尿石素A在制备防治重症急性胰腺炎相关心损伤药物中的应用

技术领域

本发明属于尿石素A的新应用领域，具体涉及了尿石素A在制备防治重症急性胰腺炎相关心损伤药物中的应用。

背景技术

重症急性胰腺炎(SAP)是由于胆结石、酒精、内窥镜逆行胰胆管造影和各种药物等多种原因导致胰腺本身及周围组织发生炎症反应，并诱发全身炎症反应综合征(SIRS)和多器官衰竭障碍(MODS)，是临床上常见急腹症之一，病死率高达30％。其中，心脏是易受胰腺炎症影响的目标器官之一，许多基础研究已观察到SAP中心脏的明显超微结构变化及心肌功能障碍，包括心肌收缩功能受损、心肌水肿肥大等，并有研究表明，SAP可诱发心源性休克、心肌炎等，其中心肌梗死发生率高达60.5％，故SAP相关急性心损伤(SACI)病死风险高，是SAP早期死亡的主要原因之一。但目前SAP诱发ACI的病理生理学尚不清楚，对其机制的科学研究仍然较少，临床上尚无特异性药物用于防治SACI，因此，探索重症急性胰腺炎相关心损伤的发病机制并开发特定药物，成为全世界SACI的重点和难点。

因此，能够寻找出一种天然物质，能够制备防治重症急性胰腺炎相关心损伤药物，具有十分重要的意义。

发明内容

本发明的目的在于：针对现有技术的问题，提供了尿石素A的新应用，提供了一种防治重症急性胰腺炎相关心损伤疾病的新手段。

为了实现上述目的，本发明采用的技术方案为：

尿石素A在制备防治重症急性胰腺炎相关心损伤药物中的应用。

尿石素A(3,8-dihydroxy-dibenzoprranone)是一种天然存在的多酚化合物，通过肠道微生物群的代谢产生，来源于含有鞣花酸和鞣花丹宁的食物，如石榴、浆果、核桃和草莓。本申请通过大量的实验探究发现，尿石素A对防治重症急性胰腺炎相关心损伤有一定的效果。

尿石素A在制备重症急性胰腺炎后具有抑制心脏组织中促炎因子水平的升高作用的药物中的应用。

进一步的，促炎因子为IL-6和TNF-α。

尿石素A在制备重症急性胰腺炎后具有改善心脏线粒体功能障碍作用的药物中的应用。

尿石素A在制备重症急性胰腺炎后具有减少心机细胞凋亡作用的药物中的应用。

尿石素A在制备重症急性胰腺炎后具有恢复心肌细胞线粒体氧化代谢能力作用的药物中的应用。

尿石素A在制备重症急性胰腺炎后具有恢复心肌细胞的异常糖酵解率作用的药物中的应用。

心脏富含线粒体，通过线粒体氧化磷酸化和糖酵解这两大能量代谢途径，以持续产生大量ATP来维持心脏正常功能,且线粒体ATP的产生大部分(约40-60％)来自脂肪酸氧化。当心肌缺血缺氧时，代谢底物由脂肪酸转化为葡萄糖，导致脂质氧化水平下降及糖酵解增多，总ATP水平下降；同时心肌脂肪酸氧化不完全，脂质中间代谢物堆积，直接损害细胞胶原纤维功能，产生ROS，引发线粒体功能障碍，并进一步诱发线粒体依赖性细胞死亡途径，如细胞凋亡、坏死和铁死亡等，最终导致心脏损伤。因此，调节心脏线粒体代谢，特别是脂肪酸代谢，以恢复线粒体功能障碍最终减少心脏损害，成为防治SACI-SCI的关键。

CD36是一种脂肪酸转运蛋白，负责初级摄取游离脂肪酸等进入心肌细胞；肉毒碱棕榈酰转移酶-1(CPT-1)是位于线粒体外膜上的关键酶，可控制长链脂肪酸转运到线粒体中进行β氧化。脂肪酸通过CD36/CPT-1途径转移到线粒体中以形成脂肪酰基辅酶A，经历β氧化，产生进入TCA循环的乙酰辅酶A和黄素腺嘌呤二核苷酸(FADH2)和烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)，最后进入等离子体产生ATP。有研究证明，CD36/CPT-1发生代谢紊乱后，导致ATP生成减少，并引发心肌收缩功能减退；且由于胞浆中的游离脂肪酸不能被代谢分解，常以甘油三酯形式储存在心肌组织中，导致脂质沉积性心肌病和心肌肥厚等病变。故这两种酶对心脏正常能量代谢至关重要。同时，研究表明心肌脂肪酸β氧化主要涉及PPAR-α/PGC-1α等信号通路：PPAR-α是脂肪酸氧化关键酶的转录调控因子，在辅助激活因子PGC-1α作用下可通过调节脂肪酸氧化关键酶，包括CPT-1、CPT-2、MCAD、LCAD等，以提高心肌脂肪酸β氧化水平，改善心肌能量缺乏状态。因此，通过PPAR-α/PGC1-α/CD36/CPT-1通路途径来调节线粒体脂肪酸代谢，可能是防治SACI-SCI的中心环节。

