一种穿孔素HolSGF2及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及基因工程技术领域，更具体的说是涉及一种噬菌体SGF2穿孔素HolSGF2及其制备方法和应用。

背景技术

志贺氏菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌(E.coli)等是引起大多数严重传染性食源性疾病的主要病原体，其中志贺氏菌引起炎症性腹泻和志贺氏病。细菌感染是临床中发病率的主要原因。过去主要使用抗生素来治疗感染，但是长期使用抗生素治疗导致病原菌出现耐药性，导致患者病情加重。抗生素耐药性是可以通过遗传获得的，并且具有持久性，一小部分细胞对抗生素表现出非遗传的表现型耐受性。多药耐药志贺氏菌分离株在世界范围内均有报道，因此需要更有效的抗菌剂。通过表达噬菌体功能蛋白，以增强抗生素对细菌的杀伤作用。但是噬菌体对病原菌的裂解作用表现出专一性，其抑菌活性受环境的影响较大，当温度和pH发生变化其抑菌活性也会发生改变，因此开发噬菌体新型药物受阻。穿孔素作为噬菌体的功能蛋白，能够有效的抑制宿主菌甚至其它细菌的生长，不易受环境的影响，因此穿孔素作为新型抗菌剂具有良好的开发和市场应用价值。

因此，提供一种穿孔素HolSGF2及其制备方法和应用是本领域技术人员亟需解决的问题。

发明内容

有鉴于此，本发明提供了一种穿孔素HolSGF2及其制备方法和应用。

为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种穿孔素HolSGF2，其氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示。

进一步，编码所述的穿孔素HolSGF2的核苷酸序列，所述核苷酸序列如SEQ IDNO.5所示。

进一步，一种重组表达载体，所述重组表达载体由所述的核苷酸序列与表达载体经重组得到。

进一步，所述表达载体为pET-32a。

进一步，一种穿孔素HolSGF2的制备方法，包括以下步骤：

(1)将所述的核苷酸序列构建入表达载体pET-32a，得到重组质粒HolSGF2-pET-32a；

(2)将重组质粒HolSGF2-pET-32a转化进入大肠杆菌BL21表达菌株中，进行液体培养，诱导表达，收集菌液，提取纯化，获得穿孔素HolSGF2。

进一步，所述的一种穿孔素HolSGF2在抑制细菌活性中的应用。

进一步，所述细菌为Shigella dysenteriae 1.1869、Shigellaflexneri 1.1868、Shigellaflexneri 1.10599、Staphylococcus aureus 1.8721、Escherichia coli Sakai

经由上述的技术方案可知，与现有技术相比，本发明公开提供了一种穿孔素HolSGF2及其制备方法和应用，为实现蛋白的可溶性表达，经过对穿孔素的表达基因序列进行分析，该穿孔素具有信号肽和跨膜区，疏水性较强，后将信号肽和跨膜区序列删除，通过基因合成得到含有编码穿孔素HolSGF2基因的原核表达载体质粒HolSGF2-pET-32a，通过转化DH5α感受态细胞得到重组质粒，导入大肠杆菌BL21表达系统中进行蛋白的大量表达。之后通过亲和介质纯化，实现穿孔素HolSGF2在体外的高效表达。HolSGF2具有较好的杀菌活性，对革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌均具有较好的抑制效果，在新型噬菌体药物的开发上有很好的应用前景。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图获得其他的附图。

图1附图为本发明重组质粒HolSGF2(1)-pGEX-6p-1蛋白表达SDS-PAGE图；

其中，M：Marker；泳道1：pGEX-6p-1空载体细胞破碎液；泳道2：pGEX-6p-1空载体细胞破碎上清液；泳道3：pGEX-6p-1空载体细胞破碎沉淀；泳道4：加IPTG的HolSGF2(1)-pGEX-6p-1细胞破碎液；泳道5：加IPTG的HolSGF2(1)-pGEX-6p-1细胞破碎上清液；泳道6：加IPTG的HolSGF2(1)-pGEX-6p-1细胞破碎沉淀；

图2附图为本发明改变诱导条件后重组质粒HolSGF2(1)-pGEX-6p-1蛋白表达SDS-PAGE图；

其中，M：Marker；泳道1：加1mM IPTG的pGEX-6p-1细胞破碎液；泳道2：加1mM IPTG的pGEX-6p-1细胞破碎上清液；泳道3：加1mM IPTG的HolSGF2(1)-pGEX-6p-1细胞破碎液；泳道4：加1mM IPTG的HolSGF2(1)-pGEX-6p-1细胞破碎上清液；泳道5：加0.5mM IPTG的HolSGF2(1)-pGEX-6p-1细胞破碎液；泳道6：加0.5mM IPTG的HolSGF2(1)-pGEX-6p-1细胞破碎上清液；泳道7：加0.05mM IPTG的HolSGF2(1)-pGEX-6p-1细胞破碎液；泳道8：加0.05mMIPTG的HolSGF2(1)-pGEX-6p-1细胞破碎上清液；

