猪丹毒活疫苗的耐热保护剂及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及活疫苗耐热保护剂技术领域，特别涉及一种猪丹毒活疫苗的耐热保护剂及其制备方法和应用。

背景技术

猪丹毒为猪丹毒杆菌感染引起的热性、急性传染病。1882年，首次从病猪体内分离出猪丹毒杆菌，此后各国家和地区都有发生。我国四川是最早发生猪丹毒的省份，随后各个省市均呈流行趋势。猪丹毒在我国的发病率达68%，病死率达20%。该病是我国二类动物疫病，且是一种人畜共患病。猪、羊、狗、牛、马等家畜，鹅、鸭、等禽鸟类均能感染，人感染主要通过伤口感染，感染人群主要以饲养者、兽医、屠宰者为主。仔猪为最易感动物，尤其3-6月龄月龄仔猪最为易感。带菌猪和病猪是该病的主要传染源，带病猪的骨髓、回盲瓣和扁桃体中均有细菌存活，通过口、鼻、粪、尿排除体外，污染圈舍、垫料和器具等，进行范围内的传播。健康猪患病后会出现明显异常，精神萎靡，不愿站立，停止进食，畏寒怕冷，高烧至42℃左右，强行驱赶病猪站立会出现跛行现象，根据临床症状的不同，猪丹毒可分为急性败血性、亚急性型与慢性型，其中急性败血型最为严重。急性败血性在猪丹毒并流行初期常见，临床症状以败血症为主，病猪出现发热、嗜睡、精神沉郁、母猪流产等症状，甚至急性死亡。病猪皮肤出现红色或紫色皮肤病变，随病程可坏死、脱落。急性型猪丹毒病耐过者可转为亚急性型或慢性型。猪丹毒广泛存在于自然界中，免疫力低的猪最易感染、亚急性型也可出现败血症，但病情比急性型轻，病程1～2周，精神萎靡，食欲减退或废绝，发热，便秘，皮肤出现粉红色或黑褐色菱形疹块，病程初期疹块充血，后期淤血，疹块形成后体温降低，症状减轻，数日后自愈，病情严重者长期不愈，皮肤坏死形成皮革样痂皮、典型症状为慢性的关节炎，心内膜炎和皮肤坏死。慢性型病猪体态消瘦，生长缓慢。患慢性关节炎的病猪出现跛行、卧地不起。患慢性心内膜炎病猪常因心脏骤停突然死亡。皮肤坏死的猪病变皮肤形似皮革，2～3个月后可脱落形成瘢痕组织。不同的猪丹毒杆菌毒力有明显的差异，该现象由神经氨酸酶、荚膜多糖及表面蛋白等多种毒力因子调控。有研究报道，神经氨酸酶仅在致病性的猪丹毒杆菌中存在，且其分泌量与菌株的致病性呈正相关。不同的猪丹毒杆菌毒力有明显的差异，该现象由神经氨酸酶、荚膜多糖及表面蛋白等多种毒力因子调控。猪丹毒杆菌通过消化道进入机体，也可通过损伤的皮肤部位或昆虫叮咬进入。患病猪免疫力低下的情况可在24h内出现菌血症，随后出现败血症。在败血症早期，宿主多数器官的毛细血管和小静脉受损。在败血症早期，宿主多数器官的毛细血管和小静脉受损。血管内形成纤维蛋白血栓、细菌栓等，血细胞渗出，关节、心脏、皮肤等部位结缔组织发生活化。在重症病例中，可发生溶血或缺血性坏死。

猪丹毒病常向一个地区传播，表现出反复爆发的特点，给养猪户造成不同程度的经济损失，具有很强的散发性和地方性传播特点。控制好水源、有效的饲养管理措施、提高干净卫生的饲料及环境卫生，均可以有效的预防该病的发生。目前我国对猪丹毒的防治主要依靠疫苗和抗生素，但由于抗生素滥用导致药物耐受，及药物残留影响肉品安全，所以使用抗生物防治猪丹毒措施越来越不可行，疫苗免疫接种被认为是防控猪丹毒最经济及最有效手段，商品化疫苗的推广应用为我国有效防控猪丹毒疫情发挥了重要作用。为保证疫苗抗原的品质，尤其是减小在生产、运输过程中由于温度快速变化而带来的损耗，发展耐热保护技术则是保证疫苗品质稳定的关键，其中采用合适的耐热保护剂是能够保证疫苗在冷藏条件下得到良好的保存的关键步骤，疫苗耐热保护剂不仅为疫苗的冷链运输和贮藏提供了便利，其关键在于提升了疫苗的效力。