本发明的另一目的是为了提供一种药物组合物的应用。

一种药物组合物在以下a-f任意一种或多种中的应用，所述药物组合物包括治疗有效量的尿石素A，以及药学上可接受的辅料；

a.防治重症急性胰腺炎相关心损伤；

b.重症急性胰腺炎后，抑制心脏组织中促炎因子水平的升高；

c.重症急性胰腺炎后，改善心脏线粒体功能障碍；

d.重症急性胰腺炎后，恢复心肌细胞的异常糖酵解率；

e.重症急性胰腺炎后，减少心肌细胞凋亡；

f.重症急性胰腺炎后，恢复心肌细胞线粒体氧化代谢能力。

进一步的，药学上可接受的辅料包括稀释剂、赋形剂、填充剂、粘合剂、湿润剂、吸收促进剂、表面活性剂、润滑剂、稳定剂、香味剂、甜味剂、色素中的至少一种。

进一步的，药物组合物为液体制剂、固体制剂或喷雾制剂。

综上所述，由于采用了上述技术方案，本发明的有益效果是：

本发明建立了SACI小鼠模型，通过外周血心肌酶学乳酸脱氢酶LDH、磷酸肌酸激酶同工酶CK-MB、肌钙蛋白CTNT水平、心肌组织炎症因子IL6及TNFα、组织病理学等验证了心脏损伤有所减轻；小鼠心脏组织进行了RNA-seq分析，验证了尿石素A能够通过恢复线粒体脂肪酸氧化代谢的平衡来减轻心脏线粒体功能障碍和减少心肌凋亡。通过血清甘油三酯TG及游离脂肪酸FFA水平、心脏油红染色、组织病理学改变等，探索出尿石素A通过CPT-1对心脏脂肪酸代谢的调节作用；通过观察PPAR-α/PGC1-α/CD36/CPT-1通路的mRNA及蛋白表达水平变化，探索出尿石素A调节心脏线粒体脂肪酸代谢的机制通路。提供了一种防治重症急性胰腺炎相关心损伤疾病的新手段。

附图说明

图1为探究SACI与UA的疗效关系及最佳给药时间点的实验结果图。

图2为探究UA减轻SACI小鼠胰腺和心脏的炎症损伤的实验结果图。

图3为探索UA改善心脏线粒体功能障碍的实验结果图。

图4为探究UA通过调节线粒体凋亡途径来防止心肌细胞凋亡的实验结果图。

图5为探究尿石素A恢复SACI的能量代谢紊乱的实验结果图。

图6为探究体外验证给药剂量及时间的实验结果图。

图7为探究尿石素A通过调节CPT1减轻心肌细胞损伤的实验结果图。

图8为探究尿石素A通过调节CPT1改善心肌细胞线粒体能量代谢的实验结果图。

具体实施方式

下面结合附图，对本发明作详细的说明。

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

说明：本课题组积累了丰富的急性胰腺炎研究经验，长期进行实验性急性胰腺炎相关体内体外研究，熟练掌握牛磺胆酸钠胰胆管逆行注射建立SACI大、小鼠模型的方法，技术稳定且成熟；华西医院国家重点实验室、中药药理研究室拥有动物实验平台、药动学和分子生物学平台、药物分析等技术与设备，华西医院华盛顿线粒体代谢研究中心，提供线粒体的seahorse功能分析仪器和组学(蛋白组学、修饰蛋白组、代谢组)分析平台，提供了本实验所需的各种实验仪器设备和研究技术。

实施例1

探索UA对SACI的疗效

动物实验验证

选取C57雄性小鼠，随机分成假手术组、SACI模型组、UA给药组，选取(造模前3h、造模前1h、造模后1h、造模后3h、造模后6h)共5个时间点分别给药，通过不同药物及不同时间点的区别，探究SACI与UA的疗效关系及最佳给药时间点。

