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利用琼脂生产副产物制作植物组织培养基方法及组培工艺

文献发布时间：2024-04-18 19:59:31

【技术领域】

本发明涉及植物培养基制备技术领域，具体涉及利用琼脂生产副产物制作植物组织培养基方法及组培工艺。

【背景技术】

植物组织培养所用的培养基，一般均采用琼脂作凝固剂的固体培养基。因此在工厂化育苗中，琼脂量需求较大、而且价格昂贵成本高，严重影响育苗的经济效益。此外，常规的植物组培常见问题有如下情况：

植物组织培养中，对外植体进行切割时，伤口处的细胞被破坏，这种分隔被打破，在氧气存在的条件下，多酚氧化酶(PPO)将酚类化合物氧化成褐色的醌类化合物，再在酪氨酸酶等酶的作用下，外植体细胞中的蛋白质聚合，进而引起细胞生长停滞甚至死亡；所以现有的植物培养基褐变率高，进而可能导致组培失败；而且组培植株体内可溶性蛋白和总糖的含量一般低于野生植株，同时组培植株的根系直接影响到植株的强弱，然而组培植株体的根系经常出现发育不良的概率。

鉴于此，本案发明人对上述问题进行深入研究，遂有本案产生。

【发明内容】

本发明要解决现有植物组织培养基存在培育成本高、组培时褐变率高的技术问题，在于提供一种利用琼脂生产副产物制作植物组织培养基方法及组培工艺。

本发明是这样实现的：一种利用琼脂生产副产物制作植物组织培养基方法，包括如下步骤：

步骤一：制备培养基母液；

步骤二：制备改性琼脂生产副产物：从过滤板卸下琼脂生产副产物，加入开水浸泡使得琼脂生产副产物有一定的流动状态；用打浆机将一些还抱团的琼脂生产副产物打散均匀，再用均质机将琼脂生产副产物的各种成分混合均匀；加入纤维素酶进行水解，水解完毕后再用均质机混合均匀得到浆料；将浆料抽入滚筒进行干燥、粉碎、过筛，获得成品改性琼脂生产副产物；

步骤三：植物组织培养基制作：称取改性琼脂生产副产物，倒入培养基母液中，改性琼脂生产副产物的添加比例为总培养基溶液的5～20％，100℃高温加热搅拌，之后培养基趁热分装于组培瓶；

步骤四：成品：将组培瓶盖上盖子，在110-125℃温度下高压灭菌30分钟，最后冷却至常温，即得植物组织培养基。

进一步的，所述琼脂生产副产物的成分包括：

珍珠岩40-55％

琼脂10-15％

纤维10-20％

水10-40％。

进一步的，在步骤二中，打浆时，温度控制在90～100℃。

进一步的，在步骤二中，所述纤维素酶的质量分数为0.1～0.6％；水解时长为6～8小时。

进一步的，在步骤三中，所述改性琼脂生产副产物的添加比例为总培养基溶液的8-14％。

进一步的，在步骤四中，灭菌温度为121℃。

进一步的，在步骤一中，所述培养基母液的制备方法包括如下步骤：

步骤1.1：根据MS、White、B5、SH、N6、NN、DKW等植物培养基母液的配制方法，配制得到母液A；

步骤1.2：称取100mg植物生长调节物质，水浴加热，最后定容至100mL，即得1mg/mL的母液B；

步骤1.3：称取母液A放入烧杯中，量取所需浓度的母液B加入烧杯中，摇荡均匀，添加2％～4％蔗糖到配制的溶液中，搅拌溶解；

步骤1.4：用酸度计或PH试纸测溶液PH值，用氢氧化钠或者盐酸调节PH值，直到培养基溶液的pH为6～8为止；即得所需培养基母液。

进一步的，在步骤1.2中，所述植物生长调节物质包括萘乙酸、6-苄氨基嘌呤中的一种或者两种；萘乙酸水浴加热时使用少量乙醇溶解，6-苄氨基嘌呤水浴加热时使用少量NaOH溶液溶解。