图3附图为本发明重组质粒HolSGF2-pET-32a蛋白表达SDS-PAGE图；

其中，M：Marker；泳道1：加IPTG的HolSGF2细胞破碎液；泳道2：加IPTG的HolSGF2细胞破碎上清液；泳道3：加IPTG的HolSGF2细胞破碎沉淀；

图4附图为本发明重组质粒HolSGF2-pET-32a蛋白表达纯化SDS-PAGE图；

其中，M：Marker；泳道1：纯化后的HolSGF2；

图5附图为本发明纯化后的穿孔素HolSGF2对宿主菌福氏志贺氏菌1.1868(L-2)的抑制作用；

其中，E2、E3、E4均为HolSGF2蛋白样品；PBS：阴性对照；

图6附图为本发明不同pH对穿孔素HolSGF2相对裂解活性的影响；

图7附图为本发明不同温度对HolSGF2相对裂解活性的影响。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1穿孔素HolSGF2(1)的制备

噬菌体SGF2来源：Genomic characterization of a novel virulent phageinfecting Shigella fiexneri and isolated from sewage[J].Virus Research:AnInternational Journal of Molecular and Cellular Virology,2020,283.DOI:10.1016/j.virusres.2020.197983.

1)福氏志贺氏菌噬菌体SGF2穿孔素表达基因原始序列为SEQ ID NO.1，记为HolSGF2(1)。

ATGAAAATGATGAAACAAGCTGCATATGGTTTAATCTGTTTAGGCGCAGGTGTTGTGGTATCAACCGCAGTTCCTGTAAGCGCAGTTCATCCATTAGTAACTGTCCCTGCTCCAGTAGAGAAGCTTAGCTCTCAATGCAAGCAGAGAACAATTCAAAATAACCTAGTTGTTATTTGTCCTGATGCTGAATCTAACGCTCTGAGAAAGATACTACCTTAA；SEQ ID NO.1。

利用噬菌体基因提取试剂盒提取噬菌体SGF2的基因组，通过PCR扩增目的片段，获得PCR产物。

PCR扩增所用引物序列如下：

F：5’-CGCGGATCCATGAAAATGATGAAACAA-3’；SEQ ID NO.2；

R：5’-CCGCTCGAGTTAAGGTAGTATCTTTCTCAG-3’；SEQ ID NO.3。

PCR反应体系(共50μl)如下：10×buffer 5μl，dNTPS 4μl，引物F1μl，引物R1μl，Taq酶0.5μl，DNA模板1μl，ddH

PCR反应程序如下：94℃预变性5min；94℃变性1min，57℃退火1min，72℃延伸1min，共35个循环；72℃10min，4℃∞。

2)以pGEX-6p-1为载体，构建重组质粒HolSGF2(1)-pGEX-6p-1：利用BamHⅠ和XhoⅠ对PCR产物和质粒pGEX-6p-1进行双酶切，将纯化后的酶切产物通过T4连接酶连接，构成重组质粒HolSGF2(1)-pGEX-6p-1，将pGEX-6p-1和重组质粒分别转化至大肠杆菌DH5α中，-20℃/-80℃保存。

3)利用质粒提取试剂盒将重组质粒HolSGF2(1)-pGEX-6p-1从大肠杆菌DH5α中提取出来，并转化到大肠杆菌BL21中，-20℃/-80℃保存。

4)将保存的含有重组质粒HolSGF2(1)-pGEX-6p-1的大肠杆菌BL21按1％的接种量接种到具有50μg/ml氨苄霉素抗性的20ml LB液体培养基中，在37℃摇床中过夜振荡培养。

5)移取100μl的上述种子液至LB固体平板培养基上进行涂布，在37℃培养箱中过夜培养。

6)从平板培养基上挑取含有重组质粒的大肠杆菌BL21的单菌落，接种到具有50μg/ml氨苄霉素抗性的20ml LB液体培养基中，在37℃摇床中过夜振荡培养，制备种子液。

7)将种子液按1％的接种量转接到具有50μg/ml氨苄霉素抗性的100ml LB液体培养基中，在37℃摇床中振荡培养，当菌液的OD

8)通过离心收集菌体，用PBS多次洗涤并重悬菌体，利用细胞超声破碎仪进行菌体破碎，取1ml细胞破碎液作为样品，离心后得到细胞破碎上清液和细胞破碎沉淀，进行SDS-PAGE检测。