目前，我国主要使用的猪丹毒活疫苗耐热保护剂的成分包括明胶、乳糖、酪蛋白和水，耐热保护剂的组份简单、配置简便，在随着疫苗保存环境温度升高，常常会导致疫苗效力下降或失效，造成免疫失败，因此提出一种新的猪丹毒活疫苗耐热保护剂来保证猪丹毒疫苗效力是非常重要的研究课题。

发明内容

本申请提出了一种猪丹毒活疫苗的耐热保护剂及其制备方法和应用，解决了现有技术中的猪丹毒活疫苗耐热保护剂保护效果不佳的问题。

发明采用的技术方案是：第一方面，本发明提出了一种猪丹毒活疫苗的耐热保护剂，所述耐热保护剂包含以下质量体积百分比含量的组分：

麦芽糊精：8％~12％；

明胶：3％~5％；

L-精氨酸盐酸盐：1％~2％；

聚乙烯吡咯烷酮：1％~3％；

L-组氨酸盐酸盐：1％~3％；

酶解酪蛋白：6％~8％；

D-山梨醇：3％~5％；

硫代硫酸钠：1％~2％；

叔丁醇：3％~6％；

聚乙烯亚胺：1％~3％；

其余为：注射用水。

优选地，在一个较优的实施例中，所述耐热保护剂包含以下质量体积百分比含量的组分：

麦芽糊精：9％~10％；

明胶：4％~5％；

L-精氨酸盐酸盐：2％；

聚乙烯吡咯烷酮：2％~3％；

L-组氨酸盐酸盐：1％~3％；

酶解酪蛋白：6％~7％；

E-山梨醇：5％；

硫代硫酸钠：1％~2％；

叔丁醇：5％~6％；

聚乙烯亚胺：1％~2％；

其余为：注射用水。

第二方面，本发明还提出了一种耐热保护剂的制备方法，其包括以下步骤：

步骤S1、第一溶液的配制：将明胶溶于注射用水中得到第一溶解液，向第一溶解液中加入麦芽糊精至完全溶解，得到第二溶解液，再向第二溶解液中加入聚乙烯亚胺至完全溶解得到第三溶解液，随后向第三溶解液中加入酶解酪蛋白至完全溶解，获得第一溶液；

步骤S2、第二溶液的配制：将L-组氨酸盐酸盐溶于注射用水中得到第四溶解液，向第四溶解液中加入聚乙烯吡咯烷酮至完全溶解得到第五溶解液，再向第五溶解液中分别加入D-山梨醇、硫代硫酸钠、叔丁醇至完全溶解得到第六溶解液，随后向第六溶解液中加入的L-精氨酸盐酸盐至完全溶解并调节PH值至7.2~7.4，得到第二溶液；

步骤S3、将所述第一溶液和第二溶液混合后定容、灭菌，获得所述耐热保护剂。

第三方面，本发明还进一步提出了一种猪丹毒活疫苗，所述猪丹毒活疫苗由猪丹毒菌液和所述的耐热保护剂配制而成。

第四方面，本发明还进一步提出了一种猪丹毒活疫苗的制配方法，包括步骤：

步骤T1、将猪丹毒菌液与权利要求1或2中所述的耐热保护剂混匀，得到疫苗原液；

步骤T2、将所述疫苗原液冷冻干燥，获得所述猪丹毒活疫苗。

优选地，所述猪丹毒菌液的活菌数为5×109CFU/ml~8×109CFU/ml。

优选地，所述猪丹毒菌液与耐热保护剂的体积比取值范围为2:1~4:1。

优选地，所述猪丹毒菌液与耐热保护剂的体积比为3:1。

结合第四方面，在一些可选的实施例中，所述步骤T2中冷冻干燥的处理方法包括：

步骤T2-1、预冻阶段：先将所述疫苗原液在20min~40min内降温至-17℃，在-17℃保持1h，然后在20min~40min内再次降温至-40℃~-45℃，并在-40℃~-45℃温度下保持3h~5h；

