一种银耳液化菌种的制备方法

技术领域

本发明涉及液体菌种制备技术领域，具体涉及一种银耳液化菌种的制备方法。

背景技术

银耳(Tremella fuciformis)又称白木耳，在真菌分类学中隶属于担子菌门(Basidiomycota)、银耳纲(Tremellomycetes)、银耳目(Tremellales)、银耳科(Tremellaceae)、银耳属(Tremella)。是世界公认的一种大型的名贵的食药同用的真菌，自古有“菌中之冠”的美誉，具有提高肝脏解毒能力、保护肝脏、增强机体抗肿瘤能力、扶正固本的功效，历来是一种高级滋养补品。银耳在营养方面属于低能、低脂肪食品，但富含蛋白质、多糖和膳食纤维，以及多种矿物质、微量元素和维生素。目前，我国银耳产区主要集中在四川通江和福建古田等地，其中福建古田的银耳产量占全国的90％以上。

银耳栽培大体上可以分为代料栽培和段木栽培两种形式，70年代后，在许多地区代料栽培逐渐替代了段木栽培，目前国内绝大多数的银耳出于代料栽培。银耳代料栽培仍采用固体菌种接种的方式，与其它食用菌的菌种不同，银耳的固体菌种中含有银耳和香灰菌(Annulohypoxylon stygium)两种菌丝。其中香灰菌是银耳的伴生菌，其具有强的降解原材料的能力，能够快速生长并将原材料中木质素和纤维素等大分子物质降解为可溶性小分子物质。银耳集中在栽培料表面，附着在香灰菌菌丝上直接吸收利用营养成分，并可以迫使香灰菌分泌更多的纤维素酶、木聚糖酶等基质降解酶加快营养的供应。由于银耳菌种的这一特性，因此，其固体菌种在接种使用前必须使用专用的搅拌器搅拌均匀，确保同时接入菌种同时含有银耳菌丝和香灰菌菌丝，这一接种过程费力费时，并且由于搅拌混合度不够、不同瓶菌种状态不同，导致了在菌包接种培养过程中常常出现菌丝生长均一性差，甚至个别菌包不出耳的情况，为银耳的工厂化生产带来极大的麻烦。

为了满足市场的需求，越来越多的食用菌品种使用液体菌种替代固体菌种，液体菌种相对固体菌种不仅制种时间短、人员需求减少，并且菌龄均一、接种标准且均匀。由于银耳菌种的复杂性以及银耳的二型态为传统的食用菌液体菌种制备带来极大的困难。现有技术中虽然也有部分研究者制备银耳液化菌种，但是其制备过程繁琐，需要调配银耳菌和香灰菌的含量，否则很难成功栽培出银耳。

发明内容

为了解决现有技术存在的上述不足，本发明的目的是提供一种银耳液化菌种的制备方法，以解决现有液体菌种制作步骤繁杂，需要调配银耳菌和香灰菌的含量，否则很难成功栽培出银耳的问题。

本发明解决上述技术问题的技术方案如下：提供一种银耳液化菌种的制备方法，包括以下步骤：

向银耳固体菌种中加水进行研磨，使其形成泥状，将泥状的银耳固体菌种转接入液体培养基中进行培养，获得银耳液化菌种；

其中，液体培养基包括：基本培养基和添加剂；添加剂为硬脂酸、菜籽油、大豆油或棕榈酸。

本发明的有益效果为：银耳的生长发育离不开其伴生菌——香灰菌，它不同于常规食用菌(如平菇、香菇、木耳等)，也因此给银耳菌种的生产带来一定的困难。而现有银耳液体菌种制备过程中会先分别用斜面培养基培养香灰菌和银耳菌，然后将香灰菌和银耳菌的菌种分别移入特定液体培养基中培养，再将香灰菌的液体菌种按1-5％的体积百分比混合到银耳菌液体菌种中，形成银耳液体菌种。该方法需要分别培养银耳菌和香灰菌，还需要特定培养基，然后再按照特定比例混合，其过程比较复杂。而本申请中仅需要将银耳固体菌种(此处的银耳固体菌种为含有栽培瓶菌种、栽培袋菌种等)研磨使其形成泥状，然后再将泥状物接入液体培养基中进行培养便可形成银耳液体菌种。本发明中的液体培养基由常规的基础培养基和添加剂成分组成，添加剂可提高菌球数量，还有助于提高银耳液化菌种的品质，将制得的银耳液化菌种接种至栽培料进行出耳培养，出耳率非常高，所得银耳更加厚实，同时还提高了鲜耳和干耳产量。添加剂成分可以是饱和脂肪酸如硬脂酸或棕榈酸，也可以是常用的食用油如菜籽油或大豆油。但并非所有的饱和脂肪酸都是有利的，本发明在实验过程中还采用了饱和脂肪酸月桂酸，但其产生了不利影响。

