一种打破组培苗顶芽休眠循环保持银杏组培苗的方法

技术领域

本发明属于植物培养技术领域，具体地涉及一种打破组培苗顶芽休眠循环保持银杏组培苗的方法。

背景技术

银杏为中生代孑遗的稀有树种，系中国特产，是古代银杏类植物在地球上存活的唯一品种，最早出现于3.45亿年前的石炭纪，因此被看作“世界第一活化石”“植物界的大熊猫”。银杏叶味苦，性凉，银杏叶性平、味甘苦，可活淤血、通经络、敛肺气、平喘咳、止带浊、降血脂。白果性平，味甘、微苦、涩，有小毒，归肺经。有敛肺定喘、止带缩尿及化痰的功能外用则能“消毒杀虫”。

随着市场对银杏的需求量越来越大，其与银杏资源日益减少之间的矛盾也逐渐加剧。银杏属于裸子植物，生长缓慢，目前已有一些银杏快繁技术，但其中待解决的难题之一是银杏在组培过程中顶芽的休眠问题，这也是导致银杏组培不像杨树、构树等其他树木那样快速的原因之一。银杏在组培快繁过程中，无论是通过愈伤诱导再生的方法还是不定芽诱导的方法，再生出来的银杏苗生长都会出现顶芽休眠、茎无法伸长、叶片脱落等的问题，使得组培苗没有办法长时间保存，要继续进行组培快繁则需要从自然环境中继续获得有菌的外植体，重新消毒，这大大限制了银杏组培快繁技术的市场推广应用。

发明内容

本发明针对上述技术问题提供了一种打破组培苗顶芽休眠循环保持银杏组培苗的方法，所述方法将外源施加和培养基添加结合起来，解决了银杏组培快繁中顶芽休眠，生长缓慢的问题，实现了银杏组培苗的循环培养，不需通过重复的外植体消毒，源源不断的提供组培苗。

本发明是通过如下技术方案来实现的：

一种打破组培苗顶芽休眠循环保持银杏组培苗的方法，所述方法具体步骤如下：

第一步、外植体消毒：选取3-4月的生长健康无病的银杏树苗，取其幼枝作为外植体，进行消毒处理；

第二步、不定芽诱导：将消毒好的外植体分割成3-5cm，包含2-3节，继代至不定芽诱导培养基上；

第三步、不定芽单芽培养：将新诱导出来的不定芽从母株上取下，继代至伸长培养基上培养；

第四步、打破顶芽休眠：给不再伸长的顶芽施加GA3；施加方法：剥开银杏顶芽的鳞片，将11mM的GA3添加在顶芽上；每次添加20uL，每3天添加1次，添加4次；20天后，顶芽打破休眠，开始长出叶片，恢复生长；

第五步、继续进行不定芽诱导：将伸长的银杏枝重复上述第二步至第四步；

第六步、生根：将5-10cm的银杏茎段继代至生根培养基中生根。

作为优先的实施方式之一，不定芽诱导培养基配方是MS+WPM+0.02mg/L的NAA+0.2mg/L 6BA+0.5g/L的酶水解酪蛋白+30g/L蔗糖+2g/L活性炭+7.8g/L琼脂，pH5.8-6.0。

作为优先的实施方式之一，伸长培养配方是MS+WPM+0.2mg/L 6BA+0.5g/L的酶水解酪蛋白+30g/L蔗糖+2g/L活性炭+7.8g/L琼脂，pH5.8-6.0。

作为优先的实施方式之一，所述的生根培养基配方：1/2MS+1/2WPM+5mg/L IBA+0.5mg/L NAA+20g/L蔗糖+2g/L活性炭+7.8g/L琼脂，pH5.8-6.0。

作为优先的实施方式之一，生根之后银杏苗的培养条件：整个扩繁过程在温度25-28℃，光照强度在6000-9000Lx，光周期是16h光照，8h黑暗，培养条件下进行。

本发明与现有技术相比的有益效果：本发明方法解决了银杏组培快繁中顶芽休眠，生长缓慢的问题，实现了银杏组培苗的循环培养，不需通过重复的外植体消毒，源源不断的提供组培苗。

附图说明

图1为不同长度的银杏枝条可诱导出不定芽的效率统计；

图2为不同长度的银杏枝条可诱导出不定芽的情况展示；A-D：新鲜枝条诱导不定芽的情况。A,C枝条切成5-10cm，包含4-5节，诱导20天后未诱导出不定芽，A整体图，C细节图。B,D枝条切成3-5cm，包含2-3节，诱导20天后诱导出不定芽，B整体图，D细节图；