步骤T2-2、抽真空阶段：在10min~30min内将真空度降到100mT~120mT；

步骤T2-3、升华干燥阶段：先在2h内将温度升至-22℃并维持10h~12h，再在20min内将温度由-22℃升至-17℃并维持8h~10h，最后在20min~30min将温度由-17℃升至-5℃并维持3h~5h；

步骤T2-4、解析干燥阶段：将真空度调节至10mT，将温度在1h~2h升高至28℃~30℃，并保温6h~8h。

进一步地，步骤T2-1、预冻阶段：将疫苗原液在40min由常温降温至-17℃，在-17℃保持1h，然后在40min内降温至-45℃，在-45℃保持4h；步骤T2-2、抽真空阶段：在20min内将真空度降到120mT；步骤T2-3、升华干燥阶段：在真空度降到120mT时开始加热，在2h内将温度由-45℃升至-22℃并维持10h，之后在20min内将温度由-22℃升至-17℃并维持10h，最后20min将温度由-17℃升至-5℃并维持5h；步骤T2-4、解析干燥阶段：将真空度调节至10mT，将温度在2h升到28℃，保温8h。

与现有技术比较，本申请基于上述猪丹毒活疫苗的耐热保护剂，耐热保护剂包含适量的麦芽糊精、明胶、L-精氨酸盐酸盐、聚乙烯吡咯烷酮、L-组氨酸盐酸盐、酶解酪蛋白、D-山梨醇、硫代硫酸钠、叔丁醇和聚乙烯亚胺。该保护剂成分简单、原料易得、成本较低；经过实验证明，由该耐热保护剂所制得的猪丹毒活疫苗在冻干后能够保持原有的理化特性和生理活性，且各病毒抗原有效成分损失很小，冻干后疫苗疏松多孔，且易与瓶壁脱离，含水量均在3.0%以下，能够迅速溶解于水中，因此配制得到的疫苗产品具有较佳的冻干外型、较低的水分含量和良好的溶解特性。因此，本发明提供的耐热保护剂可以有效保护使用其的猪丹毒活疫苗在冷冻干燥过程中活菌数不被降解，从而保证疫苗免疫效力，同时获得具有良好的冻干外型、较低的水分含量和良好的溶解特性的猪丹毒活疫苗产品。

且由该耐热保护剂制得的猪丹毒活疫苗在37℃条件下保存7天后的各活菌数滴度下降均未超过1*109CFU/ml，该疫苗在2~8℃条件下保存24个月后的各活菌数滴度下降也均未超过1*109CFU/ml，因此，本发明提供的耐热保护剂可以保证使用其猪丹毒活疫苗能够稳定长期保存，且有效抑制其中各活菌数滴度的下降，从而保证猪丹毒的免疫效力。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为本发明中保护剂配制的猪丹毒活疫苗的分装冻干后照片。

具体实施方式

为了使本发明所要解决的技术问题、技术方案及有益效果更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法。实施例中描述到的各种生物材料的取得途径仅是提供一种实验获取的途径以达到具体公开的目的，不应成为对本发明生物材料来源的限制。事实上，所用到的生物材料的来源是广泛的，任何不违反法律和道德伦理能够获取的生物材料都可以按照实施例中的提示替换使用。

实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，实施例将有助于理解本发明，但不应作为对本发明内容的限制。

本申请提出了一种猪丹毒活疫苗的耐热保护剂，以确保猪丹毒活疫苗可以长时间稳定保存，并保持猪丹毒活疫苗保持良好的免疫效力水平和安全性。还基于该耐热保护剂提供了一种免疫效力好、安全性高且可以长时间稳定保存的猪丹毒活疫苗。

以下提出具体的实施例进行说明，以下实施例中所使用的化学物质包括明胶、麦芽糊精、L-精氨酸盐酸盐、聚乙烯吡咯烷酮、L-组氨酸盐酸盐、酶解酪蛋白、D-山梨醇、硫代硫酸钠、叔丁醇、聚乙烯亚胺；其中，明胶购自Sigma公司；L-组氨酸盐酸盐购自国药公司；麦芽糊精购自罗盖特Roquette公司；酶解酪蛋白购自Sigma公司；聚乙烯吡咯烷酮购自沃凱公司；叔丁醇购自天津大茂化学试剂厂；L-精氨酸盐酸盐购自国药公司；聚乙烯亚胺购自源叶生物有限公司；D-山梨醇购自国药公司；硫代硫酸钠购自天津科盟化工有限公司。以下实施例中所使用到的仪器或菌种包括：高压灭菌柜，压力范围在88kPa~114kPa；菌种为G

