多巴胺能神经前体细胞冻存液和冻存方法

技术领域

本发明涉及细胞冻存技术领域，具体涉及一种多巴胺能神经前体细胞冻存液、和冻存方法。

背景技术

帕金森病(Parkinson’s disease，PD)是最为普遍的神经退性疾病之一，全球目前约有600万患者，中国的PD患者人数居世界第一。我国65岁以上的老年人中PD发病率约为1.7％，每年新发病例近十万人。世界卫生组织专家预测，中国2030年的PD患者将达到500万人。随着PD发病人数的逐年增加，PD用药市场规模不断扩大，现有治疗方案主要是通过补充多巴胺来缓解PD患者的症状，无法治愈或逆转PD病程的发展，并且有严重的毒副作用，因而急需引入新的治疗方法。PD的典型病理特征是中脑黑质区域多巴胺能神经元的丢失，因此利用细胞移植治疗PD是目前最有希望治愈和控制该疾病的方法。

人多能干细胞具有无限增殖能力，并且在体外能够分化为几乎所有功能细胞，包括神经细胞。因此，可以利用人多能干细胞诱导分化为多巴胺能神经前体细胞，从而应用于临床研究，通过细胞移植来治疗PD。

细胞冷冻技术作为一种细胞存储的有效方法，是再生医学细胞药物保存的主要研究方向之一。冷冻保存可以实现在任何时候都及时使用细胞，同时降低微生物污染的风险。神经细胞，尤其是多能干细胞诱导分化而来的多巴胺能神经前体细胞，不仅要考虑冻存细胞复苏后的活率和回收率，还要考虑复苏后细胞的纯度和分化状态，以及是否仍具有继续成熟分化的潜能。用现有的细胞冻存保护液冻存复苏后，细胞活率和回收率都会较冻存前出现明显下降，导致复苏之后的活细胞数量较少从而并不适合直接做细胞移植。现有冻存保护液中大多基础液是细胞培养基，成分复杂，不仅会显著增加冻存成本，而且不利于临床应用；部分冻存保护液中含有胎牛血清，其成分不明晰，批次间差异大，不利于存储临床级细胞而且不利于临床应用。此外，现有冻存液冻存组分复杂，细胞复苏后需要反复多次洗涤以适用于临床应用，从而导致细胞损失大。目前还未探索出一种较为理想的神经细胞冻存液。

因此，开发一种无血清、成分简单明确且能够同时确保复苏后的神经细胞活率和回收率且维持细胞功能的冻存保护液，是拓展神经干细胞临床应用的重要课题。

发明内容

为了解决上述问题，本发明提供了一种多巴胺能神经前体细胞冻存液，其不含血清和动物源成分，所述多巴胺能神经前体细胞冻存液包含临床级冻存基础液、非渗透性冷冻保护剂和渗透性冷冻保护剂，其中所述非渗透性冷冻保护剂的质量浓度小于10％且所述渗透性冷冻保护剂的质量浓度小于15％，所述非渗透性冷冻保护剂为注射级人血清白蛋白(HSA)，所述渗透性冷冻保护剂为注射级DMSO，所述临床级冻存基础液为右旋糖酐氯化钠注射液，所述多巴胺能神经前体细胞冻存液还包含能够提高多巴胺能神经前体细胞回收率的添加剂。