图3为不同GA3添加方式顶芽的萌发情况；A，C在不定芽诱导培养基中添加GA3，20天后顶芽未启动；B，D利用移液枪在顶芽出添加GA3，20天后顶芽开始萌发。A和B为整体图，C和D为细节图；

图4为添加不同浓度GA3顶芽萌发情况统计；

图5为添加不同浓度GA3顶芽萌发情况展示；A,D顶部添加3mM GA3两周之后顶芽未启动，A整体图，D细节图；B,E顶部添加11mM GA3两周之后顶芽未启动，B整体图，E细节图；C,F顶部添加11mM GA3两周之后顶芽未启动，C整体图，F细节图。

图6为不同光照强度下银杏新叶的生长发育情况展示；A-H：银杏枝条在低光照强度下顶芽萌发不正常。A，E和B，F；C，G和D，H为银杏顶芽在放置于低光照强度之前和培养20天之后的生长情况。低光照情况下银杏的叶片发育受到影响，长不出扇形形状。I，M和J，N；K，Q和L，P为银杏顶芽在放置于高光照强度之前和培养20天之后的生长情况，叶片发育正常。其中A，B，C，D，I，J，K和L为整体图，E，F，G，H，M，N，O和P为细节图。

图7为银杏茎段不定芽诱导；

图8为打破不定芽休眠的过程A不定芽从母枝上分离；B顶芽GA3处理后萌发C顶芽GA3处理后恢复生长；

图9为银杏组培苗生根苗。

具体实施方式

下面通过实施例来对本发明的技术方案做进一步解释，但本发明的保护范围不受实施例任何形式上的限制。

实施例1

一种打破组培苗顶芽休眠循环保持银杏组培苗的方法，所述方法具体步骤如下：

第一步、外植体消毒：选取3-4月的生长健康无病的银杏苗，取其幼枝作为外植体，进行消毒处理；

第二步、不定芽诱导：将消毒好的外植体分割成3-5cm，包含2-3节，继代至不定芽诱导培养基上；

第三步、不定芽单芽培养：将新诱导出来的不定芽从母株上取下，继代至伸长培养基上培养；

第四步、打破顶芽休眠：给不再伸长的顶芽施加GA3；施加方法：剥开银杏顶芽的鳞片，用移液枪添加11mM的GA3在顶芽上；每次添加20uL，每3天添加1次，添加4次；20天后，顶芽打破休眠，开始长出叶片，恢复生长为止；

第五步、继续进行不定芽诱导：将伸长的银杏枝重复上述第二步；

第六步、生根：将5-10cm的银杏茎段继代至生根培养基中生根；

其中，第二步中的不定芽诱导中的长度需在3-5cm，包含2-3节，太长的枝条侧芽不易诱导。验证过程如下：分别将新取的枝条切成5-10cm，包含4-5节为第一组，长度为3-5cm，包含2-3节为第二组，继代至不定芽诱导培养基上，20天后观察。实验重复三次，每次每个条件的外植体的数目不少于10个。如图1、图2所示，一组均未有不定芽诱导出来，二组不定芽诱导率为70％以上。

其中，第四步具体添加的GA3的添加方式是从顶芽上添加，而非在培养基中添加。具体验证过程如下：在不定芽诱导培养基(MS+WPM+0.02mg/L的NAA+0.2mg/L 6BA+0.5g/L的酶水解酪蛋白+30g/L蔗糖+2g/L活性炭+7.8g/L琼脂，pH5.8-6.0)中添加11mM GA3，为第一组，在其中继代新鲜的银杏枝条。20天后进行结果观察；第二组培养基使用不定芽诱导培养基，在顶芽上用移液枪添加GA3。GA3浓度是11mM，每次添加20uL，每3天添加1次，添加4次。实验重复三次，每次每个条件的外植体的数目不少于10个。20天后进行结果统计。

如图3所示，第一组培养基中添加GA3的顶芽均未萌发。而通过移液枪从顶芽上添加GA3的枝条顶芽65％有启动现象。

其中，第四步中具体添加的GA3浓度是11mM，过高或过低浓度不能打破顶芽休眠。具体验证过程如下：分别在休眠芽的顶端添加3mM，11mM，30mM GA3溶液，每次添加20uL，每3天添加1次，添加4次。20天之后观察顶芽情况。实验重复三次，每次每个条件的外植体的数目不少于10个如图4、图5所示，3mM和30mMGA3均不能打破银杏顶芽的休眠，只有浓度是11mM的GA3可以使65％以上的顶芽打破休眠。

