一种引导组织再生胶原膜的制备方法

技术领域

本发明属于生物医用材料技术领域，涉及一种引导组织再生胶原膜的制备方法。

背景技术

引导组织再生膜是指应用屏障膜技术，为受损组织提供一个相对封闭的空间，从而发挥选择性引导组织再生的作用。在骨再生领域中，引导组织再生膜通过外科手术将其放置在骨缺损区域，其与软组织接触的一面可阻挡生长速度较快的成纤维细胞，防止其优势长入，而与骨组织接触的一面可引导生长速度较慢的成骨细胞在其表面贴附、增殖、分化，从而加速骨再生。因此理想的引导组织再生膜应具备不对称结构，即拥有可阻挡细胞迁移的致密层及可引导细胞贴附、增殖的疏松层。

目前，有多种技术手段用于构建具有不对称结构膜，包括冷冻干燥法、静电纺丝法、3D打印技术或多种技术的组合。冷冻干燥法主要是利用冻干时的冰晶升华而形成多孔结构，这种方法虽然工艺简单、成本低廉，但其整体的孔径结构缺乏均匀性，甚至孔之间会缺乏联通性。静电纺丝通过对设备的系列改进或工艺参数的调整，以定向调控纤维间的空间分布，从而构建不对称结构材料。但静电纺丝技术需要在纺丝过程中实现溶剂的快速挥发，通常选用有机溶剂溶解原料。而加工如蛋白质类的天然大分子，有机溶剂可能会使其变性。因此适用电纺丝的原料选择有一定局限。此外，静电纺丝技术所调控的孔径范围非常小，基本处于纳米级别，该尺寸下的膜不足以使细胞/组织浸润，无法起到促进组织再生的作用。3D打印包括基于熔融沉积的3D打印、立体光刻、生物3D打印等系列相关技术，3D打印技术虽然结构控制精准，但其对设备、原料的要求较高，如只有少数热塑性聚合物可用于熔融3D打印，而这些聚合物的生物相容性往往较低。且目前不对称结构胶原膜通常在病灶部位存在降解过快或者过慢问题，通常导致修复效果不佳。

电化学手段则通过电信号的输入诱导带电分子发生溶解度的变化从而进行自组装。电信号的施加可以被精确地进行时空控制，进而指导组装。宏观上可通过电信号输入时间来定量控制材料组装厚度或者通过电信号输入区域来控制组装材料的3D结构；微观尺上可通过电信号的输入模式(如脉冲输入)会以调整材料内部的介观结构。这使得利用电化学技术构建具备不对称结构的引导组织再生膜成为可能。

天然大分子的电化学组装是一类相对较新的研究，研究对象包括壳聚糖、海藻酸钠、胶原蛋白和丝素蛋白等多糖、蛋白类材料。胶原因其生物相容性高、细胞粘附位点多、生物活性高等优点，已被广泛用于组织修复材料领域。胶原蛋白是两性聚电解质，其电荷在低pH值条件带正电，在高pH值条件带负电，在等电点处可发生相转变而析出，而对胶原蛋白电化学制备的主要机理在于，通过施加电场驱动带正电荷胶原蛋白迁移至阴极，而后利用阴极附近的局部碱性环境进行电荷中和，完成胶原分子的相转变，从而在电极表面得到沉积材料。专利CN114618017A中利用电化学沉积技术诱导胶原分子定向迁移并在电极表面形成一定的取向排列，从而制备了一种具有高度取向和结晶性胶原纤维结构的胶原膜，但所得胶原膜整体结构均一，无法获得不对称结构。专利CN109395175A中利用电化学技术制备了具有不对称结构的壳聚糖基引导组织再生膜，其通过两步电沉积，先在阴极附近沉积致密的壳聚糖水凝胶，后再其上沉积疏松的壳聚糖与钙磷盐水凝胶得到双层水凝胶，工艺及配方均较为复杂，不适用于放大生产，且在体内降解过慢，导致伤口修复效果不佳。专利CN107050519A中通过冷冻干燥法制得胶原膜，经压制后得致密层胶原膜，随后将胶原溶液铺在致密层表面再进行第二次冷冻干燥，得具有不对称结构的复合胶原膜。该方法虽然工艺简单，但所得胶原膜整体均一性较差，尤其制备大面积的多孔层，易出现孔分布不均的问题，且在双层复合处易出现交联不紧密的问题，导致材料批次稳定性不佳。