样品的准备：菌液10倍系列稀释：稀释范围为10-1至10-6，操作如下：稀释前将菌液涡旋10秒，然后取菌液1ml，加到9ml 含10%健康动物血清的马丁琼脂培养基中，涡旋混匀10秒，即完成第一次稀释（10-1）；重复五次以上操作，至稀释度为10-6。释放液体时吸管与试管内壁成30度角，使液体自然放入，吸管不接触液面。每次转移液体时更换吸管。

固体培养基培养：选择适宜的连续三个稀释度（一般为10-4、10-5、10-6），分别用1ml 吸管吸取稀释菌液1.0ml，每个稀释度滴3个含10%健康动物血清的马丁琼脂培养基平皿。每个平皿准确滴入0.1ml，倾斜转动平皿使菌液散开，在超净台内半敞平皿盖晾干15min~30min，翻转平皿置37℃、5％CO2 恒温培养箱内培养24~48h（亦可适当延长）。

菌落计数：观察菌落形态应为肉眼观察呈灰白色、不透明的圆形小菌落。用低倍显微镜观察，呈浅黄色，中心可见核样结构，周边有向外生长的短毛样分支，并计数。按下列公式计算猪丹毒菌液含量：

每毫升菌液中菌落单位（CFU/ ml）=同一稀释度三次重复的菌落平均数×10×稀释度×M。

冻干疫苗活菌滴度测试通过琼脂平板计数法进行测定。

冻干疫苗先用含10%健康动物血清的马丁琼脂培养基稀释成1ml/头份，再稀释成M倍（M=2~9），涡旋混匀10秒使猪丹毒菌液分散，然后进一步作10倍系列稀释。每次稀释前再次涡旋混匀。其余操作参照上述菌液测定方法。

在一个具体的实施例中：

第一步：制备猪丹毒活疫苗耐热保护剂。

该实施例旨在制备用于猪丹毒活疫苗的耐热保护剂，该耐热保护剂的作用是对疫苗有效成分在冷冻干燥过程及冻干后储存阶段实施保护以保证疫苗的免疫效果，该耐热保护剂的制备方法具体包括以下步骤：

步骤S1、第一溶液的配制：按照如下表1所示的耐热保护剂的成分含量（其中％表示质量体积百分比含量，即g/100ml，下同），分别精密称取所需量的明胶于定量注射用水中，期间置60℃水浴加热并不停搅拌至完全溶解，得到第一溶解液；再称取麦芽糊精加入第一溶解液中至完全溶解，得到第二溶解液；再向第二溶解液中加入所需量的聚乙烯亚胺至完全溶解，得到第三溶解液；随后精密称取酶解酪蛋白加入第三溶解液中，置60℃水浴加热并不停搅拌将其溶解，获得第一溶液。

步骤S2、第二溶液的配制：按照下表1所示的各耐热保护剂的成分含量，分别精密称取L-组氨酸盐酸盐溶于注射用水中，置60℃水浴，同时不停晃动直至完全溶解，得到第四溶解液；再精密称取所需量的聚乙烯吡咯烷酮于第四溶解液中使其完全溶解，得到第五溶解液；随后精密称取L-精氨酸盐酸盐、硫代硫酸钠、叔丁醇、D-山梨醇加入到第五溶解液中，置60℃水浴，同时不停晃动将其溶解，并利用7.5%碳酸氢钠溶液将PH至调整至7.2~7.4，获得第二溶液。

步骤S3、将第一溶液定容后在高压灭菌柜中灭菌（116℃高压20~30min）和第二溶液定容后过滤除菌（0.22μm滤膜），将第一溶液和第二溶液按1:1比例混合，获得耐热保护剂。

如下表1所示，本实施例中分别配置了5种耐热保护剂，分别命名为耐热保护剂1、耐热保护剂2、耐热保护剂3、耐热保护剂4和耐热保护剂5，将配置好的耐热保护剂置于37℃下保存备用。

