一种小草海桐的组培快繁方法

技术领域

本发明涉及属于植物繁殖技术领域，具体地，本发明涉及一种小草海桐(Scaevolahainanensis Hance)的组培快繁方法。

背景技术

红树林具有重要的生态意义和巨大的经济价值，但大多数红树林植物对低温敏感。降温、不定期的寒冷或霜冻对其生长和分布有着重要影响，人们一直在努力扩大红树林植物的种植范围，而引种或跨区造林需要大量种苗进行实践。目前，我国的红树林湿地植被恢复多数使用实生苗，不利于保持母树优良性状，往往出现苗木性状分离、品质不一等问题，导致造林成功率低，成林缓慢。因此组织培养繁殖是迅速扩大种苗数量的一种行之有效的技术手段。

小草海桐生于海边盐田或与红树林同生，群落大小一般5m×6m成小片状灌丛分布，与草海桐(Scaevola taccada)相比，具有更紧凑的景观效果和较强的开发应用价值。分子聚类结果表明小草海桐遗传多样性水平极低，作为一种珍稀植物在分子水平上同样面临灭绝的风险，因此急需扩大种苗数量。

发明内容

有鉴于此，本发明提供了一种小草海桐的组培快繁方法，该方法简单易行、对母体伤害少，繁殖周期短、繁殖效率和系数高，为大规模扩繁应用小草海桐从而为更好地红树林湿地生态修复提供技术保障。

本发明采用如下技术方案：

第一方面，

本发明实施例提供了一种小草海桐的组培快繁方法，包括如下步骤：

S1：取小草海桐1年生枝条上的嫩叶，进行清洗、消毒、吸干水分，然后切除叶尖和叶基部，剩余部分再切成面积为0.12-0.15cm

S2：在无菌条件下，将无菌的叶片外植体接种于愈伤组织诱导培养基上培养30-40d，获得愈伤组织；所述愈伤组织诱导培养基为MS培养基添加0.1mg/L 6-BA、0.5-1.2mg/LNAA、30g/L蔗糖、7g/L琼脂，pH为5.8±0.05；

S3：取长势相似生长愈伤组织切成面积为0.5-0.7cm

S4：将带芽的外植体接种于不定芽增殖生长培养基上培养30-35d，获得伸长生长的不定芽；所述不定芽增殖生长培养基为MS培养基添加0.5mg/L 6-BA或1mg/L KT、30g/L蔗糖、7g/L琼脂，pH为5.8±0.05；

S5：将不定芽接种于上述的生根诱导培养基上培养生根30-35d，获得小草海桐组培苗；所述生根诱导培养基为MS培养基添加0.5-1.5mg/L IAA或0.5-2.0mg/L IBA、30g/L蔗糖、7g/L琼脂，pH为5.8±0.05；

S6：取出带3-4条再生根的小草海桐组培苗，用自来水洗净根部残留培养基，移栽于装有炼苗移栽基质的育苗盆中；炼苗移栽基质为体积比为3:1的泥炭土:珍珠岩；

S7：移栽好小草海桐组培苗后，浇足定根水，之后覆盖透明薄膜并在室内培养7d；然后移动到室外继续覆膜保湿培养20d，期间早晚各掀开一次薄膜降低湿度(每次半小时，每次掀开后用清水喷洒叶面)；最后掀开薄膜早晚喷洒一次清水并保证育苗盆内水量没过育苗盆基部。

优选地，步骤S1中，清洗、消毒、吸干水分的具体步骤为：用超纯水洗净1min，在超净工作台用75％乙醇浸没消毒后，用10％NaClO溶液灭菌5-10min(更优选为5min)，灭菌时加入2滴吐温-20，再无菌水清洗4次，在无菌切割纸上晾干叶片表面水分。