在上述技术方案的基础上，本发明还可以做如下改进：

进一步，将泥状的银耳固体菌种转接入液体培养基中时接种量为0.1～0.9g/100mL；优选接种量为0.5g/100mL。

进一步，研磨时，研磨转速为8000～12000r/min，研磨时间为30～90s；优选研磨时间为30s。

进一步，添加剂的添加量为3～8g/L；优选添加剂的添加量为5g/L。

进一步，液体培养基的pH值为4-10；优选pH值为6。

采用上述进一步技术方案的有益效果为：液体培养基的pH值会影响菌球的生长如数量和质量，当液体培养基的pH值为6时，菌球数量是pH值为4时的两倍，菌球直径差异更小，生长更均匀。

进一步，基础培养基的成分和含量为：每升液体培养基中含玉米粉10g、豆粉7g、葡萄糖20g、酵母浸粉1g、蛋白胨1g、KH

进一步，将泥状的银耳固体菌种转接入液体培养基中进行培养时的培养条件为：22-25℃、120-150rpm摇床振荡培养2-4d；优选24℃、140rpm摇床振荡培养3d。

采用上述进一步技术方案的有益效果为：

上述参数如固体菌种接种量、研磨时间、添加剂的添加量、液体培养基的pH值等均对菌球直径产生比较大的影响，只有在上述参数范围内才能获得密度高，直径适宜的菌球，才有利于后期接种到栽培料中快速生长。

采用上述银耳液化菌种栽培银耳的方法，包括以下步骤：

吸取上述银耳液化菌种，转接至栽培料中进行培养。该栽培过程中，液化菌种接种量可以为1-5:100(V/W)。

进一步地，菌丝培养过程中控制温度21～25℃、空气湿度78～80％；出耳培养过程中控制温度20～23℃、空气湿度90～95％。

本发明具有以下有益效果：

采用本发明方法，直接将银耳固体菌种研磨成泥状，然后接种到含有添加剂的液体培养基中培养便可获得银耳液化菌种，将该液化菌种直接转接到栽培料中进行培养，可成功栽培出银耳，并且能加快菌丝生长速度，提高银耳品质。

附图说明

图1为不同培养基银耳液化菌种制备情况。

图2为不同培养基银耳液化菌种菌球数量和直径比较。

图3为接种量对银耳液化菌种菌球数量和直径的影响。

图4为研磨时间对银耳液化菌种菌球数量和直径的影响。

图5为装液量对银耳液化菌种菌球数量和直径的影响。

图6为培养基初始pH对银耳液化菌种菌球数量和直径的影响。

图7为不同添加剂对银耳液化菌种菌球数量和直径的影响。

图8为银耳液化菌种瓶栽出耳情况。

具体实施方式

以下所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。

实施例1：

一种银耳液化菌种的制备方法，包括以下步骤：

(1)银耳固体菌种的选择：挑选料面白毛团颗粒圆正、光泽度好，香灰菌菌丝走势强劲、菌丝平整，吃料较深的银耳固体菌种；

(2)银耳固体菌种的液化：将生长有菌丝的栽培料(选择的银耳固体菌种)取出转移至无菌研磨机，按固液比1:3加入无菌水，打开研磨机(转速10000r/min)进行研磨1min，此时固体菌种呈泥状；

(3)银耳液化菌种的制备：称取0.5g步骤(2)研磨后的泥状固体菌种，转接入100mL液体培养基中，24℃、140rpm摇床振荡培养3d，获得银耳液化菌种；

(4)用吸管吸取1mL步骤(3)所获得的银耳液化菌种到玻璃板上，并摊成薄层，用接种针将菌球分开，在显微镜10倍镜下统计菌球的数量以及直径。

其中，步骤(3)所述的液体培养基配方如表1所示：

表1液体培养基配方

实施例2：

一种银耳液化菌种的制备方法，包括以下步骤：

(1)银耳固体菌种的选择：挑选料面白毛团颗粒圆正、光泽度好，香灰菌菌丝走势强劲、菌丝平整，吃料较深的银耳固体菌种；

(2)银耳固体菌种的液化：将生长有菌丝的栽培料(选择的银耳固体菌种)取出转移至无菌研磨机，按固液比1:3加入无菌水，打开研磨机(转速10000r/min)进行研磨1min，此时固体菌种呈泥状；