发明内容

基于现有技术中存在的问题和不足，本发明旨在提供一种引导组织再生胶原膜的制备方法。本发明利用电化学沉积技术，以胶原为原料，利用直流源在低温环境下进行电化学沉积，在恒电压输出模式下，通过高电压一步制得具有不对称结构(一面致密，一面疏松多孔)的胶原膜。同时通过不对称交联，可以使得膜进入体内后进行不对称降解，多孔面与伤口接触后，首先提供细胞支架诱导细胞长入，同时发生匹配性快速降解，为细胞长入及增殖不断提供空间及营养物质，促进伤口快速修复；同时致密面保持稳定，起到长期伤口屏蔽效果。本发明操作简单，制备快速，过程绿色，且易于放大。所得胶原膜力学性能优良，且整体性能均一。采用本发明技术方案制备的不对称结构胶原膜的面积与电极片的面积相等，通过换用大面积的电极片，即可实现放大生产，提高产能。

本发明的技术方案如下：

一方面，本发明提供了一种不对称结构胶原膜的制备方法，所述制备方法包括以下步骤：

S1.电沉积液的配置：将胶原蛋白溶解在醋酸溶液中，加入过氧化氢溶液，搅拌均匀后得电沉积液，备用；

S2.气泡脱除：将步骤S1中制备得到的电沉积液进行气泡脱除，随后倒入电沉积池中，预冷至3-10℃以下；

S3.电化学沉积：在低温环境下进行电化学沉积，在电极片上可获得胶原膜材料；

S4.物理交联脱模：将步骤S3制备得到的胶原膜材料烘干，室温静置后，在室温下浸泡在PB中，随后转入37℃的水浴环境中浸泡后，烘干浸泡的操作反复2-3次后，进行物理交联，将胶原膜从电极片上小心剥离；

S5.剥离后的胶原膜材料进行不对称交联；

S6.将不对称交联后的胶原膜清洗；

S7.冷冻干燥，得具有不对称结构的胶原膜。

具体地，步骤S1中所述的胶原为天然I型胶原。

优选地，步骤S1中所述的胶原提取自猪皮、牛皮或牛跟腱。

具体地，步骤S1中所述的胶原蛋白的浓度为0.1％-1.0％w/v。

优选地，步骤S1中所述的胶原蛋白的浓度为0.6％w/v。

具体地，步骤S1中所述的醋酸溶液浓度为0.1％-3％v/v。

优选地，步骤S1中所述的醋酸溶液浓度为1.6v/v。

具体地，步骤S1中所述的过氧化氢溶液浓度为50-200μL/mL。

优选地，步骤S1中所述的过氧化氢溶液浓度为100μL/mL。

具体地，步骤S2中所述的电沉积池采用双电极系统，阳极和阴极电极板平行放置在电极架上，调节两电极板间的距离后，放入电沉积池中。

进一步具体地，所述阳极为铂网。

优选地，所述铂网为高纯度铂，纯度为99.9％或更高。

进一步具体地，所述阴极为钛片。

优选地，所述钛片为高纯度钛，纯度为99.9％或更高。

进一步具体地，所述电极架为玻璃、亚克力或石英材质。

优选地，所述电极架为亚克力材质。

优选地，所述电极架包括3层平行放置的亚克力材质框架，框架为长方形，底座框架底面密封，中间设有凹槽，用以放置钛片，4个角上装有螺栓，用以放置上层框架；上层为2个相同的框架，中间镂空，可将铂网夹在2层框架之间，4个角上开有圆孔，孔径与底座的螺栓相匹配，可在底层框架的螺栓上放置不定数量的垫圈以调节钛片与铂网的间的距离，最后旋紧螺母，固定上层框架。同时，在垂直于底座的方向安置有2个把手，方便电极架的提取。