优选地，所述愈伤组织诱导培养基为MS培养基添加0.1mg/L 6-BA、0.5mg/L NAA、30g/L蔗糖、7g/L琼脂，pH为5.8±0.05。

优选地，所述生根诱导培养基为MS培养基添加0.5mg/L IAA或1.5mg/L IBA、30g/L蔗糖、7g/L琼脂，pH为5.8±0.05。

优选地，步骤S6中，炼苗移栽基质混合前在高压蒸汽锅内80℃消毒杀菌1h。

优选地，步骤S1-S7室内的培养条件为：温度设置为25±1℃，光强1500±10lux，光周期12h/12h(光/暗)，空气湿度50±5％。

第二方面，

本发明实施例还提供了一种小草海桐的组培快繁方法，包括如下步骤：

1)取小草海桐1年生枝条上的嫩叶，进行清洗、消毒、吸干水分，然后切除叶尖和叶基部，剩余部分再切成面积为0.12-0.15cm

2)将无菌的叶片外植体接种于叶片直接诱导再生芽培养基上培养40-45d，获得再生芽；所述叶片直接诱导再生芽培养基为MS培养基添加0.5-2.0mg/L 6-BA、30g/L蔗糖、7g/L琼脂，pH为5.8±0.05；

3)将再生芽叶片外植体接种于再生芽诱导不定芽培养基上培养40-45d，获得更多的不定芽；所述再生芽诱导不定芽培养基为MS培养基添加0.5-1.5mg/L 6-BA、30g/L蔗糖、7g/L琼脂，pH为5.8±0.05；

4)将步骤2)的再生芽或步骤3)的不定芽接种于生根诱导培养基上培养生根30-35d，获得小草海桐组培苗；所述生根诱导培养基为MS培养基添加0.5-1.5mg/L IAA或0.5-2.0mg/L IBA、30g/L蔗糖、7g/L琼脂，pH为5.8±0.05；

5)取出带3-4条再生根的小草海桐组培苗，用自来水洗净根部残留培养基，移栽于装有炼苗移栽基质的育苗盆中；炼苗移栽基质为体积比为3:1的泥炭土:珍珠岩；

6)移栽好小草海桐组培苗后，浇足定根水，之后覆盖透明薄膜并在室内培养7d；然后移动到室外继续覆膜保湿培养20d，期间早晚各掀开一次薄膜降低湿度(每次半小时，每次掀开后用清水喷洒叶面)；最后掀开薄膜早晚喷洒一次清水并保证育苗盆内水量没过育苗盆基部。

优选地，步骤1)中，清洗、消毒、吸干水分的具体步骤为：用超纯水洗净1min，在超净工作台用75％乙醇浸没消毒后，用10％NaClO溶液灭菌5-10min(更优选为5min)，灭菌时加入2滴吐温-20，再无菌水清洗4次，在无菌切割纸上晾干叶片表面水分。

优选地，所述叶片直接诱导再生芽培养基为MS培养基添加1.5mg/L 6-BA、30g/L蔗糖、7g/L琼脂，pH为5.8±0.05。

优选地，所述生根诱导培养基为MS培养基添加0.5mg/L IAA或1.5mg/L IBA、30g/L蔗糖、7g/L琼脂，pH为5.8±0.05。

优选地，步骤5)中，炼苗移栽基质混合前在高压蒸汽锅内80℃消毒杀菌1h。

优选地，步骤1)-6)室内的培养条件为：温度设置为25±1℃，光强1500±10lux，光周期12h/12h(光/暗)，空气湿度50±5％。

本发明所具有的有益效果：

(1)本发明首次发现了小草海桐叶片既可以成功诱导愈伤组织，亦可直接诱导形成再生芽，并建立了小草海桐愈伤组织与再生芽途径的组织培养快繁体系，明显提高了繁殖速度、提升了繁殖系数和缩短了繁殖周期，能在短期内提供大量与母本性状一致的优良种苗，且还具有能够保持母本优良性状、简单易行、对母体伤害少等优点，解决了现有技术中扦插繁殖和种子繁殖的繁殖率低、受时间周期限制以及环境限制等问题，填补了小草海桐在组织培养快繁技术方面的空白。

(2)本发明提供的小草海桐的组培快繁方法，以叶片作为外植体，相比于以茎段等其他部位作为外植体，对母体伤害少，且叶片更幼嫩，材料更多，为大规模扩繁应用濒危红树植物资源小草海桐提供技术保障。