(3)银耳液化菌种的制备：称取步骤(2)研磨后的泥状固体菌种，转接入100mL液体培养基中，24℃、140rpm摇床振荡培养3d，获得银耳液化菌种；

(4)用吸管吸取1mL步骤(3)所获得的银耳液化菌种到玻璃板上，并摊成薄层，用接种针将菌球分开，在显微镜10倍镜下统计菌球的数量以及直径。

其中，步骤(3)所述的每升液体培养基含有玉米粉10g、豆粉7g、葡萄糖20g、酵母浸粉1g、蛋白胨1g、KH

针对步骤(3)所述的称取泥状固体菌种的量进行梯度实验，分别称取0.1g、0.3g、0.5g、0.7g、0.9g至液体培养基中。

实施例3：

一种银耳液化菌种的制备方法，包括以下步骤：

(1)银耳固体菌种的选择：挑选料面白毛团颗粒圆正、光泽度好，香灰菌菌丝走势强劲、菌丝平整，吃料较深的银耳固体菌种；

(2)银耳固体菌种的液化：将生长有菌丝的栽培料(选择的银耳固体菌种)取出转移至无菌研磨机，按固液比1:3加入无菌水，打开研磨机(转速10000r/min)进行研磨，此时固体菌种呈泥状；

(3)银耳液化菌种的制备：称取步骤(2)研磨后的泥状固体菌种，转接入100mL液体培养基中，24℃、140rpm摇床振荡培养3d，获得银耳液化菌种；

(4)用吸管吸取1mL步骤(3)所获得的银耳液化菌种到玻璃板上，并摊成薄层，用接种针将菌球分开，在显微镜10倍镜下统计菌球的数量以及直径。

其中，步骤(3)所述的每升液体培养基含有玉米粉10g、豆粉7g、葡萄糖20g、酵母浸粉1g、蛋白胨1g、KH

针对步骤(2)所述的研磨机研磨时间进行梯度实验，分别研磨30s、45s、60s、75s和90s。

实施例4：

一种银耳液化菌种的制备方法，包括以下步骤：

(1)银耳固体菌种的选择：挑选料面白毛团颗粒圆正、光泽度好，香灰菌菌丝走势强劲、菌丝平整，吃料较深的银耳固体菌种；

(2)银耳固体菌种的液化：将生长有菌丝的栽培料(选择的银耳固体菌种)取出转移至无菌研磨机，按固液比1:3加入无菌水，打开研磨机(转速10000r/min)进行研磨30s，此时固体菌种呈泥状；

(3)银耳液化菌种的制备：称取步骤(2)研磨后的泥状固体菌种，转接入100mL液体培养基中，24℃、140rpm摇床振荡培养3d，获得银耳液化菌种；

(4)用吸管吸取1mL步骤(3)所获得的银耳液化菌种到玻璃板上，并摊成薄层，用接种针将菌球分开，在显微镜10倍镜下统计菌球的数量以及直径。

其中，步骤(3)所述的每升液体培养基含有玉米粉10g、豆粉7g、葡萄糖20g、酵母浸粉1g、蛋白胨1g、KH

针对步骤(3)所述的液体培养基装液量进行梯度实验，分别装液50mL(0.25g固体菌种)、75mL(0.375g固体菌种)、100mL(0.5g固体菌种)、125mL(0.625g固体菌种)、150mL(0.75g固体菌种)。

实施例5：

一种银耳液化菌种的制备方法，包括以下步骤：

(1)银耳固体菌种的选择：挑选料面白毛团颗粒圆正、光泽度好，香灰菌菌丝走势强劲、菌丝平整，吃料较深的银耳固体菌种；

(2)银耳固体菌种的液化：将生长有菌丝的栽培料(选择的银耳固体菌种)取出转移至无菌研磨机，按固液比1:3加入无菌水，打开研磨机(转速10000r/min)进行研磨30s，此时固体菌种呈泥状；