需要说明的是：配制耐热保护剂时，采取单溶每一种试剂，在单溶时逐渐增加溶质的量，避免出现过饱和现象，以及避免出现溶解不彻底的情况。

表1：猪丹毒活疫苗耐热保护剂的组成及含量表1：猪丹毒活疫苗耐热保护剂的组成及含量

第二步：配制猪丹毒活疫苗

在第二步中，利用上述第一步中所制备好的耐热保护剂，即保护剂1、保护剂2、保护剂3、保护剂4和保护剂5作为猪丹毒活疫苗的耐热保护剂，配制猪丹毒活疫苗的具体方法包括以下步骤：

步骤T1、将猪丹毒菌液分别与上述五种耐热保护剂混匀，具体操作为将疫苗菌液匀速加入盛放耐热保护剂的储液瓶内，人工缓慢混匀15min左右（避免产生过多的泡沫），即可获得对应五种耐热保护剂的疫苗原液。

步骤T2、将各所述疫苗原液进行冷冻干燥处理，获得所述猪丹毒活疫苗。

更加具体地，上述步骤T1的具体操作方法如下：

步骤T1-1、猪丹毒菌液的制备

步骤T1-1-1、一级种子繁殖及鉴定：冻干菌种启封后，用马丁肉汤进行稀释，接种明胶平板，置15~18℃环境下培养3~5日，观察菌落形态应为肉眼观察呈灰白色、不透明的圆形小菌落。用低倍显微镜观察，呈浅黄色，中心可见核样结构，周边有向外生长的短毛样分支；G

步骤T1-1-2、二级种子繁殖：取一级种子接种于肉肝胃膜消化汤内，在36~37℃培养20~22小时，取样经检验纯粹后。置2~8℃保存，使用期应不超过3日。猪丹毒生产菌种基础上应不超过5代。

步骤T1-1-3、制苗用培养基为肉肝胃膜消化汤，调整pH值为7.6±0.2。

步骤T1-1-4、猪丹毒制苗用菌液制备将纯粹检验合格的二级种子液按培养基量的1%~2%接种干肉肝胃膜消化汤内，同时按2%~4%加人裂解血球全血，36~37℃培养20~22小时，培养过程中需振荡2~3次，或者采用增菌培养方法。培养菌液可用高速离心法，将菌液浓缩制成菌悬液，用于配苗，在2~8℃保存应不超过15日。

步骤T1-1-5、半成品检验包括纯粹检验、活菌计数均按《中国兽药典》规定的方法进行检验。

步骤T1-2、活菌滴度测定，活菌测定结果如下表2所示：

步骤T1-3、按冻干后的猪丹毒活疫苗的每头份疫苗中猪丹毒活菌数≥5×10

步骤T1-4、取上述步骤T1-1获得的疫苗菌液分别与第一步获得的五种耐热保护剂（保护剂1、保护剂2、保护剂3、保护剂4和保护剂5）按照体积比为2:1、3:1和4:1混合均匀，具体操作为将疫苗菌液匀速加入盛放耐热保护剂的储液瓶内，人工缓慢混匀15min左右（避免产生过多的泡沫），即可获得疫苗原液。

上述步骤T2的具体操作方法如下：

用移液器将步骤T1-4获得的疫苗原液按3ml（30头份）/瓶分装，即分装为3ml/瓶，随后冷冻干燥，即可配制得到猪丹毒活疫苗（冻干制剂），冷冻干燥的处理工艺选择在产品进箱后再将冻干箱降温的慢冻速率，预冻的最低温度的选择需要根据配制成混合疫苗的共晶点温度-17℃，将预冻最低温度低于此温度。

其中冷冻干燥的冻干曲线以冷冻干燥3ml疫苗原液计为例，具体的冷冻干燥处理方法包括：

步骤T2-1、预冻阶段：先将所述疫苗原液在20min~40min内由常温降温至-17℃，在-17℃保持1h，然后在20min~40min内再次降温至-40℃~-45℃，并在-40℃~-45℃温度下保持3h~5h，此步骤将样品完全冻结后转入到步骤T2-2；

步骤T2-2、抽真空阶段：在将疫苗原液预冻之后立马进入抽真空降压阶段，在10min~30min内将真空度降到100mT~120mT，直至结束；

步骤T2-3、升华干燥阶段：当将真空度降到100mT~120mT之间某一具体值后开始加热，先在2h内将温度升至-22℃并维持10h~12h，再在20min内将温度由-22℃升至-17℃并维持8h~10h，最后在20min~30min将温度由-17℃升至-5℃并维持3h~5h，随后转入解析干燥阶段，使瓶内冻结产品自上而下逐渐升华，最终成型；