进一步具体地，所述阳极和阴极电极板的面积相同。

优选地，所述电极板的面积为1-50cm

进一步具体地，所述电极板的面积为25cm

优选地，两电极板间的距离1-4cm。

进一步优选地，两电极板间的距离为2cm。

具体地，步骤S2中所述的气泡脱除为将电沉积液进行2-4次离心操作。

进一步具体地，所述离心的速度为7000-10000rpm。

优选地，所述离心速度为8000rpm。

进一步具体地，所述离心时间为5-20min。

优选地，所述离心时间为5min

进一步具体地，步骤S2中所述的电沉积池为玻璃、亚克力或石英材质。

优选地，步骤S2中所述的电沉积池为亚克力材质。

具体地，步骤S2中所述的预冷温度优选为4℃。

具体地，步骤S3所述的电化学沉积为将直流源与电极板相连接，正极连接铂网，负极连接钛片，在低温环境下进行电化学沉积。

具体地，步骤S3所述的低温环境为2-10℃。

进一步具体地，步骤S3所述的低温环境为4-8℃。

具体地，步骤S3中所述的电化学沉积时间为10-30min。

优选地，步骤S3中所述的电化学沉积时间为25min。

具体地，步骤S3中所述的电化学沉积电压为5-40V。

优选地，步骤S3中所述的电化学沉10-25V。

具体地，步骤S4中所述的烘干为放入烘箱烘干。

进一步具体地，所述的烘箱温度为30-45℃。

优选地，所述的烘箱温度为37℃。

具体地，步骤S4中所述的烘干时间为20-75min。

优选地，步骤S4中所述的烘干时间为60min。

具体地，步骤S4中所述的静置时间为5-20min。

优选地，步骤S4中所述的静置时间为15min。

具体地，步骤S4所述的PB的浓度为0.01-0.20M。

进一步具体地，步骤S4所述的PB的浓度为0.06-0.12M。

优选地，步骤S4所述的PB的浓度为0.1M。

具体地，步骤S4所述的浸泡在PB中的时间为15-40min。

优选地，步骤S4所述的浸泡在PB中的时间为25min。

具体地，步骤S4所述的水浴温度为35-40℃。

优选地，步骤S4所述的水浴温度为37℃。

具体地，步骤S4所述的水浴环境中浸泡的时间为20-40min。

优选地，步骤S4所述的水浴环境中浸泡的时间为30min。

具体地，步骤S4所述的物理交联为胶原自组装交联。

具体地，步骤S5所述的不对称交联为紫外交联。

进一步具体地，步骤S5所述的紫外交联为在紫外光波长下照射10-300min。

优选地，步骤S5所述的紫外交联为在紫外光波长下照射20min。

优选地，步骤S5所述的紫外交联为将剥离后的胶原膜材料的近电极面放置在紫外光波长下照射。

具体地，步骤S6所述的清洗为先用注射用水冲洗胶原膜。

进一步具体地，步骤S6所述的清洗为交联后的膜放入较为平整托盘中，用注射用水清洗胶原膜20-60min，重复5-10次。

优选地，步骤S6所述的清洗为用注射用水清洗胶原膜20min，重复5-10次。

具体地，步骤S7所述的冷冻干燥包括冷冻阶段、升华阶段和解析阶段；

所述冷冻阶段为在常压、低温条件下进行冷冻处理；

所述升华阶段为在真空低温条件下进行冷冻处理；

所述解析阶段为在温度为-20～30℃的真空条件下进行解析。

优选地，所述冷冻阶段的低温温度为-60℃

进一步具体地，所述冷冻阶段的冷冻处理时间为30-360min。

优选地，所述冷冻阶段的冷冻处理时间为120min。

进一步具体地，所述升华阶段的低温温度为-60～-5℃。

优选地，所述升华阶段的低温温度为-10℃。

进一步具体地，所述升华阶段的真空度为10-50Pa。

优选地，所述升华阶段的真空度为20Pa。

进一步具体地，所述升华阶段的冷冻处理时间为6-26h。

优选地，所述升华阶段的冷冻处理时间为12h。

优选地，所述解析阶段的温度为5-20℃

进一步具体地，所述解析阶段的真空度为0-20Pa。

优选地，所述解析阶段的真空度为1Pa。

进一步具体地，所述解析阶段的解析时间为30-720min。

优选地，所述解析阶段的解析时间为180min。

另一方面，本申请还提供了一种引导组织再生胶原膜，所述引导组织再生胶原膜通过上述制备方法制备而成。

具体地，所述引导组织再生胶原膜具有不对称结构，贴近电极一侧的胶原膜具有致密结构，远离电极一侧的胶原膜具有输送结构；湿态胶原膜的厚度为400-800μm。