(3)银耳液化菌种的制备：称取0.25g步骤(2)研磨后的泥状固体菌种，转接入50mL液体培养基中，24℃、140rpm摇床振荡培养3d，获得银耳液化菌种；

(4)用吸管吸取1mL步骤(3)所获得的银耳液化菌种到玻璃板上，并摊成薄层，用接种针将菌球分开，在显微镜10倍镜下统计菌球的数量以及直径。

其中，步骤(3)所述的每升液体培养基含有玉米粉10g、豆粉7g、葡萄糖20g、酵母浸粉1g、蛋白胨1g、KH

针对步骤(3)所述的液体培养基酸碱度进行梯度实验，培养基初始酸碱度分别为pH4、pH5、pH6、pH7、pH8、pH8.5、pH9、pH9.5和pH10。

实施例6：

一种银耳液化菌种的制备方法，包括以下步骤：

(1)银耳固体菌种的选择：挑选料面白毛团颗粒圆正、光泽度好，香灰菌菌丝走势强劲、菌丝平整，吃料较深的银耳固体菌种；

(2)银耳固体菌种的液化：将生长有菌丝的栽培料(选择的银耳固体菌种)取出转移至无菌研磨机，按固液比1:3加入无菌水，打开研磨机(转速10000r/min)进行研磨30s，此时固体菌种呈泥状；

(3)银耳液化菌种的制备：称取0.25g步骤(2)研磨后的泥状固体菌种，转接入50mL液体培养基中，24℃、140rpm摇床振荡培养3d，获得银耳液化菌种；

(4)用吸管吸取1mL步骤(3)所获得的银耳液化菌种到玻璃板上，并摊成薄层，用接种针将菌球分开，在显微镜10倍镜下统计菌球的数量以及直径。

其中，步骤(3)所述的每升液体培养基含有玉米粉10g、豆粉7g、葡萄糖20g、酵母浸粉1g、蛋白胨1g、KH

针对步骤(3)所述的每升液体培养基分别添加5g的硬脂酸、月桂酸、菜籽油、大豆油、棕榈酸。

对比例1：

一种银耳液化菌种的制备方法，包括以下步骤：

(1)银耳固体菌种的选择：挑选料面白毛团颗粒圆正、光泽度好，香灰菌菌丝走势强劲、菌丝平整，吃料较深的银耳固体菌种；

(2)银耳固体菌种的液化：将生长有菌丝的栽培料(选择的银耳固体菌种)取出转移至无菌研磨机，按固液比1:3加入无菌水，打开研磨机(转速10000r/min)进行研磨30s，此时固体菌种呈泥状；

(3)银耳液化菌种的制备：称取0.25g步骤(2)研磨后的泥状固体菌种，转接入50mL液体培养基中，24℃、140rpm摇床振荡培养3d，获得银耳液化菌种；

(4)用吸管吸取1mL步骤(3)所获得的银耳液化菌种到玻璃板上，并摊成薄层，用接种针将菌球分开，在显微镜10倍镜下统计菌球的数量以及直径。

其中，步骤(3)所述的每升液体培养基含有玉米粉10g、豆粉7g、葡萄糖20g、酵母浸粉1g、蛋白胨1g、KH

实施例7：

一种银耳液化菌种的制备方法，包括以下步骤：

(1)银耳固体菌种的选择：挑选料面白毛团颗粒圆正、光泽度好，香灰菌菌丝走势强劲、菌丝平整，吃料较深的银耳固体菌种；

(2)银耳固体菌种的液化：将生长有菌丝的栽培料(选择的银耳固体菌种)取出转移至无菌研磨机，按固液比1:3加入无菌水，打开研磨机(转速10000r/min)进行研磨30s，此时固体菌种呈泥状；

(3)银耳液化菌种的制备：称取0.25g步骤(2)研磨后的泥状固体菌种，转接入50mL液体培养基中，24℃、140rpm摇床振荡培养3d，获得银耳液化菌种；

(4)出耳实验：吸取步骤(3)所获得的银耳液化菌种，按照液固比1:100(V/W)转接至栽培料中，根据传统银耳栽培出耳管理的措施进行，其中发菌间：温度21～25℃、空气湿度78～80％，出菇房：温度20～23℃、空气湿度90～95％。