步骤T2-4、解析干燥阶段：将真空度调节至10mT，将温度在1h~2h升高至28℃~30℃，并保温6h~8h。

在一个具体的实施例中，冷冻干燥处理方法为：

步骤T2-1、预冻阶段：将疫苗原液在40min由常温降温至-17℃，在-17℃保持1h，然后在40min内降温至-45℃，在-45℃保持4h；

步骤T2-2、抽真空阶段：在20min内将真空度降到120mT；

步骤T2-3、升华干燥阶段：在真空度降到120mT时开始加热，在2h内将温度由-45℃升至-22℃并维持10h，之后在20min内将温度由-22℃升至-17℃并维持10h，最后20min将温度由-17℃升至-5℃并维持5h；

步骤T2-4、解析干燥阶段：将真空度调节至10mT，将温度在2h升到28℃，保温8h。

需要说明的是：根据产品确定冻干箱板层最高允许温度为30℃。由于传递的热差，板层温度常比产品最高允许温度略低，本实施例取28℃。根据冻干机性能、疫苗特性及装量，将预冻时间、升华干燥阶段和解析干燥时间全过程确定为44h左右。

第三步：对配制的各猪丹毒活疫苗冻干前后的活菌数进行检测，检测结果如下表3所示。

第四步：按照《中华人民共和国兽用生物制品规程》检验规程文献中记载的方法对该实施例配制的疫苗产品进行了常规项目检测，如下表4所示。

由上表3和表4检测结果可知，使用耐热保护剂4和耐热保护剂5配制得到的猪丹毒活疫苗在冻干前后活菌率较高且外观符合要求，其中的各活菌数（滴度）下降较少，因此耐热保护剂4和耐热保护剂5能够在冷冻干燥过程有效保护猪丹毒活疫苗中的各活菌数不被降解，获得效价水平较高的疫苗产品。

相对于耐热保护剂4和耐热保护剂5，耐热保护剂2中不含有聚乙烯亚胺，猪丹毒活疫苗在冻干前后各活菌数滴度下降较多，因聚乙烯亚胺属于聚合物，通常聚合物的稳定作用取决于聚合物的多重性质，从大分子表面析出、表面活性、使大分子溶液黏度升高从而阻止其他小分子(如糖及多羟基化合物)的结晶、抑制冷冻过程中pH的剧烈变化等；耐热保护剂1中不含有L-组氨酸盐酸盐，猪丹毒活疫苗冻干前后各活菌数滴度下降也较多，而L-组氨酸盐酸盐在保护剂中可起到抑制大分子物质氧化和聚集的作用，大分子蛋白质类保护剂组氨酸，它是一个经典、优良的蛋白质稳定剂，能有效阻止蛋白质表面的吸附，对冻干过程中多数蛋白都具有保护作用；耐热保护剂3中不含有叔丁醇，叔丁醇作为冻干保护剂具有多重优势，已被广泛用于冻干制剂，可以单独作为溶剂溶解不溶性药物或水中稳定性差的药物；硫代硫酸钠是一种是抗氧化剂，防止自身氧化，消耗冻干样品内部和环境中的氧，使冻干样品物料不被氧化；另一种使抗氧化剂给出电子或氢离子，阻断冻干样品中的氧化链式反应；还有一种方式是抗氧化剂通过抑制氧化的活性而防止冻干样品的氧化变质；可见本发明提供的耐热保护剂中各适量配比组分对猪丹毒活疫苗有一定影响，根据保护剂中成分的不同作用以保护猪丹毒活疫苗中的各活菌数不被降解，获得效价水平较高的疫苗产品。

根据表4的检测结果，可见使用耐热护剂4和耐热保护剂5获得的猪丹毒活疫苗在冻干后呈淡黄色或淡粉色海绵状疏松团块，且易与瓶壁脱离（图1示出了使用耐热保护剂4的经分装（4瓶）、冷冻干燥之后获得的猪丹毒活疫苗冻干产品的照片），含水量均在3.0%以下，能够迅速溶解于水中，因此配制得到的疫苗产品具有较佳的冻干外型、较低的水分含量和良好的溶解特性。综上所述，耐热保护剂4和耐热保护剂5的耐热保护效果更佳，疫苗冻干前后的活菌率损失更低一些，更能保证获得效价水平更高的猪丹毒活疫苗。