附图说明：

图1小草海桐叶片切割图。

图2不同浓度植物生长调节剂诱导小草海桐不定芽增殖35d后生长状况图其中：a：添加0.5mg/L 6-BA、KT、TDZ的培养基和无激素的培养基诱导芽增殖情况；b：添加0.5、1.0、1.5和2.0mg/L 6-BA的培养基诱导芽增殖情况；c：添加不同浓度6-BA和KT的培养基诱导芽增殖情况；d：0.5mg/L 6-BA下添加0.1mg/L NAA、IAA、IBA的培养基和无生长素的培养基诱导芽增殖情况。标尺＝1cm。

图3不同浓度激素诱导叶片外植体分化再生芽45d后生长状况图；

图4不同浓度生长素诱导小草海桐分化不定根35d后生长状况图；

其中：a：不添加激素的MS培养基；b：添加0.5mg/L NAA；c：添加0.5mg/L IAA；d：添加2.0mg/L IBA。标尺＝1cm。

具体实施方式

下面详细描述本发明的实施例，下面描述的实施例是示例性的，旨在用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。

下面实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下面实施例中所使用的材料、试剂、装置等，如无特殊说明，均可从商业途径或按照公开文献的方法制备得到。

实施例1小草海桐无菌体系的建立

取小草海桐1年生枝条上的嫩叶，用超纯水洗净1min，在超净工作台用75％乙醇浸没消毒后，用2％、5％和10％NaClO(w:v)溶液分别灭菌5min、10min和15min，灭菌时加入2滴吐温-20，再无菌水清洗4次后备用。在无菌切割纸上晾干叶片表面水分，然后切除叶尖和叶基，剩余部分再切成面积为0.12-0.15cm

污染率(％)＝污染外植体个数/接种外植体个数×100％

褐化率(％)＝褐化外植体个数/接种外植体个数×100％

结果表明：随着NaClO溶液浓度和灭菌时间增加，小草海桐叶片外植体污染率显著下降(表1)。以2％-10％NaClO分别灭菌5-15min后，发现10％NaClO灭菌10min使污染率达到最小，但在此浓度内灭菌不同时间并无显著差异。为尽量降低NaClO对外植体的伤害，10％NaClO灭菌5min效果最好(外植体污染率和褐化率降至13.33％和0.00％)。

表1不同NaClO溶液浓度和灭菌时间对小草海桐叶片外植体灭菌效果的影响

注：数据为平均值±标准误，同列不同字母表示在P＜0.05水平上差异显著。15个外植体为一个重复，重复3次。

实施例2不同激素配比对小草海桐叶片诱导愈伤组织的影响

无菌叶片外植体接种于无激素添加的培养基(CK)、添加了6-BA(0、0.1、0.3、0.5、1.0mg/L)+NAA(0.5、1.2mg/L)和6-BA(0.1mg/L)+IAA、IBA、2,4-D(0.5mg/L)的培养基(MS培养基添加30g/L蔗糖、7g/L琼脂，pH为5.8±0.05)中。接种35d后记录愈伤诱导率、死亡率、外植体鲜重和出根率：

