一种耐受低盐的单环刺螠新品系育种方法

技术领域

本发明属于水产遗传育种领域，具体涉及一种耐受低盐的单环刺螠新品系育种方法。

背景技术

单环刺螠(Urechis unicinctus)是一种生活在潮间带U型洞穴的一种环节动物，主要分布于俄罗斯、朝鲜、日本以及中国的黄、渤海沿岸。单环刺螠含有丰富的人体必需氨基酸、糖胺聚糖和不饱和脂肪酸，具有很高的营养价值。此外还具有抗氧化、溶解血栓、体外抗肿瘤效果的多肽、纤溶酶、大分子蛋白质等活性物质，具有潜在的药用价值。单环刺螠被农业农村部评为2022年十大水产优异种质资源，产业开发前景广阔。近年来由于单环刺螠野生资源的过度捕捞，导致其产量急剧下降，市场价格大幅提高，最高可达200元/公斤，供需矛盾日益突出。另一方面，目前单环刺螠人工育苗和养殖处于快速发展阶段，其主要的育苗方式为采捕野生群体作为亲本进行繁育，尚未经过遗传改良。良种选育是决定单环刺螠养殖业持续、快速发展的重要关键之一，通过人工定向选育培育出抗逆性强的优良品种可增强单环刺螠抵抗环境胁迫能力，提高养殖成活率。

盐度是海洋生物生存条件中重要的环境因子之一，影响海洋生物的生长发育、能量代谢、渗透调节、免疫防御等多种生物学过程，甚至有研究发现盐度可以影响海洋生物的风味和肉质。与具有相对稳定盐度的深远海不同，潮间带、河口和陆基海水池塘等环境在受到潮汐、降雨、高温干旱或人类活动等因素影响的情况下会严重增加盐度波动的频率，导致海水盐度发生变化进而对海洋生物造成不同程度的损害。另一方面，据统计我国存在3067公顷的内陆低盐水域，一些低盐水已被用于水产养殖，但其中大部分长期处于贫瘠状态。目前中国的低盐水域养殖物种以凡纳滨对虾为主，存在可养殖品种单一、水域利用率低等问题。开发新型高值养殖品种对于利用我国广阔的低盐水域资源具有重要意义。单环刺螠经济价值高，盐度耐受范围广，是极具有低盐水域养殖开发前景的水产经济物种。通过数量遗传学手段和家系选育方法来培育低盐耐受能力强且生长速度快的单环刺螠优良新品系，对提升单环刺螠人工养殖产量，拓展单环刺螠养殖空间，高效利用低盐水域资源，最终助力单环刺螠人工养殖产业发展具有重要意义。

发明内容

本发明的目的是针对目前单环刺螠养殖产业中没有耐低盐新品种的现状，提供一种耐受低盐的单环刺螠新品系育种方法。通过该方法能够培育出生长性状优良、抗低盐能力强的单环刺螠新品系，为单环刺螠产业快速稳定可持续发展奠定了坚实的基础。

为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种耐受低盐的单环刺螠新品系育种方法，其特征在于它的方法步骤是：

1)家系建立及培育：收集自然海域中性腺发育成熟的野生单环刺螠群体作为繁育亲本，挑选体重在120g-150g之间(大于平均体重15-20％的个体)的活力旺盛且肾管饱满的单环刺螠成体，采用巢氏交配设计方法，按照一雄配三雌的原则建立单环刺螠F1代全同胞家系。按照工厂化苗种培育模式对F1代全同胞家系进行后续培养；

2)低盐胁迫半致死条件计算：F1代苗种培育至200日龄后，设置低盐度梯度实验组为7.5‰、10‰、12.5‰、15‰，采用急性攻毒实验探究单环刺螠低盐胁迫条件下的72h半致死盐度值。半致死盐度胁迫探究实验共设置四个低盐度梯度实验组和一个正常海水对照组(32‰)，每个组别均设置三个平行。持续攻毒至所有个体死亡，期间每隔8h记录一次虫体死亡情况，利用线性回归法通过各盐度梯度下第72h的存活率计算半致死盐度；

3)低盐度胁迫：利用探究得到的72h半致死低盐度海水进行养殖胁迫。每个家系内随机选取虫体60只，称量体重后置于独立的培养箱内进行盐度胁迫，培养箱内部均用微型隔离板隔离以确保每个虫体在一个区域内。将所有培养箱放置在一个培养池内并利用半致死低盐度海水进行统一培养，持续胁迫至所有个体死亡，统计每个个体的存活时间；