实施例2

一种打破组培苗顶芽休眠循环保持银杏组培苗的方法，所述方法具体步骤如下：

第一步、外植体消毒：选取4月的生长健康无病的银杏苗，取其幼枝作为外植体，进行消毒处理；

第二步、不定芽诱导：将消毒好的外植体分割成3cm，包含2节，继代至不定芽诱导培养基上；

第三步、不定芽单芽培养：将新诱导出来的不定芽从母株上取下，继代至伸长培养基上培养；

第四步、打破顶芽休眠：给不再伸长的顶芽施加GA3；施加方法：剥开银杏顶芽的鳞片，用移液枪添加11mM的GA3在顶芽上；每次添加20uL，每3天添加1次，添加4次；20天后，顶芽打破休眠，开始长出叶片，恢复生长为止；

第五步、继续进行不定芽诱导：将伸长的银杏枝重复上述第二步至第四步；

第六步、生根：将5-10cm的银杏茎段继代至生根培养基中生根；

作为优先的实施方式之一，所述的生根培养基配方：1/2MS+1/2WPM+5mg/L IBA+0.5mg/L NAA+20g/L蔗糖+2g/L活性炭+7.8g/L琼脂，pH5.8-6.0。

作为优先的实施方式之一，不定芽诱导培养基配方是MS+WPM+0.02mg/L的NAA+0.2mg/L 6BA+0.5g/L的酶水解酪蛋白+30g/L蔗糖+2g/L活性炭+7.8g/L琼脂，pH5.8-6.0。

作为优先的实施方式之一，伸长培养配方是MS+WPM+0.2mg/L 6BA+0.5g/L酶水解酪蛋白+30g/L蔗糖+2g/L活性炭+7.8g/L琼脂，pH5.8-6.0；

作为优先的实施方式之一，生根之后银杏的培养条件：整个扩繁过程在温度25-28℃，光照强度在5000-9000Lx，光周期是16h光照，8h黑暗，培养条件下进行。

整个银杏组培苗培养过程需在高光强下进行，光强达不到6000Lx，会影响银杏叶片发育。具体验证过程如下：将装有银杏枝条的组培瓶分别放置于3000Lx-5000Lx培养条件下，为第一组；放置于6000-9000Lx为第二组。20天后观察其生长状况。结果表明，如图6所示，第一组低光照情况下银杏的顶芽虽然可以萌发，但是叶片不能完全发育，不舒展。只有在第二组高光情况下，银杏叶片才能健康的萌发生长。

实施例3

第一步、外植体消毒：选取3月的生长健康无病的银杏苗，取其幼枝作为外植体，进行消毒处理；

第二步、不定芽诱导：将消毒好的外植体分割成5cm，包含3节，继代至不定芽诱导培养基上。不定芽诱导培养基配方是MS+WPM+0.02mg/L NAA+0.2mg/L 6-BA+0.5g/L酶水解酪蛋白+30g/L蔗糖+2g/L活性炭+7.8g/L琼脂，pH5.8-6.0。诱导的不定芽如图7所示。

第三步、不定芽单芽培养：将新诱导出来的不定芽从母株上取下，如图8所示，继代至伸长培养基上培养。伸长培养配方是MS+WPM+0.2mg/L 6BA+0.5g/L酶水解酪蛋白+30g/L蔗糖+2g/L活性炭+7.8g/L琼脂，pH5.8-6.0。

第四步、打破顶芽休眠：给不再伸长的顶芽施加GA3。施加方法：剥开银杏顶芽的鳞片，用移液枪添加11mM的GA3在顶芽上。每次添加20uL，每3天添加1次，添加4次。20天后，顶芽打破休眠，开始长出叶片，恢复生长为止。

第五步、继续进行不定芽诱导：将伸长的银杏枝重复上述第二步至第四步。

第六步、生根：将5-10cm的银杏茎段继代至生根培养基中生根。生根培养基配方：1/2MS+1/2WPM+5mg/L IBA+0.5mg/L NAA+20g/L蔗糖+2g/L活性炭+7.8g/L琼脂，pH5.8-6.0。

第七步、银杏的培养条件：整个扩繁过程在温度25-28℃，光照强度在5000-9000Lx，光周期是16h光照，8h黑暗，培养条件下进行,如图9所示。