另一方面，一种组培工艺，使用上述利用琼脂生产副产物制作植物组织培养基方法制得植物组织培养基；然后接种、培养、移栽。

本发明的优点在于：

1、本发明使用改性琼脂生产副产物替琼脂制作培养基，可用于在MS、White、B5、SH、N6、NN、DKW等植物培养组织基中做凝固剂，大大降低了制作成本，提高了经济效益。

2、本发明的改性琼脂生产副产物含有珍珠岩和改性纤维等，可作为吸附剂吸附褐变产生的醌类化合物，同时培养基环境下褐变产生的有害物质能够较快被转移走，减轻毒害作用和进一步阻止褐变；进而降低组培的褐变率。改性琼脂生产副产物添加浓度越高抗褐变效果越好。

3、本发明的改性琼脂生产副产物作用类似于腐殖土，能够吸附植物生长调节物质与其他有利生根的物质，有利于根系生长的条件，故能够促进组培苗生根。

4、由于本发明的改性琼脂生产副产物能够促进根的形成与生长，也形成了较强的吸收水分和无机盐等营养物质的能力，为蛋白质和糖类的生物合成提供丰富的原料；同时酶解后的纤维也为其提供丰富的原料；进而可明显提高组培植株体内的可溶性蛋白和总糖的含量。

【附图说明】

下面参照附图结合实施例对本发明作进一步的说明。

图1是实施例一中利用琼脂生产副产物制作植物组织培养基方法的工艺流程图。

图2是实施例一中改性琼脂生产副产物的制备流程图。

图3是实施例一中培养基母液的制备流程图。

图4是实施例二中组培工艺的流程图。

【具体实施方式】

为使本发明实施方式的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施方式中的附图，对本发明实施方式中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施方式是本发明一部分实施方式，而不是全部的实施方式。基于本发明中的实施方式，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施方式，都属于本发明保护的范围。因此，以下对在附图中提供的本发明的实施方式的详细描述并非旨在限制要求保护的本发明的范围，而是仅仅表示本发明的选定实施方式。基于本发明中的实施方式，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施方式，都属于本发明保护的范围。

实施例一

参照附图1-3所示，本实施例提供一种利用琼脂生产副产物制作植物组织培养基方法，包括如下步骤：

步骤一：制备培养基母液。

步骤二：制备改性琼脂生产副产物：从过滤板卸下琼脂生产副产物温度一般在55～100℃之间，加入开水浸泡使得琼脂生产副产物有一定的流动状态；利用打浆机将一些还抱团的琼脂生产副产物打散均匀，此时温度控制在90～100℃；再用均质机将琼脂生产副产物的各种成分混合均匀；加入纤维素酶进行水解，水解完毕后再用均质机混合均匀得到浆料；将浆料抽入滚筒进行干燥、粉碎、过筛，获得成品改性琼脂生产副产物。

步骤三：植物组织培养基制作：称取改性琼脂生产副产物，倒入培养基母液中，改性琼脂生产副产物的添加比例为总培养基溶液的5～20％，100℃高温加热搅拌，之后培养基趁热分装于组培瓶。

步骤四：成品：将组培瓶盖上盖子，在110-125℃温度下高压灭菌30分钟，最后冷却至常温，即得植物组织培养基。

本实施例提供的利用琼脂生产副产物制作植物组织培养基方法的优点在于：

1、现有的植物组织培养所用的培养基，一般采用琼脂作凝固剂的固体培养基，因此在工厂化育苗中，琼脂量需求较大、但由于琼脂价格昂贵导致培养基制备成本高，严重影响育苗的经济效益。为了降低成本、增加收入，本实施例使用琼脂生产副产物为主要原料，制得改用改性琼脂生产副产物以代替琼脂，用于制作植物组织培养基所需的凝固剂，并且改性琼脂生产副产物的添加比例仅为总培养基溶液的5～20％，大大的降低了培养基的制作成本，提高了经济效益。

2、改性琼脂生产副产物含有珍珠岩和改性纤维等，可作为吸附剂吸附褐变产生的醌类化合物，同时培养基环境下褐变产生的有害物质能够较快被转移走，减轻毒害作用和进一步阻止褐变，进而降低组培的褐变率。