4)盐度耐受性及体重育种值确定：利用低盐胁迫条件下个体的存活时间确定耐盐性状遗传力，根据耐盐性状遗传力估算个体低盐度耐受性育种值和家系低盐度耐受性平均育种值。利用参与胁迫条件的个体体重数值确定体重性状遗传力，根据体重性状遗传力估算个体体重育种值和家系体重平均育种值。育种值为利用BLUP法(最佳线性无偏估计法)进行估计。根据低盐胁迫存活时间以及体重参数估算性状之间的遗传和表型相关性。

建立低盐胁迫耐受遗传参数估计模型：y

其中y

上述动物模型的遗传力计算公式如下：

其中，

同时，各性状间的遗传和表型相关性(r

在计算遗传相关时，σ

5)F1代亲本留种：将各家系的低盐度耐受性平均育种值与体重平均育种值按照1:1的比例进行加权得到低盐胁迫条件下所有家系的综合育种值。利用综合育种值进行排序，保留排名在前5名内的家系作为低盐繁育候选家系。将选择出的家系按照3-5％的留种率继续养殖到成体；

6)F2代家系构建及继代选择：将F1代留种低盐繁育候选家系养殖至性腺成熟时期，从中筛选出体重位于前15-20％且活力旺盛的健壮单环刺螠个体进行相同家系来源和不同家系来源的配对繁育构建F2代家系，近交系数控制在0.1以内。之后以低盐耐受能力强、体重性状优良为选育指标对F2代家系开展4-5代的连续选择，在最终获得的家系中选择亲缘关系远、个体大且体色粉红的健康单环刺螠雌雄个体作为优良品系进行产业化推广应用。

优选地，步骤1)中的自然海域野生单环刺螠群体为秦皇岛海域野生群体，经人工捕捞后低温运输至繁育基地进行选择。家系苗种培育过程为利用体外授精技术进行配对，将亲本解剖取肾管于干燥洁净的解剖盘内，待全部亲本解剖完毕后将肾管剪碎并用海水稀释，泼洒至孵化箱内进行受精孵化。家系苗种培育为首先将孵化箱内的受精卵孵化并培育至转为变态底栖生活前期，约25日龄(18-19.5℃)。之后，在即将发育至变态底栖生活前将其转移至养殖池特定区域内进行养殖直至出苗大小，约100日龄(18-20℃)。最后，将各家系幼虫过滤取出后转移至室外池塘继续培养至200日龄(19-23℃)。为避免家系之间混杂，孵化箱孵化过程为独立箱体养殖，养殖池养殖过程为利用100目筛绢将各家系区域进行隔离，室外池塘养殖过程为利用20目筛绢将各家系区域进行隔离。另外，每次进行不同养殖环境的家系个体转移时，均将所有家系的养殖密度控制在同一水平。整个培养过程均采取两次投喂/天、一次换水/天、一次吸底/3天的基本方法培养，过程中根据具体情况进行适当调整.

优选地，步骤2)中低盐胁迫半致死条件筛选过程为在所有家系内随机选择个体开展梯度胁迫实验。实验海水为将淡水掺入养殖海水获得，每个盐度梯度均设置三个平行，每个平行下均至少有10只虫体参与胁迫过程，探究过程中每8h观察一次并及时捞出死亡个体。探究得到的72h半致死低盐度为10‰。

优选地，步骤3)中对于低盐胁迫条件，将低盐胁迫实验组和对照组置于一个单独的培养池内进行处理，保证温度等实验条件的一致性。期间每4h观察一次存活情况并及时捞出死亡个体，每天进行一次少量投喂以及一次换水操作。投喂时根据虫体存活数量以及活力状态进行微调，换水时选择10‰盐度的海水进行更换(对照组选择32‰盐度的自然海水)，换水量为养殖箱体积一半。

优选地，步骤4)中低盐耐受性状和体重性状的遗传参数估计均通过ASReml软件实现。

优选地，步骤5)中F1代亲本留种为将低盐胁迫条件下计算得到的各家系的平均抗盐性状与体重性状的育种值按照1:1比例进行加权得到综合育种值并利用其进行排序，保留排名在前5名内的家系作为低盐繁育候选家系。之后将选择出的家系按照3-5％的留种率留种。

优选地，步骤6)中的F2代家系及继代选择中的家系繁育方法同F1代构建操作方法一致。家系构建中亲本为F1代留种个体进行相同家系来源和不同家系来源的配对繁育，近交系数控制在0.1以内。继代选择中以低盐耐受能力强、体重性状优良为选育指标对传代家系进行连续选择。