又一方面，本申请还提供了上述引导组织再生胶原的应用，所述应用为在制备组织修复制品中的应用。

具体地，所述组织修复制品包括牙周组织再生膜、骨引导再生膜、人工皮肤、人工血管、人工神经导管、人工韧带。

本发明的有益效果为：

(1)本发明利用电化学沉积技术，可一步制备具有一面致密、一面疏松不对称结构的胶原膜，操作简单，制备快速且过程绿色。所得胶原膜力学性能优良，且整体性能均一。

(2)通过不对称交联，可以使得膜进入体内后进行不对称降解，在促进伤口快速修复的同时保持稳定的伤口屏蔽效果。

(3)采用本发明技术方案制备的不对称结构胶原膜的面积与电极片的面积相等，通过换用大面积的电极片，即可实现放大生产，提高产能。

附图说明

图1为经离心气泡脱除工艺制备的胶原膜。

图2为经脱模工艺剥离的胶原膜。

图3为交联后冻干前的胶原膜。

图4为无离心气泡脱除工艺制备的胶原膜。

图5为无脱模工艺剥离的胶原膜。

图6为对比例3制备得到的胶原膜。

图7为实施例1和对比例3制备得到的胶原膜的降解对比图。

图8为实施例1制备得到的不对称结构胶原膜。

图9为实施例1制备得到的不对称结构胶原膜SEM图。

具体实施方式

以下非限制性实施例可以使本领域的普通技术人员更全面的理解本发明，但不以任何方式限制本发明。下述内容仅仅是对本发明要求保护的范围的示例性说明，本领域技术人员可以根据所公开的内容对本发明做出多种改变和修饰，而其也应当属于本发明要求保护的范围之中。

当实施例给出数值范围时，应理解，除非本发明另有说明，每个数值范围的两个端点以及两个端点之间任何一个数值均可选用。除非另外定义，本发明中使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同意义。

下面以具体实施例的方式对本发明作进一步的说明。本发明实施例中所使用的各种化学试剂如无特殊说明均通过常规商业途径获得。

实施例1不对称结构的胶原膜的制备

(1)电沉积液的配置：将胶原蛋白海绵以0.6％的浓度溶解在浓度为1.6％的醋酸溶液中，再按比例加入100μL/mL的过氧化氢溶液，搅拌均匀后，得电沉积液，备用；

(2)电沉积池的搭建：采用双电极系统，以钛片为阴极，铂网为阳极，将两片相同面积的电极板平行放置在特制的电极架上，调节好两极板间的距离后，将其放入电沉积池中；所述电极板的面积为25cm

(3)离心气泡脱除：把步骤(1)中制备得到的电沉积液在转速为8000rpm的条件下离心5min进行气泡脱除，共进行2次离心操作，随后倒入到步骤S2准备好的电解池中，将其预冷至4℃以下；

(4)电化学沉积：将直流源与电极板相连接，正极连接铂网，负极连接钛片，将直流源设置为恒电压输出模式，电沉积电压在10-25V之间，在低温环境下(4-8℃之间)进行电化学沉积25min后，在电极片上可获得胶原膜，经过离心脱除气泡后电沉积的膜，光滑平整(见图1)。

(5)物理交联脱模：将步骤(4)中制备的胶原膜放入37℃的烘箱中烘60min，在室温静置15min后，放入0.1M的PB中，在室温下浸泡25min，随后转入37℃的水浴环境中浸泡30min，以上烘干浸泡的操作反复2-3次，进行胶原自组装交联，最后即可将胶原膜从电极片上小心剥离，得到剥离后的胶原膜(图2)。

(6)紫外交联：将步骤(5)制备得到的剥离后的胶原膜的近电极面放置在紫外光波长下照射20min。

(7)清洗：将经过紫外光波长照射后的胶原膜放入较为平整托盘中，用流动的注射用水清洗胶原膜20min，重复5-10次。

(8)冷冻干燥：

清洗后的胶原膜经过预冷冻、低温冷冻和真空干燥三个阶段后，得到具有不对称结构的胶原膜(图8)。具体步骤如下：

S1.冷冻阶段：胶原膜在常压、温度为-60℃条件下冷冻处理2h；

S2.升华阶段：在温度为-10℃；真空度为20Pa条件下冷冻12h；

S3.解析阶段：在温度为5-20℃；真空度为1Pa条件下解析3min。

对比例1抽真空气泡脱除工艺制备胶原膜

S1.电沉积液的配置：将胶原蛋白海绵以0.6％的浓度溶解在浓度为1.6％的醋酸溶液中，再按比例加入100μL/mL的过氧化氢溶液，搅拌均匀后，得电沉积液，备用；

S2.电沉积池的搭建：采用双电极系统，以钛片为阴极，铂网为阳极，将两片相同面积的电极板平行放置在特制的电极架上，调节好两极板间的距离后，将其放入电解池中；所述电极板的面积为25cm

