一种多粘类芽孢杆菌J-04-06及其用途

技术领域

本发明属于农业生物防治技术领域，具体涉及一种多粘类芽孢杆菌J-04-06及其用途。

背景技术

随着我国对病害研究的深入，生物防治受到了高度的重视，主要通过筛选拮抗微生物或基因技术来构建具有拮抗效果的微生物菌株。目前研究最多的微生物包括细菌、真菌、放线菌等。其中细菌主要为芽孢杆菌属(Bacillus)和假单孢杆菌属(Pseudomonas)，与芽孢杆菌属亲缘关系较近的类芽孢杆菌属(Paenibacillus)也受到了高度重视。细菌与病原菌竞争营养物质及生态位，或者是产生抗菌物质抑制病原菌的生长。

芽孢杆菌属(Bacillus)具有繁殖速度快、产生芽孢、有效活菌数高、生存能力强等优点。芽孢杆菌生存力强主要是因为具有多层细胞壁结构以及抗应激孢子。除了炭疽芽孢杆菌和蜡状芽孢杆菌外，它们通常被认为对植物和生态环境有益且安全。因此对芽孢杆菌属了解很多，最多的为枯草芽孢杆菌(B.subilis)和解淀粉芽孢杆菌(B.amyloliquefaciens)。枯草芽孢杆菌和解淀粉芽孢杆菌能够抑制植物病原体、促进植物根系生长。

多粘类芽孢杆菌属于植物根际生长细菌，并被用作植物病害的生物防治剂。多粘类芽孢杆菌作为生防菌不仅能直接能分泌有活性的代谢物拮抗病原菌，还能通过与植物之间的互作来起到抗病效果。多粘类芽孢杆菌能诱导植物产生系统抗性，这可以使植物增加与防卫有关酶的活性。植物系统抗性被诱导后，便具有广谱抗性。童蕴慧等研究发现多粘类芽孢杆菌W3菌株悬浮液及其滤液都可以诱导番茄叶片对灰霉病菌的系统抗性，而定殖在根际或叶面的多粘类芽孢杆菌W3可以诱导激活植物产生系统抗性，产生对随后的病原菌侵染的抵抗性。此外，生防多粘类芽孢杆菌还能通过固氮和溶磷等方式为宿主植物提供营养。由于多粘芽孢杆菌可有效地预防细菌、真菌及线虫引起的植物病害，因此通常将其筛选出来，用于制备生防菌剂，但是现有技术中公开的多粘芽孢杆菌大多对病虫害的防治效果不理想。

发明内容

针对现有技术中的上述不足，本发明提供一种多粘类芽孢杆菌J-04-06及其用途，可有效的防治西瓜枯萎病、柑橘炭疽病等病原菌引起的病症。

为实现上述目的，本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：

一种多粘类芽孢杆菌(Paenibacillus polymyxa)J-04-06，该菌株保藏于北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国微生物菌种保藏中心，保藏时间为2023年09月25日，保藏编号为CGMCC No.28540。

进一步地，该菌株的16S rDNA的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

进一步地，该菌适宜生长温度为33℃～37℃，最适生长温度为35℃，pH耐受范围为1～10，最适pH为7。

采用上述多粘类芽孢杆菌J-04-06制备的菌剂。

进一步地，菌剂中活性成分为多粘类芽孢杆菌J-04-06，或其菌悬液、发酵液、发酵产物或次生代谢产物。

上述多粘类芽孢杆菌J-04-06，或菌剂在制备防治西瓜枯萎病的药物中的应用。

上述多粘类芽孢杆菌J-04-06，或菌剂在制备防治柑橘炭疽病的药物中的应用。

上述多粘类芽孢杆菌J-04-06，或菌剂在制备防治烟草青枯病的药物中的应用。

.一种杀菌剂，包括上述多粘类芽孢杆菌J-04-06，或菌剂。

进一步地，该杀菌剂可抑制的病原菌包括白术根腐病菌、苹果斑点落叶病菌、小麦赤霉病菌、黄瓜绵腐病菌、水稻纹枯病菌、白菜软腐病菌、猕猴桃溃疡病菌及烟草青枯病菌。

本发明的有益效果：

本发明筛选得到的多粘类芽孢杆菌(P.polymyxa)J-04-06，发现该菌株对多种病原菌有较好的抑制效果，尤其是对西瓜枯萎病和采后柑橘炭疽病的防治效果。因此，将P.polymyxa J-04-06菌株开发成新型微生物农药，有望减少化学农药的使用，具有很好的应用前景。