愈伤诱导率(％)＝出愈外植体个数/接种外植体个数×100％

死亡率(％)＝死亡外植体个数/接种外植体个数×100％

鲜重(mg/植)＝出愈后外植体重量-接种时外植体重量

出根率(％)＝出根外植体个数/接种外植体个数×100％

结果表明：除0.5mg/L NAA、1.2mg/L NAA和0.5mg/L IAA+0.1mg/L 6-BA外，其他激素处理都使外植体愈伤诱导率达到100.00％，所有处理的诱导率都在90.00％以上(表2)。不添加NAA的处理都出现外植体死亡，其中无激素处理死亡率最大(达83.34％)，而在添加了0.1mg/L 6-BA的情况下，再添加0.5mg/L的IAA、IBA、2,4-D和NAA可使死亡率逐渐下降(分别下降至44.45％、36.11％、27.78％和0.00％)。培养基仅添加NAA会使外植体生根，添加0.5mg/L和1.2mg/L NAA后生根率分别达61.11％和72.22％。与单独添加0.5mg/L和1.2mg/LNAA相比，添加0.1-1.0mg/L 6-BA显著增加了愈伤组织的鲜重，其中0.5mg/L NAA+0.1mg/L6-BA最有利于外植体鲜重增加(达62.13mg)，但不同浓度的NAA和6-BA配合使用对外植体鲜重并无显著促进作用。在0.1mg/L 6-BA下添加0.5mg/L不同种类生长素时，NAA对鲜重增加促进作用最强，2,4-D最弱。0.5mg/LIAA+0.1mg/L 6-BA、0.5mg/L IBA+0.1mg/L 6-BA和0.5mg/L 2,4-D+0.1mg/L6-BA使外植体出现死亡，且0.5mg/LIAA+0.1mg/L6-BA和0.5mg/LIBA+0.1mg/L 6-BA诱导的愈伤组织呈白色，0.5mg/L 2,4-D+0.1mg/L 6-BA诱导的则呈浅黄色，而0.5mg/L NAA+0.1mg/L6-BA诱导的愈伤组织呈浅绿色且紧密。因此0.5mg/L NAA+0.1mg/L 6-BA处理最适宜诱导的愈伤组织来进行小草海桐不定芽的诱导。

表2不同浓度生长素配合6-BA对小草海桐叶片外植体诱导愈伤组织的效果

注：数据为平均值±标准误，同列不同字母表示在P＜0.05水平上差异显著。愈伤诱导率、死亡率和出根率均以12个外植体作为一个重复，重复3次；鲜重以一个外植体测量值作为一个重复，重复8次。“-”表示未测量。

实施例3不同激素配比对小草海桐愈伤组织诱导不定芽的影响

取长势相似生长40d的愈伤组织外植体切成面积为0.5-0.7cm

出芽率(％)＝出芽外植体个数/接种外植体个数×100％

出芽数(个/植)＝总出芽数/接种外植体数

死亡率(％)＝死亡外植体个数/接种外植体个数×100％

结果表明：由表3可知，不添加激素或添加TDZ均无法诱导愈伤组织分化出不定芽，对比无激素处理，KT和6-BA可显著促进不定芽分化，但出芽率和平均出芽数较小。其中6-BA诱导不生芽分化效果最好，出芽率在42.00％，且无死亡。

表3 0.5mg/L TDZ、KT和6-BA对小草海桐愈伤组织分化不定芽的影响

注：数据为平均值±标准误，同列不同字母表示在P＜0.05水平上差异显著。12个外植体作为一个重复，重复3次。

实施例4不同激素配比对小草海桐不定芽增殖和生长的影响

带芽外植体接种于添加了不同浓度TDZ、KT、6-BA和NAA的培养基(MS培养基添加30g/L蔗糖、7g/L琼脂，pH为5.8±0.05)中，35d后统计总增殖系数和大芽占比：

增殖系数＝增殖芽数/外植体分化前芽数

大芽占比(％)＝增殖后总大芽数/增殖后总芽数×100％

结果表明：比较CK和添加了0.5mg/L TDZ、KT和6-BA的培养基对丛生芽增殖的影响，发现0.5mg/L 6-BA和0.5mg/L TDZ对芽增殖效果分别达到最佳和最差，大芽占比最大值出现在0.5mg/L KT(表4)。单独添加0.5-2.0mg/L的6-BA时，浓度越大越不利于芽增殖，增殖系数和大芽占比皆随浓度增大而减小，且1.5mg/L以上浓度不但使6-BA对芽增殖的效果低于CK，且会使得已有芽枯黄死亡(表4)。当总浓度不变(1.0mg/L)时，1.0mg/L 6-BA、0.6mg/L6-BA+0.4mg/L KT、0.5mg/L 6-BA+0.5mg/L KT和1.0mg/L KT四个处理中，增殖系数和大芽占比的最大值皆出现在1.0mg/L KT，而最小值却分别出现在1.0mg/L 6-BA和0.6mg/L 6-BA+0.4mg/L KT(表4)，其中KT浓度越高越有利于芽长大。0.5mg/L 6-BA和0.1mg/L NAA、IAA和IBA配合使用时，IAA的添加最有利于提高增殖系数，但最不利于提高大芽占比，同时与单独添加6-BA相比较，三种生长素都对芽增殖产生抑制作用，外植体产生的芽点数量皆少于0.5mg/L 6-BA。在所有处理中，单独添加0.5mg/L 6-BA使增殖系数达到最大(3.57)，但芽多数较小，0.5mg/L KT使大芽占比值达到最大，而1.0mg/L KT却能使其在增值系数较大的情况下，芽生长也更好(图2)。