9)在蛋白样品中加入适量的蛋白上样缓冲液，100℃煮沸5min，在冰上冷却至室温后上样，进行SDS-PAGE检测，如图1所示，显示蛋白表达为包涵体(蛋白大小约为34KDa)。

改变蛋白诱导条件(温度为25℃，IPTG的浓度分别为1、0.5、0.05mM，培养12小时)后，收集菌体，进行SDS-PAGE检测，如图2所示。

从图2可以看出，诱导表达得到的穿孔素HolSGF2仍然为包涵体形式，改变诱导表达条件依然没能得到可溶性的蛋白。

实施例2穿孔素HolSGF2的制备

1)对穿孔素HolSGF2(1)表达基因序列进行分析，删除其信号肽和跨膜区，删除前噬菌体SGF2穿孔素HolSGF2(1)表达基因序列为SEQ ID NO.1，氨基酸序列为SEQ ID NO.4。删除其信号肽和跨膜区后噬菌体SGF2穿孔素HolSGF2表达基因序列为SEQ ID NO.5，通过基因合成得到穿孔素HolSGF2表达基因序列SEQ ID NO.5；氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示。

HolSGF2(1)原氨基酸序列：

M

ATGCATCCATTAGTAACTGTCCCTGCTCCAGTAGAGAAGCTTAGCTCTCAATGCAAGCAGAGAACAATTCAAAATAACCTAGTTGTTATTTGTCCTGATGCTGAATCTAACGCTCTGAGAAAGATACTACCTTAA；SEQ IDNO.5。

最终要表达的噬菌体SGF2穿孔素HolSGF2氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示。

MHPLVTVPAPVEKLSSQCKQRTIQNNLVVICPDAESNALRKILP；SEQ ID NO.6。

2)以pET-32a为载体，通过NcoI、XhoI双酶切构建重组质粒HolSGF2-pET-32a，将重组质粒转化至大肠杆菌DH5α中，-20℃/-80℃保存。

3)利用质粒提取试剂盒将重组质粒HolSGF2-pET-32a从大肠杆菌DH5α中提取出来，并转化到大肠杆菌BL21中，-20℃/-80℃保存。

4)将保存的含有重组质粒HolSGF2-pET-32a的大肠杆菌BL21按1％的接种量接种到具有50μg/ml氨苄霉素抗性的20ml LB液体培养基中，在37℃摇床中过夜振荡培养。

5)移取100μl的上述种子液至LB固体平板培养基上进行涂布，在37℃培养箱中过夜培养。

6)从平板培养基上挑取含有重组质粒的大肠杆菌BL21的单菌落，接种到具有50μg/ml氨苄霉素抗性的20ml LB液体培养基中，在37℃摇床中过夜振荡培养，制备种子液；

7)按1％的接种量将上述BL21菌液(种子液)转接到含有具有50μg/ml氨苄霉素抗性的100ml LB液体培养基中，在37℃摇床中振荡培养3h，当菌液的OD

8)通过离心收集菌体，用PBS多次洗涤并重悬菌体，利用细胞超声破碎仪进行菌体破碎，取1ml细胞破碎液作为样品，离心后得到上清液，进行SDS-PAGE检测。

9)在蛋白样品中加入适量的蛋白上样缓冲液，100℃煮沸5min，在冰上冷却至室温后上样，进行SDS-PAGE检测，如图3所示，实现了穿孔素HolSGF2的可溶性表达，重组质粒HolSGF2-pET-32a表达的穿孔素HolSGF2的大小约为22KDa。

从图3的SDS-PAGE结果可以看出，上清有目的蛋白，实现了在体外穿孔素HolSGF2的可溶性表达。

实施例3穿孔素HolSGF2的纯化

1)将保存的含有重组质粒HolSGF2-pET-32a的BL21菌株按1％的接种量接种到具有50μg/ml氨苄霉素抗性的20ml LB液体培养基中，在37℃摇床中过夜振荡培养，制备种子液。