附图说明

图1为P.polymyxa J-04-06的菌落图；

图2为P.polymyxa J-04-06对不同病原菌生长的抑制作用；

图3为P.polymyxa J-04-06在16S rDNA PCR产物电泳图；其中，条带1为DNAMarker，条带2为16S rDNA PCR产物；

图4为菌株P.polymyxa J-04-06的16SrDNA系统发育树图。

具体实施方式

下面对本发明的具体实施方式进行描述，以便于本技术领域的技术人员理解本发明，但应该清楚，本发明不限于具体实施方式的范围，对本技术领域的普通技术人员来讲，只要各种变化在所附的权利要求限定和确定的本发明的精神和范围内，这些变化是显而易见的，一切利用本发明构思的发明创造均在保护之列。

实施例1多粘类芽孢杆菌J-04-06的获得

一、菌株的分离

1、土样的采集

在取样前，需要先用取样铲将土壤表层的浮土和杂草去除。如果土样较深，可采用土钻对土壤样品进行采集。将采集好的土壤样本过2mm的土壤筛出去，土壤中细根、石子、虫子等杂物。若土壤样本粘性较大，可用镊子去除样本中的杂物。将采集好的土壤样本，放入准备好的无菌的自封袋、牛皮纸。

2、菌株的分离纯化

采用稀释法称取土壤2g放入已灭菌的研钵中，加入10mL无菌水进行充分研磨，然后充分震荡，取研磨汁液1mL，加入含9mL无菌水的试管中，混合均匀后，分别梯度稀释至10

3、拮抗菌株的筛选

(1)拮抗芽孢杆菌的初筛

以实验室小麦赤霉病菌、西瓜枯萎病菌、烟草赤星病菌三种植物病菌为靶标菌，将其活化后接种PDA平板，28℃培养至其满皿。用打孔器从植物病菌平板上制取一直径5mm的病原菌块置于病原菌筛选平板中央，将分离纯化得到的芽孢杆菌用接种环挑取纯化好的菌种点接在距平板中央3cm处的4个角点上，每处理设3个重复，28℃培养7d后观察抑菌效果。选出对病原菌生长有明显的抑制作用，且被抑制的病原菌菌丝边缘平齐、规则且拮抗作用持久的菌株，记录菌落直径并计算抑菌率。

表1初筛具有拮抗作用的菌株

通过初步筛选共得到四株具有拮抗作用的菌株，以对峙平板法测定菌株Q-01、Q-05、P-14、J-04-06对三种病原菌的抑菌效果。由表1可知，四株拮抗菌株对烟草赤星病菌、西瓜枯萎病菌和小麦赤霉病菌的抑制效果明显，抑制效果均在42％以上。

(2)进入复筛的菌株，按照初筛的方法：

真菌性病菌：以0.5cm的打孔器打苹果斑点落叶病菌、黄瓜绵腐病菌、柑橘炭疽病菌、水稻纹枯病菌、白术根腐病菌菌饼，每处理设3个重复，25℃培养3-5d，直至植物病原菌布满平板，记录菌落直径并计算抑菌率。

细菌性病菌：吸取5mL液体培养18h的菌株、猕猴桃溃疡病菌和烟草青枯病菌的菌液(37℃、180r/min)，于40℃的LB培养基中摇匀后倒平板吹干。然后，吸取液体培养18h多粘类芽孢杆菌J-04-06菌液(37℃、180r/min)5μL，滴加于预先放入无菌滤纸碟(直径为7mm)的平板上，37℃恒温培养20h。每处理设3个重复，37℃恒温培养20h。记录菌落直径、透明圈直径，并计算抑菌圈大小。

表2菌株J-04-06对不同病原菌的抑制作用

由表2和图2可知，抑菌活性测试结果显示，菌株J-04-06对烟草赤星病菌、西瓜枯萎病菌、白术根腐病菌、苹果斑点落叶病菌、小麦赤霉病菌、黄瓜绵腐病菌、柑橘炭疽病菌、水稻纹枯病菌、白菜软腐病菌、猕猴桃溃疡病菌及烟草青枯病菌均有不同程度的抑制作用。

二、J-04-06的鉴定

1、形态鉴定

经过对J-04-06的形态观察，其菌株的形态如下：菌落颜色为白色，四周隆起较中间部位高，有光泽，革兰氏染色为阳性；细菌产芽孢，椭圆形，菌体居中。

2、生理生化鉴定

参照《伯杰细菌鉴定手册》第九版和《常见细菌系统鉴定手册》(东秀珠主编科学出版社)对菌株J-04-06进行生理生化鉴定，结果见表3。

表3J-04-06生理生化鉴定结果

注:+表示阳性反应；－表示阴性反应。

3、16S rDNA序列测定与分析

(1)DNA的提取

将纯化后不同形态的单菌落接种至菌悬液体培养基中，35℃过夜培养，吸取2mL培养液于无菌离心管中，13 000r/min离心10min，弃去上清液，收集菌体沉淀(共2～3次)。菌体沉淀使用细菌基因组DNA快速提取试剂盒并按操作步骤提取基因组DNA。

