牛结节性皮肤病的竞争ELISA抗体检测试剂盒及制备方法

技术领域

本发明涉及一种动物传染病检测试剂盒及制备方法，确切讲本发明涉及一 种用于检测牛结节性皮肤病的竞争ELISA抗体检测试剂盒及制备方法。

背景技术

牛结节性皮肤病(Lumpy skin disease, LSD) 也称为牛疙瘩皮肤病，是由痘病毒科、山羊痘病毒属的牛结节性皮肤病病毒(Lumpy skindisease virus,LSDV) 引起的以患牛发热，皮肤、黏膜、器官表面广泛性结节，淋巴结肿大，皮肤水肿为特征的传染病。该病又称结节性皮炎或块状皮肤病，能引起感染动物消瘦，产乳量大幅度降低，严重时导致死亡。临床急需开发一种研究便捷、快速、敏感、特异的快速诊断试剂盒。

目前该病病原的检测方法很多，包括病毒的分离及鉴定、PCR分子检测、 病毒中和试验、免疫荧光、电镜分析等，这些方法具有操作复杂、费用高、需 要生物安全实验室等，不能大范围在基层推广等缺点，很难在现场进行该病的 流行病学调查与监测。而血清学抗体检测试剂盒目前国内还没有，但我国主要 采取疫苗免疫与扑杀相结合的防控策略，血清学抗体检测成为自然感染监测和 疫苗免疫效果评价的关键技术所在。

国外试剂盒(ID Screen Capripox Double Antigen Multi-species，公司ID.vet， 法国)是双一种抗原夹心ELISA，经相关实验表明，该试剂盒的阳性率较低， 仅为35.14％。

现阶段，寻找一种简便快捷、能大范围推广、对所有感染该病的牛都能进 行检测的血清学方法显的尤为重要。

发明内容

本发明提供一种用于检测牛结节性皮肤病的检测试剂盒及制备方法。

本发明的用于检测牛结节性皮肤病的检测试剂盒内包括：包被有 GTPV-ORF117编码的抗原蛋白的酶标板、竞争抗体、酶标二抗、及显色底物。

优选地，本发明的用于检测牛结节性皮肤病的检测试剂盒内，GTPV-ORF117 编码的抗原蛋白为重组蛋白，所述的竞争抗体为抗GTPV-ORF117多克隆抗体； 所述的酶标二抗为以HRP标记的鼠抗兔抗体。

优选地，本发明的用于检测牛结节性皮肤病的检测试剂盒内，还有样品稀 释液、其中含有吐温的磷酸缓冲液、酶底物TMB和终止液的2M硫酸。试剂盒 内设置这些物品可大大方便检测作业。

本发明的牛结节性皮肤病的竞争ELISA抗体检测试剂盒制备方法是，以提 取的山羊痘病毒GTPV基因组DNA为模板，用SEQ ID No.1和SEQIDNo.2为 引物扩增得到ORF117胞外区片段，将扩增片段酶切构建到pET-30a原核表达载 体中，转化BL21(DE3)感受态，诱导表达制备ORF117胞外区蛋白并包被于 酶标板上，封闭；以制备的pET-30-ORF117蛋白免疫兔子，收集抗ORF117蛋 白兔血清制备竞争抗体，以鼠抗兔HRP标记的抗体为酶标二抗。

相关的研究发现，牛结节性皮肤病病毒(LSDV)与山羊痘病毒(GTPV) 之间关系紧密，其基因组包含1个保守的编码脊椎动物痘病毒复制的基因、1 个编码毒力的基因和1个编码宿主范围的基因。利用分离的各株LSDV、 GTPV病毒基因组的774-1237位片段进行分析，分析发现LSDV与GTPV基 因组序列的相似性为97％。本发明中所用的山羊痘GTPV-ORF117阅读框与LSDV中122阅读框编码的基因都为A33蛋白，核苷酸序列的一致性为97.1，氨基酸序列的一致性为94.4％；而二者的胞外区核苷酸序列的一致性为98.5％， 氨基酸序列的一致性为99.3％。通过相关实验表明，本发明以GTPV-ORF117作 为检测LSDV的抗原蛋白，可以满足对LSDV的检测。