综上所述，本发明选用野生单环刺螠群体为基础群体，通过低盐耐受选育筛选出具有较大遗传改良空间和选育潜力的家系。对表现优良的家系进行留种扩繁得到生长性状优良、盐度耐受能力强的新品系。该育种方法简单实用，可操作性强，经过多代选育，可培育出低盐耐受性状优良的单环刺螠良种。

附图说明

图1为不同低盐度胁迫条件下单环刺螠生存曲线

图2为不同低盐度胁迫条件下单环刺螠第72h的存活曲线

图3为72h半致死低盐度胁迫条件下单环刺螠不同体重个体的存活时间分布散点图

图4为72h半致死低盐度胁迫条件下单环刺螠父系半同胞家系的体重和存活时间

图5为72h半致死低盐度胁迫条件下单环刺螠母系全同胞家系的体重和存活时间

具体实施方式

为了更加清楚的解释本发明的目的和技术方案细节，下面结合附图说明及具体实施例对本发明的技术方案进行详细叙述：

1.家系建立及培育

收集秦皇岛海域野生单环刺螠成熟亲本，选取生理状况良好，肾管丰富的个体低温运输到青岛大螠海创生物科技有限公司作为基础育种群体。在基础育种群体中挑选体重介于120g-150g之间即大于平均体重15-20％的个体进行体外授精传代，采用巢氏交配设计建立单环刺螠全同胞家系24个(8头♂×24头♀)。体外授精过程为：首先将亲本按照雌雄分类进行12h养殖海水环境下的恢复性培养，亲本活力恢复后将全部亲本解剖，将解剖取得的肾管剪碎置于50ml离心管内并用海水稀释后泼洒至孵化箱(长×宽×高：60cm×50cm×35cm)内进行受精孵化。授精时保证孵化箱内卵细胞的密度为8-10个/ml且每个卵细胞周围精子数量约为5-8个。家系培育过程为：将孵化箱内的受精卵孵化并培育至转为变态底栖生活前期，约25日龄(18-19.5℃)。在即将发育至变态底栖生活前将其转移至养殖池特定区域内进行养殖直至出苗大小，约100日龄(18-20℃)。达到出苗大小后将各家系幼虫过滤取出后转移至室外池塘继续培养至200日龄(19-23℃)。孵化箱孵化过程为独立箱体养殖，养殖池养殖过程为利用100目筛绢将各家系区域进行隔离，室外池塘养殖过程为利用20目筛绢将各家系区域进行隔离。另外，每次进行不同养殖环境的家系个体转移时，均将所有家系的养殖密度控制在同一水平。整个培养过程均采取两次投喂/天、一次换水/天、一次吸底/3天的基本方法培养，过程中根据具体情况进行适当调整。由于养殖过程中的环境突变以及人工操作等问题，导致损失3个全同胞家系，共20个家系参与后续盐度胁迫。

2.低盐胁迫半致死条件计算

室外池塘将F1代苗种培育至200日龄后，采用急性低盐胁迫实验探究单环刺螠在低盐胁迫条件下的72h半致死盐度值。设置四个低盐度梯度实验组(7.5‰、10‰、12.5‰、15‰，实验海水为将淡水掺入养殖海水获得)和一个正常海水对照组(32‰)，每个组别均设置三个平行，每个平行均随机选取10只虫体参与胁迫，半致死盐度胁迫探究实验在培育车间的养殖池内进行(17-19℃)。持续攻毒至120h，期间每隔8h记录一次虫体死亡情况，统计虫体在每个盐度梯度下不同时间节点的存活率(图1)。利用线性回归法通过各盐度梯度下第72h的存活率计算半致死盐度存活曲线方程(图2)，通过趋势线方程计算得到单环刺螠低盐度胁迫条件下第72h的半致死盐度值为10‰。

