无芒雀麦提取物在防治桃细菌性穿孔病中的应用

【技术领域】

本发明属于植物源桃细菌性穿孔病杀菌剂开发技术领域，具体涉及无芒雀麦提取物在防治桃细菌性穿孔病中的应用。

【背景技术】

桃细菌性穿孔病为桃树上常见的全球性病害，是我国桃产区重要病害之一，病原是树生黄单胞李致病变种(Xanthomonas arboricola pv.pruni,Xap)。该病菌主要侵染树叶、枝条和果实，经叶片的气孔、芽痕和果实的皮孔侵入组织，在叶片上表现为水渍状病斑，后期病斑干枯脱落呈穿孔状，引起早期大量落叶，果实被侵染导致果品下降，部分地区果实被严重侵染导致大幅减产甚至绝收，造成巨大经济损失。该病菌除危害桃树外，还危害李、杏、樱桃、扁桃等核果类果树，被欧盟列为检疫性病原物。

2022年我国桃栽培面积达到1500万亩，占世界52.0％，产量达到1529.50万t，占世界57.96％(FAO统计数据)，面积和产量均位列世界第一。随着桃细菌穿孔病在我国大部分桃产区流行发生，有效的防治药剂需求日益增加。生产上防治桃细菌性穿孔病可选择的化学药剂种类少，其中铜制剂类和抗生素类是防治桃细菌性穿孔病广泛使用的有效药剂，但其依赖性长期使用导致药物抗性、树体毒害、环境污染和农药残留等问题日益突出。

据中国农药信息网数据，截至2023年7月，我国登记的杀菌剂为11859个，用于防治细菌性病害的药剂数量约为280个，占国内杀菌剂登记产品总量2.4％，而有效成分约为32个，主要有铜制剂、抗生素、微生物菌剂类和其他类杀细菌制剂。与铜制剂和抗生素相比，植物源杀菌剂具有绿色、安全、不易造成耐药性等特点，目前有多种植物源杀菌剂在作物病害防治上取得显著的效果，如丁香酚、小檗碱、蛇床子素、乙蒜素等。细菌性病害危害作物种类广，危害性严重，防治药剂登记稀少，登记有效成分有限，且铜制剂和抗生素常态使用给产业带来巨大负面影响，因此开发植物源杀菌剂具有迫切性和必要性。

【发明内容】

针对现有细菌性病害危害作物种类广，危害性严重，防治药剂登记稀少，登记有效成分有限，且铜制剂和抗生素常态使用给产业带来巨大负面影响等问题，本发明提供了无芒雀麦提取物在防治桃细菌性穿孔病中的应用，利用无芒雀麦制备植物源桃细菌性穿孔病防治药剂。

本发明的目的通过以下技术方案实现：

通过碱提酸沉法提取和硅胶柱层析色谱纯化无芒雀麦中的抑菌组分，采用抑制圈法测定其及其主要成分对桃细菌性穿孔病病原菌的抑制作用，证实无芒雀麦抑菌组分可用于防治桃细菌性穿孔病。

无芒雀麦提取物在防治桃细菌性穿孔病中的应用，包括如下步骤：

1)原材料制备：收集无芒雀麦，干燥，粉碎，备用；

2)粗提物制备；采用碱提酸沉法提取无芒雀麦抑菌物质得到提取液，得到的提取液用3倍体积乙酸乙酯萃取，萃取3次，合并萃取液，回收乙酸乙酯得到粗提物；

所述的碱提酸沉法是指按固液比1:50加入0.5mol/L NaOH溶液提取，提取条件：50℃，超声提取3h，提取完成后加入2.0mol/L盐酸溶液调pH至中性，过滤得到提取液；

3)无芒雀麦抑菌组分制备；将得到的提取液用硅胶柱层析纯化得到无芒雀麦抑菌组分；

所述的硅胶柱层析是指活性物质溶解于甲醇，按20倍质量硅胶吸附活性物质(300-400目)得到载样硅胶，选择合适大小的层析柱对载样硅胶进行柱层析，确保载样硅胶在层析柱中的高度2-3cm，层析硅胶高度为载样硅胶的2倍，用二氯甲烷-乙酸乙酯体系进行洗脱，二氯甲烷洗脱2倍柱体积，回收二氯甲烷，再用二氯甲烷:乙酸乙酯＝3:1洗脱4倍柱体积，收集馏分，旋干溶剂后，干燥，得到无芒雀麦抑菌组分；