S3.抽真空离心气泡脱除：把步骤S1中制备得到的电沉积液带入到步骤S2准备好的电解池中，将其放置在真空环境下进行气泡脱除，共计抽3次真空，真空度须达-0.1MPa或以下，每次抽真空完毕后静置5min，随后预冷至4℃以下；

S4.电化学沉积：将直流源与电极板相连接，正极连接铂网，负极连接钛片，将直流源设置为恒电压输出模式，电沉积电压在10-25V之间，在低温环境下(4-8℃之间)进行电化学沉积25min后，在电极片上可获得胶原膜，进行抽真空气泡脱除的膜上面布满气泡(见图4)，因此不进行后续的制备。

对比例2无物理交联脱模工艺剥离胶原膜

S1.按照基础实施例中步骤(1)-步骤(4)所述的方法制备胶原膜。

S2.将S1中制备的胶原膜小心剥离，得到剥离后的胶原膜，电沉积完毕后直接脱膜的胶原膜类似于果冻，不易完整剥离(见图5)，因此不进行后续的制备。

对比例3不经紫外交联制备胶原膜

对比例3与实施例1的区别仅在于删除“步骤(6)紫外交联”，将剥离后的胶原膜直接进行清洗和冷冻干燥制备得到胶原膜，该胶原膜不对称结构并不明显(见图6)。

对比例4经化学交联制备胶原膜

对比例4与实施例1的区别仅在于：步骤(5)不同，将剥离后的胶原膜浸泡在戊二醛水溶液(0.5％w/v)中60min，使其进行化学交联后再进行清洗和冷冻干燥制备，得到不对称结构胶原膜。

实验例1缝线拉力测定

对实施例1与对比例2和4的缝线拉力进行测定，具体实验过程如下：将样品裁成长条形状(10mm×25mm)(n＝5)，在离短边边缘3mm处用4-0号缝合线穿过样品，对折缝合线，在距离穿孔处约5cm处将缝合线打结，防止缝合线脱落。在超纯水中吸水至饱和后(约30min)将样品未穿线一端和缝合线一端分别固定在力学试验机上，拉伸速度100mm/min，直至样品被撕裂，取拉伸负荷的最大值为样品撕裂力。测定结果见表1。

表1缝线拉力测定结果

结果显示，实施例1、对比例2和对比例4的缝线拉力分别是1.057N、0.106N和0.478N，表明本发明技术方案制备得到的胶原膜的力学性能更好，缝线拉力增强。

实验例2降解时间

分别测定实施例1、对比例3制备得到的胶原膜的降解时间，具体过程如下：配置400mL PH＝7.3的0.01M PBS溶液，加入0.4g胰蛋白酶。取15mg胶原膜，浸入PBS溶液中至所有空气被挤除，取出，用滤纸吸取表面水分。在锥形瓶中加入含有胰蛋白酶的PBS溶液，37℃预热1h。将胶原膜放入锥形瓶中完全浸润，15mg胶原膜，30mL PBS溶液设置摇床50r/min，37℃。记录开始时间，并观察和记录最终膜完全降解时间。

结果表明(图7)，对比例3制备得到的胶原膜降解过快，45.5h已完全降解，而实施例1制备得到的胶原膜经过45.5h后仍然保持完整。说明通过不对称交联，可以延长膜的降解时间，起到长期伤口屏蔽效果。

实验例3外观及微观形貌测定

对制备好的实施例1制备的具有不对称结构的胶原膜进行观察，并拍照记录(见图8)。使用扫描电子显微镜(FlexSEM 1000)进一步对其微观形貌进行观察，并拍照记录(见图9)。

结果显示，采用本发明技术方案能够制备得到一面致密、一面疏松不对称结构的胶原膜。得胶原膜力学性能优良，且整体性能均一。此外，胶原膜的面积与电极片的面积相等，通过换用大面积的电极片，即可实现放大生产，提高产能。

上述详细说明是针对本发明其中之一可行实施例的具体说明，该实施例并非用以限制本发明的专利范围。应当指出的是，凡未脱离本发明所为的等效实施或变更，均应包含于本发明技术方案的范围内。因此，本发明专利的保护范围应以所附要求为准。