表4不同浓度植物生长调节剂对小草海桐丛生芽增殖的影响

注：数据为平均值±标准误，同列不同字母表示在P＜0.05水平上差异显著。每个处理重复3次，每个重复9个外植体。

实施例5不同激素配比对小草海桐叶片直接诱导再生芽的影响

灭菌后叶片外植体接种于添加了0.5mg/L TDZ、KT和6-BA以及6-BA(0.5、1.0、1.5、2.0mg/L)+NAA(0、0.05、0.1、0.5、1.0mg/L)的培养基(MS培养基添加30g/L蔗糖、7g/L琼脂，pH为5.8±0.05)中，45d后统计出芽率、出芽数和大芽数：

出芽率(％)＝出芽外植体个数/接种外植体个数×100％

出芽数(个/植)＝总出芽数/接种外植体数

大芽数(个/植)＝分化后总大芽数/接种外植体数×100％

结果表明：6-BA对小草海桐再生芽分化影响显著。同一浓度下(0.5mg/L)，TDZ无法诱导芽分化，而6-BA处理下出芽率、出芽数和大芽数显著大于KT。与6-BA+NAA相比，单独使用6-BA显著提高了外植体分化芽的效果(表5)。在4种相同浓度6-BA下添加0.05-1.0mg/LNAA均逐渐降低了外植体出芽率、出芽数和大芽数。其中0.5-1.0mg/LNAA使出芽率下降至50％以下，出芽数下降至0.3个以下，大芽数下降至0个以下。当6-BA和NAA配合使用时，只有在0.5mg/L 6-BA下添加低浓度NAA(0.05-0.1mg/L)时，出芽率和出芽数才显著大于单独添加同浓度6-BA的处理，但大芽数显著少于后者。6-BA浓度增大时，出芽率和出芽数呈现先增加后降低的趋势，但大芽数表现出逐渐下降的趋势，其中1.5mg/L 6-BA处理后出现最大出芽率和出芽数(大于此实验所有处理)。外植体仅在单独添加0.5mg/L KT、0.5mg/L 6-BA和1.0mg/L 6-BA时出现死亡，但死亡率较低(最大死亡率低于17.00％)。从图3得知单独添加6-BA虽利于小草海桐叶片外植体分化再生芽，但不利于其产生愈伤组织。同一浓度6-BA下，添加0.5mg/L以上浓度NAA会使外植体变黄且趋于死亡。总结而言，0.5-2.0mg/L 6-BA诱导效果显著(出芽率和出芽数都在70.00％和1.50个以上)，其中1.5mg/L 6-BA使出芽率和出芽数达到最大(88.89％，3.61个)。

表5不同浓度激素对诱导小草海桐叶片分化再生芽的影响

注：数据为平均值±标准误，同列不同字母表示在P＜0.05水平上差异显著。每个重复12个外植体，重复3次。

实施例6不同激素配比对小草海桐再生芽叶片诱导不定芽的影响

将再生芽叶片外植体接种于添加了不同浓度6-BA的培养基(MS培养基添加30g/L蔗糖、7g/L琼脂，pH为5.8±0.05)中，45d后统计出芽率、出芽数、大芽数、死亡率等。

出芽率(％)＝出芽外植体个数/接种外植体个数×100％

出芽数(个/植)＝总出芽数/接种外植体数

大芽数(个/植)＝分化后总大芽数/接种外植体数×100％

与CK相比，6-BA可显著诱导小草海桐再生芽叶片外植体分化不定芽，提高了再生芽叶片的出芽率、出芽数和大芽数(表6)。其中出芽率和大芽数最大值出现在0.5mg/L 6-BA(分别达60.42％和0.25个)，并随6-BA浓度的增加而逐渐降低，出芽数最大值则出现在1.5mg/L 6-BA(达1.23个)。最大死亡率出现在添加0.5mg/L 6-BA的处理中，但不超过15％。