第五步：该实施例还对以保护剂4作为疫苗耐热保护剂配制获得的猪丹毒活疫苗按照《中华人民共和国兽用生物制品规程》检验规程文献中记载的方法进行了耐老化试验，其中具体为：将猪丹毒活疫苗置37℃的环境下7日，以及在2~8℃保存24个月，检测疫苗产品中各活菌数的变化情况，检测结果如下表5所示。

由上表5的检测结果可知，以耐热保护剂4作为耐热保护剂配制获得的猪丹毒活疫苗无论是按照菌液:耐热保护剂为2:1、3:1，还是4:1，该疫苗在37℃条件下保存7天后的各活菌数滴度下降均未超过1*109CFU/ml，下降最多的也仅为0.49*109CFU/ml；该疫苗在2~8℃条件下保存24个月后的各活菌数滴度下降也均未超过1*109CFU/ml，下降最多的也仅为0.39*109CFU/ml。以保护剂5作为耐热保护剂配制猪丹毒活疫苗时，也同样如保护剂4一样具有良好的耐热保护效果。

因此，本发明提供的耐热保护剂可以保证使用其猪丹毒活疫苗能够稳定长期保存，且有效抑制其中各活菌数滴度的下降，从而保证猪丹毒的免疫效力。

第六步：制备猪丹毒活疫苗耐热保护剂

按照步骤S1~S3的方法，根据下表6所列耐热保护剂的组成及含量制备猪丹毒活疫苗耐热保护剂，分别命名为保护剂6、保护剂7和保护剂8。利用保护剂6、保护剂7和保护剂8按照与第二步中相同的方法分别配制了猪丹毒活疫苗，其中菌液:保护剂=3:1。

随后按照与第三步和第四步相同的方法分别对使用保护剂6、保护剂7和保护剂8配制得到的猪丹毒活疫苗冻干前后各活菌数滴度的下降情况以及成品常规项目进行检测，检测结果如下表7所示。

由上表6和表7结果可知，使用保护剂6-保护剂8配制得到的猪丹毒活疫苗在冻干前后，其中的各活菌率（滴度）下降较少，最高活菌率达到91.3%，因此保护剂6-保护剂8能够在冷冻干燥过程有效保护猪丹毒活疫苗中的各活菌数不被降解，获得效价水平较高的疫苗产品。

根据表7检测结果还可见使用保护剂6-保护剂8获得的猪丹毒活疫苗在冻干后呈淡黄色或淡粉色海绵状疏松团块，且易与瓶壁脱离，含水量均在3.0%以下，能够迅速溶解于水中，因此配制得到的疫苗产品具有较佳的冻干外型、较低的水分含量和良好的溶解特性。因此，本发明提供的耐热保护剂可以有效保护使用其的猪丹毒活疫苗在冷冻干燥过程中活菌数不被降解，从而保证疫苗免疫效力，同时获得具有良好的冻干外型、较低的水分含量和良好的溶解特性的猪丹毒活疫苗产品。

第七步：配制猪丹毒活疫苗的冻干曲线优化

该步骤中利用1获得的保护剂5作为耐热保护剂，按照与第二步中相同的方法将获得的疫苗菌液与保护剂5按照体积比为3:1混合均匀，获得疫苗原液；随后将疫苗原液按照3ml/瓶分装后进行冷冻干燥处理，其中本发明人设计了多种冻干曲线，以从中筛选确定理想的适宜于猪丹毒活疫苗的冻干曲线，以下列出了三种冻干曲线：冻干曲线1、冻干曲线2和冻干曲线3。

冻干曲线1：与第二步中配制猪丹毒活疫苗所采用的冻干曲线相同；基于该冻干曲线1获得的猪丹毒活疫苗命名为猪丹毒活疫苗1；

冻干曲线2（作为对照冻干曲线）：所述冷冻干燥的冻干曲线以冷冻干燥3ml疫苗原液计为：

预冻阶段：将疫苗原液在1h由常温降温至-45℃，在-45℃保持1h，然后在40min内降温至-45℃，在-45℃保持4h；

抽真空阶段：在25min内将真空度降到120mT；

升华干燥阶段：在真空度降到120mT时开始加热，在2h内将温度由-45℃升至-20℃并维持10h，之后在20min内将温度由-20℃升至-10℃并维持10h，最后20min将温度由-10℃升至-3℃并维持4h；