4)抑菌组分主要成分含量测定；利用高效液相色谱法测定抑菌组分中对香豆酸和阿魏酸的含量；

5)抑菌活性测试；以体积浓度10％DMSO溶液为溶剂，配成6个不同浓度无芒雀麦抑菌组分、对香豆酸、阿魏酸溶液，以土霉素为阳性对照，10％DMSO溶液为空白对照，采用抑制圈法测定抑制圈大小和最小抑制浓度；

所述的抑菌活性测试的菌株是指树生黄单胞李致病变种(Xanthomonasarboricola pv.pruni，Xap)。

本发明中：

步骤1)所述的收集无芒雀麦，是收集禾本科雀麦属多年生草本植物(Bromusinermis Leyss.)的地上部分。

进一步的，步骤2)所述的按20倍质量硅胶吸附活性物质得到载样硅胶，其中的硅胶孔径为300-400目。

进一步的，所述的应用，是将有效量的无芒雀麦提取物与农药上可接受的赋形剂或和添加剂配合，制成适合防治桃细菌性穿孔病的不同剂型的药物。

和现有技术相比，本发明具有如下优点：

现有技术中，未见将无芒雀麦应用于桃细菌性穿孔病防治的报道。本发明所述的无芒雀麦提取物在防治桃细菌性穿孔病中的应用，提供了一种具有较好抑菌效果无芒雀麦提取物，其植物来源丰富，制备方法简单，在抑制桃细菌性穿孔病病原菌上的效果良好，最低有效抑制浓度分别为0.25mg/mL，阳性对照药物土霉素最小抑制浓度为0.125mg/mL。无芒雀麦抑菌组分主要成分为对香豆酸和阿魏酸，含量分别694.2和259.6mg/g，最小抑制浓度为0.0625和0.50mg/mL。其中对香豆酸的最小抑制浓度为0.0625mg/mL，优于土霉素。因此，无芒雀麦抑菌组分是一种潜在桃细菌性穿孔病防治药剂。

【附图说明】

图1是本发明实施例的无芒雀麦提取物在防治桃细菌性穿孔病中的应用中2.0mg/mL浓度无芒雀麦抑菌组分与阳性对照土霉素抑菌效果图(A：无芒雀麦抑菌组分；B：对香豆酸；C：阿魏酸；D：阳性对照药物土霉素；E：空白对照)。

【具体实施方式】

以下结合实施例对本发明的具体实施方式做进一步说明。

实施例：

1无芒雀麦提取物在防治桃细菌性穿孔病中的应用，包括如下步骤：

1.1.原材料制备；收集无芒雀麦地上部分，50℃干燥，粉碎，备用；

1.2.粗提物制备；称取100.0g预处理无芒雀麦，加入5.0L 0.5mol/L NaOH，提取温度50℃的条件下，超声提取3h，提取频率为40KHz。用2.0mol/L盐酸调pH至中性，过滤；滤液中加入3倍体积乙酸乙酯萃取，萃取3次，合并萃取液，旋干乙酸乙酯得到粗提物；

1.3.无芒雀麦抑菌组分制备；粗提物溶解于甲醇，按20倍质量硅胶(300-400目)吸附活性物质得到载样硅胶，选择合适大小的层析柱对载样硅胶进行柱层析，确保载样硅胶在层析柱中的高度2-3cm，层析硅胶高度为载样硅胶的2倍，用二氯甲烷洗脱2倍柱体积后用二氯甲烷:乙酸乙酯＝3:1洗脱4倍柱体积，收集馏分，旋干溶剂后，干燥，得到无芒雀麦抑菌组分；

2无芒雀麦粗提物和抑菌组分中对香豆酸与阿魏酸含量测定：

2.1.对香豆酸和阿魏酸标准曲线的绘制；配制0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mg/mL的对香豆酸和阿魏酸标准品，用HPLC对标准品进行分析，以对香豆酸、阿魏酸浓度为横坐标(x)，峰面积为纵坐标(y)绘制标准曲线，得到对香豆酸的回归方程为：y＝718.48x-1.4166(R2＝0.9999)；阿魏酸的回归方程为：y＝1983.8x+0.6693(R2＝0.9996)；

2.2.粗提物和抑菌组分中对香豆酸和阿魏酸含量；用80％甲醇溶液将粗提物和抑菌组分配成1.0mg/mL，通过高效液相色谱仪测定对香豆酸和阿魏酸含量；色谱柱：YMC-PackODS-AM(150×4.6mm，3μm)；流动相A：0.1％甲酸水溶液，流动相B：甲醇；柱温：35.0℃；流速：0.5mL/min；进样量5.0μL；检测波长245nm；时间梯度：(0-33.00min：25％B)、(33.01-34.00min：100％B)、(34.01-46.00min：100％B)、(46.01-47.00min：40％B)、(47.01-60.00min：40％B)；根据峰面积及回归方程计算碱解物和碱解纯化物中对香豆酸和阿魏酸含量；