表6不同浓度6-BA对小草海桐再生芽叶片诱导不定芽的影响

注：数据为平均值±标准误，同列不同字母表示在P＜0.05水平上差异显著。每个处理重复4次，12个外植体作为一个重复。

实施例7不同激素配比对小草海桐不定芽诱导不定根的影响

将长出5-7片真叶的不定芽接种于未添加激素的MS(MS培养基添加30g/L蔗糖、7g/L琼脂，pH为5.8±0.05)和1/2MS(营养元素全部减半，(1/2MS培养基添加30g/L蔗糖、7g/L琼脂，pH为5.8±0.05))培养基中，以及添加了0.5、1.0、1.5和2.0mg/L NAA、IAA和IBA的培养基(MS培养基添加30g/L蔗糖、7g/L琼脂，pH为5.8±0.05)中，35d后统计生根率和生根系数：

生根率(％)＝生根外植体个数/接种外植体个数×100％

生根系数＝总生根数/生根再生芽数

结果表明：与MS相比，1/2MS明显降低了不定芽的生根率和生根系数(表7)。在MS培养基的基础上添加NAA、IAA和IBA，发现与无激素的MS培养基相比，NAA处理使生根系数明显增大，但降低了生根率，其中1.0mg/L NAA使生根率和生根系数分别降低和提高至最小和最大值。与MS培养基相比，添加IAA和IBA显著提高了生根系数，但生根率无显著上升，2.0mg/LIAA甚至显著降低了生根率(降低了19.35％)。在IAA处理中，0.5mg/L的IAA使生根率和生根系数达到最大值。而在IBA处理中，生根率最大值出现在1.0mg/L IBA，生根系数最大值出现在1.5mg/L IBA。所有处理中，0.5mg/LIAA和1.5mg/L IBA分别使生根率和生根系数达到了最大值。尽管NAA可显著提高生根系数，但长出的不定根粗短且易脱落(图4中b)。与MS相比，添加IAA和IBA可显著促进不定根正常生长(图4中a、c和d)。

表7不同浓度生长素对小草海桐不定根诱导的影响

注：数据为平均值±标准误，同列不同字母表示在P＜0.05水平上差异显著。生根率：12个再生植株为一个重复，重复3次。1/2MS培养基中所有营养元素质量减半。未作说明的基础培养基皆为MS培养基。

实施例8再生苗的炼化与移栽

把长势相似、拥有3-4条再生根的再生植株从培养基中小心取出(勿伤到根)，用自来水洗净根部残留培养基后移栽于装有基质的黑色育苗袋中。基质配比如下(v:v)：(1)河沙:泥炭土:田园土＝1:1:1；(2)田园土:泥炭土＝1:1；(3)泥炭土:珍珠岩＝3:1。基质混合前在高压蒸汽锅内80℃消毒杀菌1h。育苗袋放置于育苗盆后，浇足定根水，之后覆盖透明薄膜并在室内培养7d。然后移动到室外继续覆膜保湿培养20d，期间早晚各掀开一次薄膜降低湿度(每次半小时，每次掀开后用清水喷洒叶面)。最后掀开薄膜早晚喷洒一次清水并保证育苗盆内水量没过育苗袋基部即可。移栽30d后统计成活率：

成活率(％)＝成活植株数/移栽植株数×100％

结果表明：用河沙:泥炭土:田园土＝1:1:1(T1)、田园土:泥炭土＝1:1(T2)和泥炭土:珍珠岩＝3:1(T3)培养小草海桐再生苗成活率都在65％以上(表8)，但与T1相比，T2和T3使成活率显著提高(分别提高20.00％和24.01％)，其中T3使成活率达到最大(86.11％)。

表8不同基质对小草海桐再生植株移栽后成活的影响

注：数据为平均值±标准误，同列不同字母表示在P＜0.05水平上差异显著。每个处理重复3次，每个重复12个再生植株。

实施例9

基于上述实验验证，获得了一种叶片外植体成功诱导愈伤组织，进而进行小草海桐组织培养的快繁方法，具体步骤为：

S1：取小草海桐1年生枝条上的嫩叶，用超纯水洗净1min，在超净工作台用75％乙醇浸没消毒后，用10％NaClO溶液灭菌5min，灭菌时加入2滴吐温-20，再无菌水清洗4次，在无菌切割纸上晾干叶片表面水分，然后切除叶尖和叶基部，剩余部分再切成面积为0.12-0.15cm