优选的，所述多巴胺能神经前体细胞冻存液由右旋糖酐氯化钠注射液、注射级HSA和注射级DMSO以及所述能够提高多巴胺能神经前体细胞回收率的添加剂组成。

优选的，所述能够提高多巴胺能神经前体细胞回收率的添加剂的浓度为0.2-100μg/ml。

更优选的，所述能够提高多巴胺能神经前体细胞回收率的添加剂的浓度为0.2-60μg/ml。

优选的，所述能够提高多巴胺能神经前体细胞回收率的添加剂为Y-27632、抗坏血酸和维生素E中的至少一种。

更优选的，所述能够提高多巴胺能神经前体细胞回收率的添加剂为Y-27632与抗坏血酸的组合。

优选的，所述多巴胺能神经前体细胞冻存液中注射级DMSO的质量浓度等于或大于5％且小于15％，注射级HSA的质量浓度等于或大于1％且小于10％。

更优选的，所述多巴胺能神经前体细胞冻存液中注射级DMSO的质量浓度为7.5％-10％，注射级HSA的质量浓度为1％-5％。

本发明提供了一种多巴胺能神经前体细胞的冻存方法，包括以下步骤：使用本发明提供的多巴胺能神经前体细胞冻存液将多巴胺能神经前体细胞进行冻存。

优选的，所述多巴胺能神经前体细胞在所述多巴胺能神经前体细胞冻存液中的冻存密度为4×10

有益效果

本发明的多巴胺能神经前体细胞冻存液各组分相互配合，能够大大减少冻存过程中对细胞的伤害并确保高细胞活率，显著提高细胞复苏后回收率，尤其是复苏后培养24小时的回收率，并维持细胞的纯度和继续成熟分化的潜能。此外，本发明的多巴胺能神经前体细胞冻存液组分简单，均采用临床级试剂，不含血清和动物源成分，无羟乙基淀粉等大分子物质，冻存后仅需少量洗涤即可直接注射，从而显著减少洗涤过程所带来的细胞损失，更适于临床级多巴胺能神经前体细胞的存储，使用本发明冻存液冻存的多巴胺能神经前体细胞在复苏后能直接用于细胞移植，并能显著改善6-OHDA造模裸大鼠的行为学，因此本发明细胞冻存液为神经系统再生医学药物的保存及临床应用提供了重要工具。

附图说明

下面结合附图和实施例对本发明进行进一步说明。在附图中：

图1为细胞冻存的操作流程图；

图2为细胞复苏的操作流程图；

图3为冻存液中Y-27632、抗坏血酸(Ascorbic acid)和/或维生素E(VE)对多巴胺能神经前体细胞-A冻存后活率(Viability)以及0小时回收率(0h Recovery)和24小时回收率(24h Recovery)的影响；

图4为冻存液中DMSO和HSA浓度对多巴胺能神经前体细胞-A冻存后活率以及0小时和24小时回收率的影响；

图5为冻存液中Y-27632、抗坏血酸和不同浓度DMSO对多巴胺能神经前体细胞B冻存后活率以及0小时和24小时回收率的影响；

图6为不同冻存基础液对多巴胺能神经前体细胞-B冻存复苏后培养24小时的细胞生长状态；

图7为不同冻存基础液对多巴胺能神经前体细胞-B冻存后活率以及0小时和24小时回收率的影响；

图8为不同分化阶段的多巴胺能神经前体细胞(A和B)在不同细胞冻存密度下的测试结果；

图9为多巴胺能神经前体细胞B冻存复苏后体外成熟分化14天后的细胞免疫荧光染色结果；

图10为帕金森模型裸大鼠注射冻存复苏后的多巴胺能神经前体细胞B后的转圈行为学测试结果；

图11为帕金森模型裸大鼠注射冻存复苏后的多巴胺能神经前体细胞B后的脑片免疫荧光染色结果。

具体实施方式

下面将结合实施例来详细说明本发明。需要说明的是，在不冲突的情况下，本发明中的实施方案及实施例中的特征可以相互组合。

本发明提供的多巴胺能神经前体细胞冻存液不含血清和动物源成分，所述多巴胺能神经前体细胞冻存液包含临床级冻存基础液、非渗透性冷冻保护剂和渗透性冷冻保护剂，其中所述非渗透性冷冻保护剂的质量浓度小于10％且所述渗透性冷冻保护剂的质量浓度小于15％，所述非渗透性冷冻保护剂为注射级HSA，所述渗透性冷冻保护剂为注射级DMSo，所述临床级冻存基础液为右旋糖酐氯化钠注射液，所述多巴胺能神经前体细胞冻存液还包含能够提高多巴胺能神经前体细胞回收率的添加剂。