3、改性琼脂生产副产物能够吸附植物生长调节物质与其他有利生根的物质，促进组培苗生根。

4、由于培养基中加入了改性琼脂生产副产物，能够促进根的形成与生长，也形成了较强的吸收水分和无机盐等营养物质的能力，为蛋白质和糖类的生物合成提供丰富的原料；同时琼脂生产副产物酶解时产生了大量的纤维，也为组培苗的生长提供了丰富的原料。

在步骤二中，刚卸下来的所述琼脂生产副产物的成分包括：珍珠岩40-55％、琼脂10-15％、纤维10-20％、水10-40％。琼脂生产副产物酶解之后生成改性纤维，为植物的根系生长提供了丰富的原料。

在步骤二中，所述纤维素酶的质量分数为0.1～0.6％；水解时长为6～8小时。纤维素酶的比例控制在0.1～0.6％是最适合的，低于这个量降解效率低，高于这个量成本高，降解效果也不是最好。水解6～8小时后的改性琼脂生产副产物最适合组培用，如果降解时间过长会降低凝胶效果，如果过短琼脂生产副产物的改性不充分。

在步骤三中，优选的，所述改性琼脂生产副产物的添加比例为总培养基溶液的8-14％。

在步骤四中，优选的，灭菌温度为121℃。培养基含有微生物生长的必须碳源氮源和无机盐，通常采用在121℃条件下，湿热高压灭菌分钟，这是为了保证细菌及其芽孢都能被灭活，当然高于这个温度和大气压灭菌的效果会更好,但对培养基中的成分可能有影响。

在步骤一中，所述培养基母液的制备方法包括如下步骤：

步骤1.1：根据MS、White、B5、SH、N6、NN、DKW等植物培养基母液的配制方法，配制得到母液A。

步骤1.2：称取100mg植物生长调节物质，水浴加热，最后定容至100mL，即得1mg/mL的母液B。所述植物生长调节物质包括萘乙酸(NAA)、6-苄氨基嘌呤(6-BA)中的一种或者两种；萘乙酸水浴加热时使用少量乙醇溶解，6-苄氨基嘌呤水浴加热时使用少量NaOH溶液溶解。

步骤1.3：称取母液A放入烧杯中，量取所需浓度的母液B加入烧杯中，摇荡均匀，添加2％～4％蔗糖到配制的溶液中，搅拌溶解。

步骤1.4：用酸度计或PH试纸测溶液PH值，用氢氧化钠或者盐酸调节PH值，直到培养基溶液的pH为6～8为止；即得所需培养基母液。

实施例二

参照附图4所示，本实施例提供一种组培工艺，使用实施例一所述利用琼脂生产副产物制作植物组织培养基方法制得植物组织培养基；然后接种、培养、移栽；最后检测组培苗的褐变率、观察组培苗的生根情况、以及测量组培苗体内可溶性蛋白和总糖的含量。

接下来使用本实施例所述的组培工艺进行多组实验，下面选取其中的几个试验组和对比组对采用所述组培工艺的有益效果进行进一步说明。

试验组一

(1)制备培养基母液。

(2)从过滤板卸下琼脂生产副产物温度一般在55～100℃之间，琼脂生产副产物包括40％珍珠岩、琼脂10％、纤维10％、水40％；加入开水浸泡使得琼脂生产副产物有一定的流动状态；利用打浆机将一些还抱团的琼脂生产副产物打散均匀，此时温度控制在90～100℃；再用均质机将琼脂生产副产物的各种成分混合均匀；加入质量分数为0.1～0.6％纤维素酶进行水解6～8小时，水解完毕后再用均质机混合均匀得到浆料；将浆料抽入滚筒进行干燥、粉碎、过筛，获得成品改性琼脂生产副产物。

(3)称取改性琼脂生产副产物，倒入培养基母液中，改性琼脂生产副产物的添加比例为总培养基溶液的5％，100℃高温加热搅拌，之后培养基趁热分装于组培瓶。

(4)将组培瓶盖上盖子，在121℃温度下高压灭菌30分钟，最后冷却至常温，即得植物组织培养基。