2)将种子液按1％的接种量转接到具有50μg/ml氨苄霉素抗性的1000ml LB液体培养基中，在37℃摇床中振荡培养，当菌液的OD

3)通过离心收集菌体，用PBS多次洗涤并重悬菌体，利用细胞超声破碎仪进行菌体破碎，13000rpm/min离心10min收集上清液。

4)将上述步骤得到的上清液过0.22μm的滤膜，之后进行蛋白的纯化，采用Ni-NTA蛋白纯化试剂盒(BBI，购自生工生物工程(上海)股份有限公司)。

5)将Ni-NTA预装柱中的存储缓冲液通过重力流出。

6)用两倍柱体积的Wash Buffer平衡柱子，使Buffer缓慢流出树脂。

7)将步骤4)过滤膜后得到的上清液与WashBuffer 1:1混匀制备样品液，使样品液的总体积是柱体积的两倍。

8)将样品液加入柱子，收集流穿液到离心管中。

9)将步骤8)所得流穿液再次上柱，提高样品与填料的结合力。

10)用两倍柱体积的Wash Buffer清洗柱子并收集流穿液。使用一个新的收集管重复这个步骤，直到流穿液在280nm处吸收光度接近基线。

11)用两倍柱体积的Elution Buffer洗脱柱上的组氨酸标签蛋白，此步骤重复两次，每次的洗脱液分别储存，直到流穿液在280nm处吸光度接近基线。

12)用5倍柱体积的Elution Buffer洗脱柱料，再用5倍柱体积的Wash Buffer洗脱柱料，最后用5倍柱体积的ddH

13)通过BCA法蛋白浓度测定试剂盒检测洗脱的蛋白浓度(约为0.9mg/ml)，并且进行SDS-PAGE分析，如图4所示，表明得到了纯度较高的穿孔素HolSGF2。

14)通过抑菌圈检测纯化的穿孔素HolSGF2对宿主菌福氏志贺氏菌1.1868(L-2)的抑制活性，具体步骤如下：将100μl过夜培养的宿主菌L-2(OD

实施例4不同pH、温度下穿孔素HolSGF2对游离菌体的裂解活性研究

1)将噬菌体SGF2的宿主菌福氏志贺氏菌Shigellaflexneri 1.1868(L-2)从甘油管中按1％的接种量接种到100ml LB液体培养基中，在37℃的摇床中过夜培养。

2)上述所得菌液OD

3)移取150μl重悬菌体至96孔板中，实验组加入50μl浓度为150μg/ml的穿孔素HolSGF2，阴性对照则加入50μl PBS，每个处理3个重复。将pH值设为：3.1、4.2、5.1、6.3、7.4、8.2、9.0、10.3，2小时后测定菌液的OD

4)移取100μl重悬菌体至96孔板中，实验组加入100μl浓度为150μg/ml的穿孔素HolSGF2，阴性对照则加入100μl PBS，每个处理3个重复。将温度设为4℃，16℃，20℃，25℃，30℃，37℃，45℃和55℃，5小时后测定菌液的OD

5)计算相对裂解活性：＝{ΔOD600(HolSGF2)-ΔOD600(PBS)}/OD600初始值，结果如图6、7所示。

图6为不同pH对穿孔素HolSGF2相对裂解活性的影响，结果显示：2小时检测穿孔素活性，发现不同pH影响穿孔素HolSGF2的抑菌活性，对游离菌体具有不同的抑菌活性。在pH在3.1-10.3的范围内，穿孔素均表现出较高活性，当pH为7.4时，其抑菌活性最高，为31％，因此，该穿孔素抑菌活性较高，受pH影响较小，具有较好的应用前景。

图7为不同温度对HolSGF2相对裂解活性的影响，结果显示：5小时检测穿孔素活性，结果显示当温度在4℃到55℃之间，穿孔素对游离菌体的裂解活性呈现先升后降再升的趋势。在55℃时的抑菌活性较为突出，约为77％，最低抑菌活性是4℃时，约为20％。从结果中得出，该穿孔素活性不易受温度影响，在较宽的温度范围内均表现出较高的抑菌活性，具有良好的环境适应能力，在制备抑菌制剂方面具有较好的应用前景。

实施例5对穿孔素HolSGF2抑菌谱的研究

1)取出保存的菌株Shigella dysenteriae 1.1869,Shigellaflexneri 1.1868,Shigellaflexneri 1.10599,Staphylococcus aureus 1.8721,Staphylococcus aureus1.2465,Salmonella typhimurium 1.1174,Salmonella enteritidis 1.10754,Escherichia coli Sakai(菌株来源见表1)，按1％的接种量接种到20ml LB液体培养基中，在37℃的摇床中过夜培养。

表1菌株来源

2)分别移取100μl上述菌液(根据表1显示的菌株顺序，OD

3)移取100μl浓度为150μg/ml纯化后的穿孔素HolSGF2(或噬菌体SGF2)，加入固体平板培养基的孔中，以PBS作为对照。

4)将固体平板培养基放置在37℃的培养箱中过夜培养，观察是否产生抑菌圈，实验结果如表2所示。

表2穿孔素HolSGF2的抑菌谱

注：“+”有抑菌圈，“-”无抑菌圈。

从表2可以看出，该穿孔素对革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌均具有抑制作用，与噬菌体相比，穿孔素抑菌谱较广，解决了噬菌体专一裂解宿主的局限性，因此具有良好的应用前景。

对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。