本发明提供的多巴胺能神经前体细胞冻存液可以由右旋糖酐氯化钠注射液、注射级HSA和注射级DMSO以及所述能够提高多巴胺能神经前体细胞回收率的添加剂组成。

本发明中的冻存基础液右旋糖酐氯化钠注射液为医用药典级注射液，能够直接应用于临床，右旋糖酐氯化钠注射液作为冻存基础液时可以明显增加冻存细胞的回收率，尤其是24小时回收率。HSA的添加是必要的，HSA能在细胞冻存和复苏过程中保护细胞膜，可确保冻存复苏过程中细胞的活力，增加细胞的回收率。本发明冻存液中DMS0能够渗透到细胞内，增加胞内渗透压，降低冰点，延缓冻存过程，使细胞中部分水分在冻结前透出细胞，减少冷冻降温过程中胞内冰晶形成，从而保护细胞，减少细胞冷冻损害，增加细胞冻存液对细胞的保护作用。本发明所述的添加剂能够显著提高细胞复苏后回收率，尤其是复苏后培养24小时的回收率，同时基本维持细胞复苏后的活率。上述三种组分相互协同，可以确保复苏后的细胞具有较高的活率和回收率并维持细胞继续成熟分化的潜能。

多巴胺能神经前体细胞冻存液可以不包含羟乙基淀粉、甲基纤维素等高分子冷冻保护剂。因而可以避免在细胞移植时冻存并洗涤后残留的这些高分子冷冻保护剂对人体的不良影响。

本发明中，能够提高多巴胺能神经前体细胞回收率的添加剂的浓度为0.2-100μg/ml，优选为0.2-60μg/ml。

本发明中，能够提高多巴胺能神经前体细胞回收率的添加剂为Y-27632(4-[(1R)-1-氨基乙基]-N-(吡啶-4-基)环己烷-1-甲酰胺二盐酸盐)、抗坏血酸和维生素E中的至少一种。

本发明中，能够提高多巴胺能神经前体细胞回收率的添加剂为Y-27632与抗坏血酸的组合。

本发明冻存液中Y-27632和抗坏血酸可以相互协同，能更显著提高多巴胺能神经前体细胞的回收率，尤其是24h细胞回收率。细胞冻存复苏后若细胞状态不佳将不利于临床应用，通过24h细胞回收率则能够充分了解细胞冻存复苏后的细胞状态，判断冻存液的冻存效果。

本发明中的多巴胺能神经前体细胞冻存液中注射级DMSO的质量浓度等于或大于5％且小于15％，注射级HSA的质量浓度等于或大于1％且小于10％。

本发明中的多巴胺能神经前体细胞冻存液中注射级DMSO的质量浓度为7.5％-10％，注射级HSA的质量浓度为1％-5％。在此浓度范围内，冻存液可以为冻存复苏后的细胞提供更高的细胞回收率，尤其是24小时细胞回收率。

本发明提供的多巴胺能神经前体细胞的冻存方法，包括以下步骤：使用本发明提供的多巴胺能神经前体细胞冻存液将多巴胺能神经前体细胞进行冻存。

更具体的，包括以下步骤：

1)将多巴胺能神经前体细胞与本发明所述的冻存液混合，具体操作步骤为细胞消化后收集，缓慢加入一定量的细胞冻存液，边加边晃动细胞悬液，使细胞与冻存液混合充分。细胞计数，根据计数结果用细胞冻存液将细胞密度调至冻存密度。

2)细胞冻存。将细胞混合液按标定量分装至冻存管中，然后转移至程序降温盒(Nalgene)中或程序降温仪中进行冻存后，将冻存管转于液氮中。

采用本发明的冻存液对多巴胺能神经前体细胞进行程序降温冻存包括下述步骤：A.4℃平衡(调整好冻存液中多巴胺能神经前体细胞的密度后，分装细胞至冻存管，置于4℃平衡)；B.以1℃/min的降温速率降温至-4℃；C.以25℃/min的降温速率降温至-40℃；D.以10℃/min的升温速率升温至-12℃；E.以1℃/min的降温速率降温至-40℃；F.以10℃/min的降温速率降温至-80℃。

本发明中多巴胺能神经前体细胞在所述多巴胺能神经前体细胞冻存液中的冻存密度可以为4×10

更进一步的，本发明中多巴胺能神经前体细胞在所述多巴胺能神经前体细胞冻存液中的冻存密度为4-10×10

下面具体描述本发明多巴胺能神经前体细胞冻存液的制备方法。在制备方法中，将注射级HSA、注射级DMSO和能够提高多巴胺能神经前体细胞回收率的添加剂溶解于右旋糖酐氯化钠注射液中并且进行混合。