(5)采收：统计出耳的瓶数，耳片成熟后及时采摘统计产量，并计算栽培料转化率。

其中，步骤(3)所述的每升液体培养基含有玉米粉10g、豆粉7g、葡萄糖20g、酵母浸粉1g、蛋白胨1g、KH

对比例2：

一种银耳液化菌种的制备方法，包括以下步骤：

(1)银耳固体菌种的选择：挑选料面白毛团颗粒圆正、光泽度好，香灰菌菌丝走势强劲、菌丝平整，吃料较深的银耳固体菌种；

(2)搅拌混料：使用无菌的银耳搅拌器将生长有菌丝的栽培料搅散混匀；

(3)出耳实验：称取5g步骤(2)混匀后的固体菌种，转接至栽培料中，按照传统银耳栽培出耳管理的措施进行，其中发菌间：温度21～25℃、空气湿度78％～80％，出菇房：温度20～23℃、空气湿度90％～95％。

(4)采收：统计瓶栽出耳的瓶数，计算出耳率，袋栽的银耳成熟后先去蒂头称重，然后放入自来水泡发6h，测量银耳直径和厚度，最后55℃烘干箱烘干后再次称重。

其中，步骤(3)所述的栽培料配方为70％棉籽壳、20％麸皮、9％木屑、1％石灰，含量水调至55～60％，瓶栽装料量170～180g，袋栽装料量1400～1500g。

用吸管分别吸取1mL对比例1以及实施例1-6制得的银耳液化菌种到玻璃板上，并摊成薄层，用接种针将菌球分开，在显微镜下统计菌球的数量以及直径，其结果如图1、图2、图3、图4、图5、图6、图7所示。

采用实施例1中7种液体培养基配方来制备银耳液化菌株，发现7种培养基中菌球生长的数量与形态差异显著，由图1可知，配方B、配方E和配方G制备出的银耳菌球较为弥散，菌丝散步在菌球四周，其余4种培养基菌球紧实度较好。然后显微镜观察统计7种培养基中菌球数量和直径，结果如图2所示，可以看出培养基D的菌球密度最高，菌球直径最小，液化效果明显优于其它6种培养基。

因此，利用培养基D作为inert液化菌种的基础培养基，针对培养基和液化过程的关键参数如研磨时间、接种量、装液量以及培养基初始pH进行单因素优化，优化结果如图3、图4、图5、图6所示，综合考虑生产成本和菌种质量发现各单因素优化结果为接种量0.25g、研磨时间30s、装液量50mL、培养基D初始pH6.0～7.0。此外，本发明还对添加硬脂酸、月桂酸、菜籽油、大豆油、棕榈酸5种添加剂后银耳液化菌种品质的变化进行了考察，结果由图7可以看出，5种添加剂对银耳液化菌种品质有明显的影响，月桂酸的添加会致使银耳液化菌种的菌球数量减少，菌种质量下降。而添加菜籽油、大豆油和棕榈酸有助于银耳液化菌种品质的提升，菌球数量明显提高，其中大豆油的效果最为明显，添加后菌球数量可以达153.4个/mL，菌球数量相对对照例1提高16.6％，同时菌球直径减小更有利于接种。

将制备好的银耳液化菌种接种至栽培料中，观察瓶栽菌丝生长情况如图8所示，可以看出银耳液化菌种的菌丝生长速度明显快于固体菌种，移至出菇房的时间提前2～3d，移入出菇房进行正常出菇管理，银耳液化菌种的出耳情况与固体菌种无明显差异。4种液体菌种袋栽出耳成熟后，采收统计产量与农艺性状，采摘去蒂头发现，使用液体菌种银耳成熟后蒂头相对固体菌种明显减小，处理过程更为简便，处理后产量由表2可以看出使用液体菌种鲜耳产量提高27.7％以上，干耳产量提高35.7％以上，液体菌种中添加硬脂酸会使得银耳出耳朵型变大，添加菜籽油、大豆油和棕榈酸出耳更为厚实。最终，液体菌种在福建农林大学(古田)菌业研究院共出耳5个批次，出耳情况从表3可以看出，5个批次的出耳率均高于97％，平均出耳率达到98.4％，这一结果说明了银耳液化菌种在生产应用上完全可行。

表2不同添加剂对银耳产量与朵型的影响

表3不同批次的银耳出耳情况

以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。