3.低盐度胁迫

随机选取每个家系内虫体60只，称量体重后置于独立的培养箱(长×宽×高：60cm×50cm×35cm)内进行盐度胁迫探究，培养箱内部均用微型隔离板隔离，确保每个虫体在一个区域内。利用探究得到的72h半致死低盐度海水进行胁迫，将全部20个培养箱放置在一个培养池内进行培养(17-19℃)，持续胁迫至所有个体死亡，期间每隔4h观察一次，统计每个个体的存活时间。整个胁迫过程中每天进行一次少量投喂(投喂时根据虫体存活数量以及活力状态进行微调)以及一次换水操作(换水量为养殖箱体积一半，低盐实验组更换10‰盐度海水，对照组更换32‰盐度正常海水)。整个实验体系内个体以及各个家系的表型参数如表1、表2所示，能够看出胁迫体系内单环刺螠虫体的存活时间具有较大差异：个体水平上差异显著，最小存活时间为40h，最大存活时间为220h，平均每条单环刺螠个体的存活时间为116.7408±34.9905h(表1)；家系水平上单环刺螠虫体的存活时间也具有较大差异，最小存活时间为97.4000±4.3234h，最大存活时间为156.6000±4.7925h(表2)。另外，在表1和表2中也可以看出不同家系之间体重参数也存在显著差异。对整个胁迫体系内的不同体重的单环刺螠个体的存活时间数据做散点图分析，可以看到个体存活时间具有随着体重增大而增长的趋势(图3)。利用不同父系半同胞家系以及母系全同胞家系的存活时间数据与体重数据进行作图分析，可以看到在父系半同胞家系之间：1号半同胞、4号半同胞、7号半同胞家系、8号半同胞家系的耐盐能力较强(图4)；母系全同胞家系之间：1-2号全同胞、1-3号全同胞、4-1号全同胞家系、4-2号全同胞家系、4-3号全同胞家系、7-3号全同胞家系、8-3号全同胞家系的耐盐能力较强(图5)，表明以上家系对低盐度耐受的能力更为优良，初步对以上家系进行标记。

表1 72h半致死低盐度胁迫条件下单环刺螠个体耐受存活时间及体重性状表型数据

表2 72h半致死低盐度胁迫条件下单环刺螠各全同胞家系耐受存活时间及体重性状表型数据(均值±标准误差)

4.盐度耐受性及体重遗传参数确定

利用上述低盐胁迫过程中统计的单环刺螠个体的存活时间以及体重数值进行遗传参数分析。建立低盐耐受遗传参数估计模型：y

其中y

该动物模型的遗传力计算公式如下：

其中，

同时，低盐耐受与体重性状之间的遗传和表型相关性(r

计算遗传相关时，σ

通过计算分析得到：单环刺螠低盐胁迫存活性状的遗传力估计值为0.1602±0.0639，表明其具有一定的选育潜力。单环刺螠体重性状遗传力估计值为0.7244±0.1559，属于高等遗传力水平，表明对体重性状进行选择育种也具有一定的优势(表3)。同时，存活时间以及体重的变异系数分别为29.97％和48.83％(表1)，进一步说明了单环刺螠低盐耐受以及体重性状的选育基础良好。此外，其低盐耐受与体重性状之间的遗传与表型相关性系数分别为0.8877±0.0530和0.4879±0.0401(表3)，两者之间的高度相关性表明两性状间可以进行间接选择。

表3 72h半致死低盐度胁迫条件下单环刺螠耐受存活时间及体重性状遗传参数(对角线为遗传力，对角线上为遗传相关，对角线下为表型相关)

5.F1代亲本留种

根据低盐耐受性状以及体重性状遗传力，利用BLUP法(最佳线性无偏估计法)估算单环刺螠个体育种值，再根据个体育种值确定家系平均育种值。将各家系的抗盐性状与体重性状的平均育种值按照1:1比例进行加权计算得到低盐胁迫条件下所有家系的综合育种值(表4)。利用综合育种值进行排序，筛选得到排名在前5名内的家系分别为：4-1、4-2、7-3、1-3、4-3(按名次顺序排列)，与依据表型数据初步确定的家系具有一致性。将选择出的五个家系作为低盐繁育候选家系，按照3-5％的留种率继续养殖到成体。

表4 72h半致死低盐度胁迫条件下单环刺螠各全同胞家系低盐耐受性状、体重性状及加权综合育种值

6.F2代家系构建及继代选择

将F1代筛选出的五个低盐繁育候选家系内的留种个体养殖至性腺成熟时期，在其中挑选出个体大、活力强的健壮单环刺螠雌雄个体进行相同家系来源和不同家系来源之间的配对繁育来构建F2代家系，近交系数控制在0.1以内。后续选育过程中以低盐耐受能力强、体重性状优良为选育指标对F2代家系开展4-5代的连续选择，在最终获得的家系中选择亲缘关系远、体重性状优良且体色粉红的健康单环刺螠雌雄个体作为优良品系进行产业化推广应用。

以上实施例仅用以说明本发明中的技术方案。本文中所记录的操作方法和技术手段可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现，然而这些在不脱离本发明构思的前提下做出的修改或替换均将落入本发明的保护范围。