo3”具有几乎与‘Garumi 2’相当的粉质胚乳特性，并且因此已被证实是适于仅通过干磨生产具有细颗粒和低受损淀粉含量的优质米粉的水稻品种。

实施例7-5：米粉的其他物理化学性质的评价

作为用于鉴定使用小麦研磨机生产的本发明的‘三光(SA)-flo3’的米粉的表型的手段，在特定水分含量条件下测量米粉的亮度(CIE值)，并且还测量米粉的灰分含量。根据参考文献(Approved Methods ofthe American Association of Cereal Chemists(美国谷物化学师协会的认定方法),10th Edition.2000.St.Paul,USA)进行所用的调查和测量方法。

从表6能够看出，本发明的‘三光(SA)-flo3’的米粉的白度为灰分含量，其通常已知与碾磨过程中糠层的混合速率具有高度正相关性，对于‘三光’为0.67，对于‘三光(SA)-flo3’为0.64，以及对于‘Garumi 2’为0.58，并且这些米粉之间无显著差异。

根据上述内容，本发明所属领域的技术人员将能够理解，本发明可以在不修改本申请的技术概念或基本特征的情况下以其他特定形式来实施。在这一点上，本文公开的示例性实施方案仅用于说明的目的，而不应被解释为限制本发明的范围。相反地，本发明旨在不仅覆盖示例性实施方案，而且覆盖可以包括在由所附权利要求书限定的本发明的精神和范围内的各种替换、修改、等同物和其他实施方案。

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