3无芒雀麦抑菌组分及其主要成分的抑菌活性测试

3.1.菌株活化；将菌株接种到装有2mL的LB液体培养基的试管中，37℃±1℃下培养12h～18h；用接种环挑取菌悬液以划线法接种到LB固体平板上，37℃±1℃恒温培养箱中培养18h～24h，然后从平板中挑取单菌落接种在LB固体培养基试管斜面内，37℃±1℃恒温培养箱中培养18h～24h，后将试管斜面贮存于1℃～4℃冰箱内作为保存菌；

所述的LB液体培养基，是通过称取胰蛋白胨10.0g、酵母提取物5.0g、氯化钠10.0g，然后将上述各成分加于1000mL蒸馏水中，煮沸溶解，调节pH至7.0±0.2，分装至锥形瓶中，经120℃灭菌20min制得；

所述的LB固体培养基是通过称取胰蛋白胨10.0g、酵母提取物5.0g、氯化钠10.0g、琼脂20.0g，然后将上述各成分加于1000mL蒸馏水中，煮沸溶解，调节pH至7.0±0.2，分装至250mL锥形瓶中，经120℃灭菌20min制得；

所述的LB固体平板是LB固体培养基经120℃灭菌，冷却至55℃左右，取15mL于无菌培养皿内，待其凝固制得；

3.2.菌悬液制备；用接种环取保存菌，以划线法接种到LB固体平板上，37℃±1℃下培养24h；取LB液体培养基20mL加入容量为100mL的无菌锥形瓶内，用接种环取LB固体平板上的单菌落接种在LB液体培养基内，37℃±1℃培养12h～18h；用LB液体培养基调节培养后的菌浓度至OD值为0.65，并以此作为试验菌悬液；

3.3.供试样品制备；以10％DMSO溶液为溶剂，配置2.0、1.0、0.5、0.25、0.125、0.065mg/mL无芒雀抑菌组分、对香豆酸、阿魏酸和阳性对照土霉素溶液，过滤去除杂菌，备用；

3.4.检测平板制备；固体培养基经120℃灭菌，冷却至55℃左右，菌悬液按1:10与固体培养基稀释，充分混匀后取10mL于无菌培养皿内，待其凝固后，备用；

3.5.抑菌活性测定；向检测平板中放置3个灭菌后的牛津杯，用无菌吸管分别将制备的200μL不同浓度的供试样品溶液加入牛津杯中，空白对照组加入200μL 10％DMSO，每个处理重复3次；将平板正置于37℃恒温培养箱中培养72h，取出，用抑菌圈测量仪通过十字法测量供试样品和空白对照组形成的抑菌圈直径，取平均值；抑菌圈刚好大于空白对照组即为最低抑菌浓度。

实验结果：

1.无芒雀麦粗提物和抑菌组分中对香豆酸和阿魏酸含量：

无芒雀麦粗提物中对香豆酸和阿魏酸含量分别为155.6和58.2mg/g，纯化后得到的抑菌组分对香豆酸和阿魏酸含量分别为694.2和259.6mg/g，对香豆酸占比69.4％，阿魏酸占比26.0％。

2.无芒雀麦抑菌组分和土霉素的抑制圈大小和最小抑制浓度：

在2.0mg/m浓度时，无芒雀麦抑菌组分、对香豆酸、阿魏酸和土霉素抑制圈大小分别为14.0、15.1、11.0和14.5mm，最小抑制浓度为0.25、0.0625、0.50和0.125mg/mL。

表1无芒雀麦抑菌组分和土霉素的抑制圈大小和最小抑制浓度

结果：

本发明制备的无芒雀麦抑菌组分主要成分是对香豆酸和阿魏酸，含量分别为694.2和259.6mg/g。在2.0mg/mL浓度时，无芒雀麦抑菌组分、对香豆酸、阿魏酸和土霉素抑制圈大小分别为14.0、15.1、11.0和14.5mm，最小抑制浓度分别为0.25、0.0625、0.50和0.125mg/mL，对香豆酸的最小抑制浓度优于土霉素。

图1是本实施例的无芒雀麦提取物在防治桃细菌性穿孔病中的应用中2.0mg/mL浓度无芒雀麦抑菌组分与阳性对照土霉素抑菌效果图(A：无芒雀麦抑菌组分；B：对香豆酸；C：阿魏酸；D：阳性对照药物土霉素；E：空白对照)。

以上所述仅为本发明的优选实施方式，应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明创造构思的前提下，做出若干改进和变化，这些都属于本发明的保护范围。