如图1所示，发现建模前1小时和建模后3小时腹腔注射UA对SACI小鼠是最合适的，这也是后续UA治疗点实验的基础。

造模取材观察比较

外周血脂肪酶、淀粉酶水平、炎症因子IL6及TNF、组织病理学等，探索胰腺炎症及外周炎症水平变化。

图2中的A、B和F中的数据显示，与假手术组相比，SACI组的血清淀粉酶和脂肪酶水平以及胰腺病理评分均大幅上升。同时，与假手术组相比，SACI组血清心脏损伤指标(LDH、CK-MB、cTnT)和心脏病理评分增加，证实了心脏损伤。这些结果表明动物模型符合SACI的诊断标准。

外周血心肌酶学乳酸脱氢酶LDH、磷酸肌酸激酶同工酶CK-MB、肌钙蛋白CTNT水平、心肌组织炎症因子IL6及TNFα、组织病理学等验证心脏损伤是否减轻。

UA能明显降低SACI组小鼠血清淀粉酶、脂肪酶、LDH、CK-MB、cTnT水平，降低胰腺和心脏组织病理学评分(图2中的A-G)。此外，UA还抑制了SACI组小鼠血清和心脏组织中促炎因子(IL-6和TNF-α)水平的升高(图1中的H-K)。这些结果表明UA可以减轻SACI小鼠胰腺和心脏的炎症损伤。

实施例2

探索UA是否改善心脏线粒体功能障碍，并减少心肌凋亡

选取C57雄性小鼠随机分成假手术组、SACI模型组、UA组，结合最佳时间点，取材观察比较：1.透射电镜TEM观察线粒体超微结构变化；2.心脏组织膜电位JC-I、ATP、COX1复合物、ROS水平变化，探索线粒体功能障碍是否改善；3.TUNEL凋亡荧光、WB检测凋亡相关蛋白Bcl-2、Bax、caspase3的表达变化，探索心肌凋亡是否减轻。

为了揭示UA治疗SACI的潜在机制，我们对小鼠心脏组织进行了RNA-seq分析。根据FPKM>1和调整后p值<0.05的标准确定DEGs。在SACI vs.Sham组中，检测到315个差异基因，而SACI vs.UA组显示出335个差异基因，其中有90个重叠的差异基因在这两组中共享，因此有理由推测UA可能通过调节这90个DEGs对SACI产生保护作用(图3中的A)。在已确定的90个DEGs中，UA处理明显提高了线粒体相关基因的表达(图3中的B)。GO术语分析揭示了这些DEGs与线粒体内膜及相关复合物、电子传递活性、ATP合成酶活性和氧化磷酸化相关能量代谢的主要功能关联(图3中的C)。火山分析和Western印迹分析提供了令人信服的证据，表明线粒体外膜转运酶7(TOMM7)在SACI中的表达量减少(图3中的D和E)，这意味着线粒体蛋白质转运和稳定机制受到破坏。深入研究发现，SACI对参与线粒体呼吸电子传递链的DEGs(Ndufc1、Ndufa2、Ndufa4、Ndufa5、mt-Nd3、Uqcrq)具有下调作用，而这些DEGs与线粒体呼吸复合体I-IV的功能密切相关(图3中的D)。而UA能上调它们的表达，恢复参与电子传递链的COX I和COX IV的活性(图3中的D和E)，并进一步恢复心肌线粒体膜电位(图3中的G)。与线粒体能量代谢有关的ATP合成酶(Atp5mpl、Atp5k、Atp5j2等)在SACI的影响下表现出表达下降，但UA能有效恢复ATP合成酶的活性，恢复SACI减少的ATP生成(图3中的D和H)。此外，透射电子显微镜显示，UA有能力恢复受SACI影响的心脏内线粒体的结构损伤，包括线粒体肿胀、紊乱、线粒体嵴部分溶解和断裂(图3中的F)。综上所述，UA有望通过恢复线粒体形态结构和改善功能障碍来减少SACI损伤。

心肌细胞的线粒体具有在炎症或氧化应激下启动凋亡途径的倾向。

图4中的A中描述的研究结果表明，SACI心脏中凋亡阳性细胞的数量大幅增加，而UA组的情况随后有所缓解。通过Western印迹和免疫组化技术进行的分析表明，UA引起了抗凋亡蛋白Bcl-2表达的上调，同时诱导了凋亡蛋白Bax和Caspase-3表达的下调(图4中的B-D)，而Bax和Caspase-3是线粒体死亡途径的关键组成部分。这些变化有力地支持了UA通过调节线粒体凋亡途径来防止心肌细胞凋亡的观点。