解析干燥阶段：将温度在2h升到28℃，保温8h。

基于该冻干曲线2获得的猪丹毒活疫苗命名为猪丹毒活疫苗2。

冻干曲线3（作为对照冻干曲线）：所述冷冻干燥的冻干曲线以冷冻干燥3ml疫苗原液计为：

预冻阶段：将疫苗原液在30min由常温降温至-25℃，在-25℃保持1h，然后在30min内降温至-45℃，在-45℃保持4h；

抽真空阶段：在20min内将真空度降到100到120mT；

升华干燥阶段：在2h内将温度由-45℃升至-30℃并维持5到8h，之后在40min内将温度由-30℃升至-10℃并维持10h，最后20min将温度由-10℃升至2℃并维持8h；

解析干燥阶段：将温度在2h升到28℃，保温8h。

基于该冻干曲线3获得的猪丹毒活疫苗命名为猪丹毒活疫苗3。

按照与第二步中相同的方法，分别对猪丹毒活疫苗1、猪丹毒活疫苗2和猪丹毒活疫苗3冻干前后各活菌数下降情况以及疫苗成品常规项目进行检测，检测结果如下表8所示。

根据上表8检测结果可知，猪丹毒活疫苗1中的猪丹毒的活菌率为91.4%，并且疫苗冻干后物理性状、溶解度、剩余水分均良好。猪丹毒活疫苗2中的猪丹毒的活菌率为82.8%，且冻干后物理性状稍差，疫苗底部发生轻微熔化，出现萎缩现象。而猪丹毒活疫苗3中的猪丹毒的活菌率为68.4%，且冻干后出现分层、塌陷现象，不易与瓶壁脱离等现象。其中对于猪丹毒活疫苗中同一菌液，相对于猪丹毒活疫苗1来说，猪丹毒活疫苗3中的活菌率下降均相对较多，猪丹毒活疫苗2活菌率下降较少。通过测定样品共熔点拟定冻干基本参数，调整影响冻干效果的不同因素，最终确定冻干曲线。板层温度在不同阶段的设定不同，对冻干效率的影响不同。因此，本发明采用冻干曲线1不但可以减小猪丹毒活疫苗在冻干过程中活菌数滴度的损失，而且能够提高产品质量。

第八步：猪丹毒活疫苗安全性试验

以上述保护剂4作为耐热保护剂，按照第二步的方法以菌液和保护剂体积比为2:1、3：1和4:1配制获得猪丹毒活疫苗，分别命名为猪丹毒活疫苗3、猪丹毒活疫苗4、猪丹毒活疫苗5；

将保护剂5作为耐热保护剂，按照第二步的方法以菌液和保护剂体积比为2:1、3：1和4:1配制获得猪丹毒活疫苗，分别命名为猪丹毒活疫苗6、猪丹毒活疫苗7、猪丹毒活疫苗8；

将保护剂6作为耐热保护剂，按照第二步的方法以菌液和保护剂体积比为2:1、3：1和4:1配制获得猪丹毒活疫苗，分别命名为猪丹毒活疫苗9、猪丹毒活疫苗10、猪丹毒活疫苗11；

将保护剂7作为耐热保护剂，按照第二步的方法以菌液和保护剂体积比为2:1、3：1和4:1配制获得猪丹毒活疫苗，分别命名为猪丹毒活疫苗12、猪丹毒活疫苗13、猪丹毒活疫苗14，作为免疫组；

以灭菌生理盐水作为对照组；分别选用猪丹毒抗体阴性、体重20kg-25kg的健康易感猪作为实验动物，免疫组每头猪经皮下注射接种20头份疫苗，对照组每头猪以相同方法、相同剂量接种生理盐水，持续观察14日，结果如下表9所示，各组实验猪均无异常反应，精神食欲均表现正常，未出现猪丹毒症状，其中，猪丹毒疫苗3和猪丹毒疫苗7各有2/5实验猪在免疫后6h出现体温升高，最高温度达到40.4℃；猪丹毒疫苗6和猪丹毒疫苗12各有1/5实验猪在免疫后6h出现体温升高，最高温度达到40.2℃；体温出现短暂性升高，但在免疫后12h各组实验猪体温均表现正常。表明本发明配制的猪丹毒活疫苗具有良好的安全性。

最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，应包含在本发明的保护范围之内。