更具体地，例如，添加剂为抗坏血酸和/或维生素E时，配制方法包括以下步骤：1)将抗坏血酸和/或维生素E与HSA充分溶解于右旋糖酐氯化钠注射液中，并用滤网过滤除菌；2)缓慢滴加DMSO并充分混匀。添加剂为抗坏血酸和/或维生素E和Y-27632时，配制方法包括以下步骤：1)将抗坏血酸和/或维生素E与HSA充分溶解于右旋糖酐氯化钠注射液中，并用滤网过滤除菌；2)加入Y-27632并缓慢滴加DMSO，充分混匀。其中，使用的滤网为0.22μM的滤网。配制过程中，因DMSO加入体积大，需要缓慢滴加，各组分充分混匀，配制好的冻存液于4℃保存。

本发明所述多巴胺能神经前体细胞复苏后经临床级医用注射液洗涤并离心后，进行细胞重悬制备成神经细胞制剂。医用注射液包括右旋糖酐氯化钠注射液，复方电解质注射液等。

实施例

下面结合实施例对本发明进行详细的说明，但不能把他们理解为对本发明保护范围的限定。

下述实施例中试剂和原料来源的说明如下，应当说明的是本发明对所用试剂材料的来源不做限制。

Blebbistatin购自MCE，#HY-13441；抗坏血酸购自Sigma，#A5960；Y-27632购自MCE，#HY-10071；DMSO购自Origen biomedical，#CP-70；HSA购自成都蓉生，国药准字S10940024；右旋糖酐氯化钠注射液购自石家庄四药有限公司，国药准字H13022493；复方电解质注射液购自山西振东泰盛制药有限公司；乳酸钠林格氏注射液购自中国大冢制药有限公司，国药准字H12020009；维生素E购自Sigma，#T3251；Trolox购自MCE，HY-101445；裸大鼠购自北京维通利华，品系为Crl：NIH-Foxnlnu；中脑多巴胺能神经前体细胞由安徽中盛溯源生物科技有限公司诱导iPSC分化获得(CN202210329415.8)。

实施例1：Y-27632、抗坏血酸和/或维生素E对多巴胺能神经前体细胞-A冻存效果的影响

本实施例中测试Blebbistatin、Y-27632、抗坏血酸、维生素E和Trolox对多巴胺能神经前体细胞-A冻存的影响。实施例中的多巴胺能神经前体细胞-A是分化或扩增时期的具有增殖性的多巴胺能神经前体细胞，表达Lmx1a/Foxa2/En1/0tx2。

配方1-1的配制方法包括以下步骤：将HSA充分溶解于右旋糖酐氯化钠注射液中，并用0.22μM滤网过滤除菌；然后缓慢滴加DMSO，并充分混匀，于4℃保存。配方1-2至配方1-9的配制方法包括以下步骤：将抗坏血酸、维生素E和/或Trolox与HSA充分溶解于右旋糖酐氯化钠注射液中，并用0.22μM滤网过滤除菌；和/或加入Blebbistatin或Y-27632，并缓慢滴加DMSO，充分混匀。

多巴胺能神经前体细胞冻存液的具体配制比例如表1所示，其中HSA和DMSO的浓度以体积百分比表示，Blebbistatin、Y-27632、维生素E和Trolox的浓度以μM表示，抗坏血酸的浓度以μg/ml表示，μM和μg/ml之间可以进行换算。

表1不同组成的冻存液组分配比

细胞冻存步骤如图1所示，消化收集培养的多巴胺能神经前体细胞，细胞计数后加入细胞冻存液，调整细胞冻存密度为6×10

细胞复苏步骤如图2所示，取出冻存细胞的冻存管，将冻存管置于37.0℃水浴中不断摇晃使冻存的细胞迅速融化。

复苏后的细胞进行细胞计数，计算0h细胞活率和0h细胞回收率，其中0h细胞活率＝细胞复苏后检测到的活细胞数/细胞复苏后检测到的总细胞数，和0h细胞回收率＝细胞复苏后检测到的活细胞数/冻存前的总细胞数。复苏后的细胞接种培养24h后消化并收集，通过细胞计数可以得到24小时贴壁率＝细胞复苏后将冻存细胞接种到2D培养基质上培养24小时候实际贴壁的活细胞数/接种的细胞数，24小时细胞回收率＝24小时贴壁率×0h回收率。