(2)PCR扩增及系统发育树的构建

将步骤(1)得到的DNA溶液作为扩增模板，采用细菌通用引物27F-1492R进行PCR扩增；

PCR扩增体系(用Taq酶扩增)：25μl体系：1μl cDNA，1μl上游引物F，1μl下游引物R，12.5μl 2×Taq Master Mix，9.5μl ddH2O，

PCR反应程序：预变性94℃3min，变性94℃30s，退火54℃30s，延伸72℃1min(循环数：35cycles)，终止延伸72℃10min，12℃∞。

经过1％琼脂糖凝胶电泳检测后，将PCR扩增产物送至生工进行测序，使用NCBI数据库进行分析16S r DNA基因序列，并使用软件MEGA 7.0构建系统发育树如图4所示。

PCR扩增结果见图3，PCR产物大小为1458bp，经测序鉴定，菌株J-04-06的16SrDNA序列如序列SEQ ID NO.1所示。经过对J-04-06菌株进行形态特征、生理生化特征和16SrDNA测序，鉴定J-04-06为多粘类芽孢杆菌。

该菌在土壤中分离牛肉膏蛋白胨固体培养基中35℃培养3天，连续传代数代培养，其培养特征、形态特征、生理生化等生物学特征均无明显变化，表现出良好的生物学性状稳定性。菌株经16S rDNA鉴定并命名为多粘类芽孢杆菌(Paenibacillus polymyxa)J-04-06，已于2023年09月25日保藏于中国微生物菌种保藏中心(地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号)，保藏编号为CGMCCNo.28540)。

实施例2多粘类芽孢杆菌J-04-06的杀菌活性

一、多粘类芽孢杆菌J-04-06对西瓜枯萎病的防治

供试材料：西瓜种子(京域2号)

将分离的生防菌分别用LB培养基进行扩繁，并稀释为109CFU/mL的菌悬液，用于后续盆栽防效试验。

盆栽防效试验于四川农业大学植物保护研究所温室中进行，温度控制在28-35℃，自然光照。将西瓜种子用75％的酒精表面消毒5min，无菌水清洗3次。将种子种于盛有拌菌土的一次性塑料杯中(底土110g/杯，含西瓜枯萎病菌孢子悬浮液5×10

表5多粘类芽孢杆菌的防效及对西瓜的促生长作用

注：L：多粘类芽孢杆菌J-04-06菌悬液；L×5:J-04-06菌悬液稀释5倍；L×10:J-04-06菌悬液稀释10倍

使用IBM SPSS Statistics 25数据处理软件进行统计分析，采用邓肯氏新复极差法进行差异显著性分析。同列数据后标记不同小写字母表示差异显著(P<0.05)。

试验结果(表4和表5)，在多粘类芽孢杆菌J-04-06菌悬液和无菌滤液处理后，该菌株对西瓜枯萎病具有一定的防治作用。处理后能使西瓜植株出苗齐整、植株生长健壮，同时又能够有效抑制西瓜枯萎病害的发生。实验结果如表5，其中J-04-06菌悬液综合表现效果最好出苗率为95％，比对照增加18.75％；对西瓜枯萎病的防治效果为59.86％。

二、多粘类芽孢杆菌J-04-06对采后柑橘炭疽病的防治

刺伤接种取新鲜柑橘果实，先在果实腰部刺一伤口(3mm×3mm)，在伤口处接种20μL的生防菌悬浮液(1×10

表6病情分级标准

表7J-04-06对采后柑橘炭疽病的病情指数和防治效果统计

注：CK：清水；L：J-04-06菌悬液原液

使用IBM SPSS Statistics 25数据处理软件进行统计分析，采用邓肯氏新复极差法进行差异显著性分析。同列数据后标记不同小写字母表示差异显著(P<0.05)。

由表7可见，柑橘果实刺伤接种后常温下存放20d，对照果实的柑橘炭疽病发病率达93.3％，多粘类芽孢杆菌J-04-06悬浮液处理的烂果率为43.3％。虽然菌株J-04-06的防效(52.1％)与咪鲜胺(85.7％)相比存在显著差异，但烂果率和病情指数均极显著低于对照。

综上可知，本申请筛选得到的多粘类芽孢杆菌J-04-06具有优异的杀菌功效，特别是针对柑橘炭疽病和西瓜枯萎病。

最后应说明的是，以上具体实施方式仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照实例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。