S2：在无菌条件下，将无菌的叶片外植体接种于愈伤组织诱导培养基上培养40d，获得愈伤组织；所述愈伤组织诱导培养基为MS培养基添加0.1mg/L 6-BA、0.5mg/L NAA、30g/L蔗糖、7g/L琼脂，pH为5.8±0.05；

S3：取长势相似生长愈伤组织切成面积为0.5-0.7cm

S4：将带芽的外植体接种于不定芽增殖生长培养基上培养35d，获得伸长生长的不定芽；所述不定芽增殖生长培养基为MS培养基添加0.5mg/L 6-BA、30g/L蔗糖、7g/L琼脂，pH为5.8±0.05；

S5：将不定芽接种于上述的生根诱导培养基上培养生根35d，获得小草海桐组培苗；所述生根诱导培养基为MS培养基添加0.5mg/L IAA、30g/L蔗糖、7g/L琼脂，pH为5.8±0.05；

S6：取出带3-4条再生根的小草海桐组培苗，用自来水洗净根部残留培养基，移栽于装有炼苗移栽基质的育苗盆中；炼苗移栽基质为体积比为3:1的泥炭土:珍珠岩；

S7：移栽好小草海桐组培苗后，浇足定根水，之后覆盖透明薄膜并在室内培养7d；然后移动到室外继续覆膜保湿培养20d，期间早晚各掀开一次薄膜降低湿度，每次半小时，每次掀开后用清水喷洒叶面；最后掀开薄膜早晚喷洒一次清水并保证育苗盆内水量没过育苗盆基部。

步骤S1-S7室内的培养条件为：温度设置为25±1℃，光强1500±10lux，光周期12h/12h(光/暗)，空气湿度50±5％。

实施例10

基于上述实验验证，获得了一种小草海桐叶片外植体直接诱导形成再生芽的组织培养快繁方法，包括如下步骤：

1)取小草海桐1年生枝条上的嫩叶，用超纯水洗净1min，在超净工作台用75％乙醇浸没消毒后，用10％NaClO溶液灭菌5min，灭菌时加入2滴吐温-20，再无菌水清洗4次，在无菌切割纸上晾干叶片表面水分，然后切除叶尖和叶基部，剩余部分再切成面积为0.12-0.15cm

2)将无菌的叶片外植体接种于叶片直接诱导再生芽培养基上培养45d，获得再生芽；所述叶片直接诱导再生芽培养基为MS培养基添加1.5mg/L 6-BA、30g/L蔗糖、7g/L琼脂，pH为5.8±0.05；

3)将再生芽叶片外植体接种于再生芽诱导不定芽培养基上培养45d，获得更多的不定芽；所述再生芽诱导不定芽培养基为MS培养基添加0.5-1.5mg/L 6-BA、30g/L蔗糖、7g/L琼脂，pH为5.8±0.05；

4)将步骤2)的再生芽或步骤3)的不定芽接种于生根诱导培养基上培养生根35d，获得小草海桐组培苗；所述生根诱导培养基为MS培养基添加1.5mg/L IBA、30g/L蔗糖、7g/L琼脂，pH为5.8±0.05；

5)取出带3-4条再生根的小草海桐组培苗，用自来水洗净根部残留培养基，移栽于装有炼苗移栽基质的育苗盆中；炼苗移栽基质为体积比为3:1的泥炭土:珍珠岩；

6)移栽好小草海桐组培苗后，浇足定根水，之后覆盖透明薄膜并在室内培养7d；然后移动到室外继续覆膜保湿培养20d，期间早晚各掀开一次薄膜降低湿度(每次半小时，每次掀开后用清水喷洒叶面)；最后掀开薄膜早晚喷洒一次清水并保证育苗盆内水量没过育苗盆基部。

步骤1)-6)室内的培养条件为：温度设置为25±1℃，光强1500±10lux，光周期12h/12h(光/暗)，空气湿度50±5％。

尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。