冻存细胞复苏后细胞活率的检测。吸取复苏后的细胞悬液50ul加入450ul DPBS(杜氏磷酸盐缓冲液)中，用Vi-cell检测细胞活率(图3A)和活细胞数。

冻存细胞复苏后0h细胞回收率的检测。0h细胞回收率＝活细胞数/6×10

冻存细胞复苏后24小时细胞回收率＝24小时贴壁率×0h回收率(图3C)。

如图3A-3C所示，通过将配方1-3至1-5和1-7至1-9与配方1-1的实验结果进行对比可以看出，添加Y-27632(Rock抑制剂)、抗坏血酸和维生素E(两者均为抗氧化剂)中的每一种或者添加它们的组合可以显著提高细胞回收率，尤其是24小时细胞回收率，同时基本可以维持高细胞活率，尤其是Y-27632和抗坏血酸的组合提高细胞冻存后的24h细胞回收率的效果最佳。而将配方1-2与配方1-1进行对比可以看出，尽管Blebbistatin与Y-27632都属于Rock抑制剂，但是Blebbistatin并不能像Y-27632起到提高细胞回收率的作用，包括0小时和24小时细胞回收率。配方1-6中Trolox(维生素E衍生物)与Y-27632一起添加仅可以明显提升0小时细胞回收率，而不能提升24小时细胞回收率。

实施例2：HSA和DMSO的浓度对多巴胺能神经前体细胞-A冻存的影响

多巴胺能神经前体细胞冻存液的具体配制比例如表2所示，具体配制方法同实施例1。

表2不同HSA和DMSO浓度冻存液的组分配比

细胞冻存密度为6×10

如图4A-4C所示，配方2-4、配方2-8和配方2-12中不含HSA，其细胞回收率，尤其是24小时回收率明显低于添加HSA的配方。因此，HSA的添加是必要的，HSA的添加可以增加冻存细胞回收率。此外，配方2-1至2-3、2-5至2-7、2-9至2-11均具有较高的细胞活率、0小时细胞回收率和24小时细胞回收率。

实施例3：多巴胺能神经前体细胞-B在冻存液中的冻存效果验证

多巴胺能神经前体细胞-B是早期成熟阶段的多巴胺能神经细胞，由多巴胺能神经前体细胞-A继续成熟分化3-7天获得，表达Nurr1/Sox6等多巴胺能神经元早期特异性指标，并且细胞增殖性下降，常作为脑内移植的细胞来源。

多巴胺能神经前体细胞冻存液的具体配制比例如表3所示，具体配制方法同实施例1。

表3多巴胺能神经前体细胞冻存液组分配比

细胞冻存密度为6×10

如图5A-5C所示，配方3-2至3-10的冻存液中加入Y-27632和抗坏血酸中至少一种，对多巴胺能神经前体细胞B有冻存保护作用，其中DMSO的浓度范围在7.5％-10％尤其是在10％时，冻存细胞的24小时细胞回收率最高、效果最佳，尤其是同时加入Y-27632和抗坏血酸可以相互协同，明显增加冻存细胞的24小时回收率。

实施例4：多巴胺能神经前体细胞冻存基础液的优化

选用不同医用药典级别注射液作为基础液测试冻存效果。细胞冻存液的具体配制比例如表4，具体配制方法同实施例1。

表4含有不同冻存基础液的细胞冻存液组分配比

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细胞冻存密度为6×10

如图6所示，培养24h后通过镜下观察细胞贴壁情况，可知右旋糖酐氯化钠注射液作为冻存基础液的配方4-3相比于配方4-1和4-2可以明显增加冻存细胞复苏后的24小时贴壁率。同时根据回收率计算结果可以看出，相对于复方电解质注射液和乳酸钠林格氏注射液，右旋糖酐氯化钠注射液作为冻存基础液时可以明显增加冻存细胞的回收率，尤其是24小时回收率。