实施例3

(1)选取C57雄性小鼠随机分成假手术组、SACI模型组、UA组、SACI+CPT-1抑制剂Etomoxir组、UA+CPT-1抑制剂Etomoxir组，观察比较：1.各组血清甘油三酯TG及游离脂肪酸FFA水平、心脏油红染色、组织病理学改变等，探索UA通过CPT-1对心脏脂肪酸代谢的调节作用；2.观察PPAR-α/PGC1-α/CD36/CPT-1通路的mRNA及蛋白表达水平变化，探索UA调节心脏线粒体脂肪酸代谢的机制通路。

(2)体外通过分离小鼠原代心肌细胞，分成正常组、SACI模型组、UA组、SACI+CPT-1抑制剂Etomoxir组、UA+CPT-1抑制剂Etomoxir组，提前干预1h后，使用LPS诱导造模，观察比较：1.细胞培养液中的TNFα及IL-6等表达；2.WB检测通路蛋白PPAR-α/PGC1-α/CD36/CPT-1、凋亡相关蛋白Bcl-2、Bax,caspase-3等表达；3.seahorse及相关试剂盒检测线粒体能量代谢及功能水平：膜电位、ATP合成、Ca2+浓度等。通过体外细胞实验进一步验证UA通过PPAR-α/PGC1-α/CD36/CPT-1通路调节心脏线粒体脂肪酸代谢。

尿石素A可恢复SACI的能量代谢紊乱

为了深入了解UA调控SACI线粒体的机制，我们采用非靶向代谢组学方法进行代谢物分析。我们采用正交投影潜结构判别分析(OPLS-DA)对三组的心脏样本数据进行了处理。随后通过交叉验证评估了模型的可靠性。随后，使用VIP>＝1(投影中变量重要性)的OPLS-DA模型，并通过独立样本t检验(p<0.05)筛选出差异表达代谢物(DEMs)。值得注意的发现揭示了U

这些观察结果表明，SACI心脏的线粒体可能受到损害，脂肪酸代谢能力受到干扰。耐人寻味的是，事实证明服用UA能有效逆转长链酰基肉碱的消耗(图5中的C和D)，同时降低循环中的FFA和TG水平(图5中的E和F)。KEGG通路还发现，UA的DEMs侧重于甘油磷脂代谢，并显示其异常积累明显减少，如磷脂酰乙醇胺(PE)、磷脂酰甘油(PG)、磷脂酰胆碱(PC)和溶血磷脂酰乙醇胺(LPE)(图5中的B-D)。

为了深入探讨UA对心肌线粒体FAO的潜在影响，我们对FAO中的长链酰基肉碱CPT1进行了深入研究，并采用了CPT1抑制剂依托莫西尔(ETO)。如图4中的G和H所示，通过Western印迹分析发现，UA有效地恢复了SACI对CPT1表达的抑制。然而，依托莫西的存在进一步加剧了对CPT1的抑制，并抵消了UA对其的上调作用。同时，线粒体生物生成和脂质代谢相关调控因子(PPAR-α、PGC1-α、CD3)的表达水平也受到UA的上调(图5中的G和H)。所有这些发现都有力地表明，CPT1作为FAO的一个关键因子，具有作为UA靶点的巨大潜力。

确定体外验证给药剂量及时间

为了确定UA在SACI中减轻心肌细胞损伤的效果，我们提取了小鼠的原代心肌细胞，以便进行研究调查。尽管SACI的确切机制仍不清楚，但SACI多器官功能障碍和合并感染显然与败血症有着错综复杂的联系。因此，为了模拟SACI，我们利用LPS制作了败血症相关心脏损伤模型(SICM)。随后，我们对不同浓度和时间间隔下UA对LPS的影响进行了全面评估。在研究的浓度范围内，10μg/mL的UA可显著提高细胞活力，有效缓解LPS诱导的SICM(图6中的A)。随后，在不同的时间点进行了UA(10μg/mL)干预。与LPS组相比，应用UA干预1小时、2小时和4小时对细胞存活率没有产生实质性影响。然而，干预6小时后，细胞存活率明显提高。干预8小时和24小时后，尽管观察到细胞存活率增加，但未发现明显差异(图6中的B)。综上所述，我们选择UA(10μg/mL)干预6小时作为UA治疗模型。

尿石素A通过调节CPT1减轻心肌细胞损伤

细胞被分成五个不同的体外组：(a)假组：空白对照组，细胞未受任何处理；(b)LPS组：LPS(1μg/mL)干预24小时；(c)LPS+UA组：LPS+UA(10μg/mL，干预6小时)；(d)LPS+ETO组：LPS+Etomoxir(100μmol/L，6小时)；(e)LPS+ETO+UA组：LPS+Etomoxir(100μmol/L，干预6小时)+UA(10μg/mL，干预6小时)。如图7中的A所示，油红O染色表明，UA可减轻LPS诱导的脂质蓄积，但依托莫西的作用会取消UA的功效。同样，由于依托莫西抑制了CPT1，加剧了LPS诱导的心肌细胞中游离脂肪酸和甘油三酯的高水平，以及心肌MDA的产生，表明脂肪分解增加，这同样削弱了UA的改善作用(图7中的B-D)。此外，抑制CPT1同样会加重LPS诱导的病理性心肌损伤，上调促炎因子IL-6和TNF-α以及心肌细胞中心脏损伤标志物LDH、CK-MB和cTnT的水平，从而消除UA对SACI心脏的治疗作用(图7中的E-I)。研究结果表明，UA有可能通过调节CPT1来减轻心肌脂肪毒性。

尿石素A通过调节CPT1改善心肌细胞线粒体能量代谢

为了更全面地了解UA对心肌线粒体FAO的作用机制，我们对线粒体功能和线粒体氧化代谢能力进行了评估。TOMM20位于线粒体外膜内，是线粒体不可或缺的标志物，负责保护线粒体结构并使其正常运行。免疫荧光分析显示，UA处理导致TOMM20丰度上调，而依托莫西的存在抵消了UA的影响(图8中的A)。同样，抑制CPT1会放大线粒体膜电位的破坏、LPS诱导的ROS生成和心肌细胞的ATP消耗，从而削弱UA对线粒体功能的保护作用(图8中的B-D)。通过海马分析仪XFe24对心肌细胞线粒体氧化代谢能力进行进一步评估后证实，抑制CPT1会明显降低原代心肌细胞的耗氧量(OCR)(图8中的E)，阻碍UA对线粒体氧化能力(如最大呼吸、基础呼吸和剩余呼吸能力)的增强作用(图8中的F)。这些发现强调了CPT1在UA恢复心肌细胞线粒体氧化代谢能力过程中不可或缺的作用。

与LPS组相比，依托莫西干扰组细胞的氧化能力并不是最低的，这可能是应激条件下的细胞代偿，但UA仍能恢复依托莫西诱导的受损线粒体氧化能力(图8中的F)。在这种情况下，我们进一步探讨了心肌细胞的糖酵解能力。依托莫西抑制FAO会导致糖酵解率异常升高(图8中的G)，LPS诱导的受损细胞同时表现出基础糖酵解水平和代偿糖酵解能力的增强(图8中的H)。然而，UA在一定程度上对心肌细胞的异常糖酵解率起到了恢复作用(图8中的G-H)。

由此可见，上述研究揭示了天然化合物UA对SACI的重要保护特性。这种作用的基本机制可能是UA能够通过恢复线粒体脂肪酸氧化代谢的平衡来减轻心脏线粒体功能障碍和减少心肌凋亡。CPT1是平衡SACI线粒体脂肪酸代谢的潜在靶点。

重症急性胰腺炎以发生全身炎症反应和多器官功能衰竭为特征，其中，急性心损伤是最严重的远隔器官损伤并导致了急性胰腺炎病人早期死亡。线粒体功能障碍是心肌受损的主要因素之一，然而，线粒体功能障碍介导重症急性胰腺炎相关急性心损伤的机制不清。因此，明确SACI早期急性心损伤的病机，筛选其有效防治靶点，以减少早期器官功能障碍会衰竭的发生、降低SACI病死率是全世界治疗的关键和难点所在。UA在治疗炎症性疾病临床确有疗效，及并影响线粒体代谢，但在SACI的具体疗效及机制不明。本项目的实施有利于探索SACI的有效治疗药物和保护机制，降低早期病死率。本项目选择临床亟待解决、又无特效药物的难题，如果本项目能按照预期方向实施，不仅能科学阐释SACI机制本质，还将有效促进治疗药物开发，以期减轻重症急性胰腺炎带来的全球卫生经济学负担。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。