实施例5：多巴胺能神经前体细胞冻存密度测试

细胞冻存密度会影响细胞的冻存效果，本实施例进一步测试了不同细胞冻存密度对多巴胺能神经前体细胞-A和多巴胺能神经前体细胞-B冻存的影响，细胞冻存密度选取：4×10

将多巴胺能神经前体细胞A和多巴胺能神经前体细胞B分别按上述测试密度进行分装于含有本发明所述冻存液的冻存管中，1ml/管，放置于程序降温盒后降温至-80℃，第二天将冻存管转于液氮中。复苏细胞时，用干冰转运细胞至细胞间，取出冻存管在37℃水浴中快速复苏直至冰晶消失。取出50ul细胞悬液加入450ul DPBS中，用Vi-cell检测细胞活率(图8A)和活细胞数。0h细胞回收率＝活细胞数/初始活细胞数(图8B)。按计数结果，接种2×10

如图8A-8C所示，对于多巴胺能神经前体细胞，最佳的冻存密度为4×10

实施例6：多巴胺能神经前体细胞B冻存复苏后体外成熟分化

采用实施例1表1中配方1-7的冻存液冻存复苏的多巴胺能神经前体细胞-B，用3D分化方式进行成熟分化。按1×10

3D培养的多巴胺能神经前体细胞-B，染色操作如下：

(1)将EB用4％PFA固定1天，30％蔗糖脱水3-4天，并速冻切片，厚度为30μm；

(2)将EB切片贴于防脱片上，风干后进行染色，确保切片紧紧贴于防脱片上；

(3)DPBS洗1遍，0.2％TritonX-100透膜10分钟；

(4)10％驴血清室温封闭1小时；

(5)DPBS洗涤1遍，加入一抗Mouse anti-TH(1∶500)，室温孵育30分钟后转至4℃孵育过夜；

(6)第二天，将孵育的切片转移至室温，静置30分钟；

(7)DPBS洗涤1遍，加入二抗Donkey anti mouse A488(1∶500)，室温避光孵育30分钟；

(8)DPBS洗涤3遍，加入DAPI(1∶1000)，室温避光孵育10分钟；

(9)DPBS洗涤2遍，ddH2O洗涤1遍；

(10)将染色后的多巴胺能神经前体细胞B在免疫荧光显微镜下观察并拍照。

结果如图9所示，中脑多巴胺能神经元(TH+)细胞呈绿色荧光，细胞核呈蓝色荧光。因此，采用所述冻存液冻存复苏后的多巴胺能神经前体细胞-B能够继续成熟分化为具有典型特征的成熟多巴胺能神经元。

实施例7：多巴胺能神经前体细胞-B冻存复苏后体内分化及功能验证

裸大鼠帕金森模型建立：裸大鼠经异氟烷吸入麻醉(2.5％)，头部皮肤备皮，酒精消毒后切开皮肤暴露颅骨，找到颅骨前囟处，以此为中心确定原点，用脑定位仪依照坐标：位点X＝+1 92mm(右移)，Y＝-2.00mm(前移)，Z＝-8.5mm(深度)；标记MFB位置：使用小动物骨钻小心将标记处一小孔(直径0.6mm)，缓慢下针调整好深度后留针2分钟，开始注射4μl6-OHDA化合物溶液，注射时长10分钟；注射完毕后留针5分钟，缓慢拔针5分钟，最后用骨蜡封佳小孔。

复苏采用实施例1表1中配方1-7的冻存液冻存的多巴胺能神经前体细胞-B，复苏后的细胞使用复方电解质注射液洗涤1次，离心后用复方电解质液重悬至1×10

行为学测试后，对裸大鼠进行灌流、取脑和脑切片(30μm)，并对移植物较大面积区域的脑片进行免疫荧光染色，一抗为Rabbit anti-TH(1∶500)，Mouse anti-human nuclei(1∶1000)；二抗分别为Donkey anti rabbit A594(1∶1000)，Donkey anti mouse A488(1∶500)。免疫荧光显微镜下观察并拍照。如图11所示，中脑多巴胺能神经元(TH+细胞)呈红色荧光，人细胞核(hNuc+细胞)呈绿色荧光。

综上所述，多巴胺能神经前体细胞B采用本发明所述冻存液冻存复苏后移植于帕金森模型裸大鼠能够继续成熟分化为成熟的多巴胺能神经元，并能在体内发挥生理功能，改善模型大鼠的行为学。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进，这些改进也应视为本发明的保护范围。