本发明首次建立了LSD竞争ELISA抗体检测试剂盒，为高效、准确、快速 检测牛结节性皮肤病提供了一种工具。本发明具有如下优点：(1)利用已获得 的GTPV-ORF117编码的抗原蛋白建立了检测试剂盒，避免了重复性的再投入与 研究；(2)利用了兔多克隆抗体作为竞争抗体，制备方便，价格低廉，不影响 诊断的效率，有利于降低诊断制剂的成本；(3)针对我国现阶段LSD感染、爆 发、防控的需求，对LSD竞争ELISA抗体检测方法进行了研究，并建立了其判 定标准，可对LSD防控、养殖业社会经济的发展做出贡献。

附图说明

图1.为Western blotting检测本发明的ORF117重组蛋白与LSDV阳性血清 反应的情况。

图2.为用本发明的试剂盒检测200份阴性血清抑制率散点图。

具体实施方式

以下的实例对本发明进行解说。

一：包被抗原的制备与鉴定

1.1重组抗原的制备

ORF117胞外区基因的克隆及表达载体的构建

提取山羊痘病毒GTPV基因组DNA，PCR扩增ORF117基因的胞外区片段， 经限制性内切酶消化目的片段和原核表达载体，通过连接酶连接目的基因和载 体，转化BL21感受态细胞，通过诱导剂诱导表达目的蛋白，通过镍层析柱纯化 表达的蛋白。具体如下：

a.引物设计及PCR扩增

根据已发表的ORF117基因序列，设计ORF117基因的胞外区序列表达引物， 并确定原核表达载体pET-30a(+)及目的基因的酶切位点，得到：

SEQ ID No.1(ORF117上游引物)：

5'-CCGC

ORF117 PCR总反应体积为50μL：灭菌去离子水30.5μL，4×PCR buffer 10 μL，2.5mM dNTP mixture 4μL，上、下游引物(50μmol/L)各1μL；DNA模 板3.5μL；表达片段ORF056 PCR扩增条件：95℃4min；94℃15s，55℃ 15s，68℃1min，35个循环；72℃5min。

扩增得到ORF117胞外区编码的核苷酸和氨基酸序列分别参见序列表SEQ ID No.3和SEQ ID No.4。

b.表达载体的构建

利用KpnI和XhoI将ORF117胞外区(393bp)扩增片段和pET-30a载体双 酶切，酶切后回收，在16℃连接12～16h，连接产物转化BL21(DE3)感受态， 挑取单克隆进行PCR、酶切和测序鉴定，测序正确的重组菌命名为 pET-30-ORF117。

c.Western blotting检测表达蛋白的反应原性检测

将测序正确的重组菌pET-30-ORF117按1％的比例接种到含有50μg/mL的 Kan的LB培养基中，200rpm/min在37℃摇床震荡摇振2～3h，当OD值达到 0.6左右时，加IPTG诱导剂终浓度为1mM，诱导6h，离心收集菌体。菌体SDS-PAGE电泳，然后转到硝酸纤维素(NC)膜上，分别用分离的新疆LSDV- 株病毒感染制备的血清为阳性血清和为非疫区经PCR、ID ELISA试剂盒检测未 感染的犊牛血清为阴性血清，作为一抗，用HRP标记的兔抗牛IgG(Sigma，)作为二抗，Western blotting检测重组蛋白，表达的GTPV-ORF117重组蛋白能 够和LSDV阳性血清反应，而和阴性血清没有反应。利用ECL发光液曝光，检 测表达蛋白的分子量大小：pET-30-ORF117表达的目的蛋白约为19Kd，参见 图1，可见目的蛋白表达正确，而且具有反应原性。

本发明所涉及的重组菌BL21(DE3)/pET-30-ORF117制备的方法可参见申 请人2018年10月24日提交的申请号为：201811241377.0,名称为“一种山羊 痘重组蛋白抗原的制备及其应用”专利申请中相关内容。

二：诊断试剂盒的研制

2.1动物免疫

将4只健康实验兔分为2组即A组实验组(2只)和B组(2只)对照组。第1 次免疫，将纯化好的ORF117蛋白用PBS稀释成400μg/mL，与弗氏佐剂按体积 1:1混合并完全乳化后免疫健康实验兔，采用皮下肌肉多点注射，每只兔子免疫 1ml完全乳化好的乳剂；间隔2周进行第2次免疫，佐剂为不完全弗氏佐剂，其 余条件同第一次免疫。隔14天后进行第三次免疫，免疫蛋白的剂量加倍，佐剂 为不完全弗氏佐剂，方法同第二次免疫。每次免疫前于耳缘静脉处采血，利用 间接ELISA试剂盒测定实验兔的抗体效价。最后一次抗原免疫后14d，从兔心 脏采血，4℃放置过夜后，4℃，5000rpm离心30min收集血清，过滤除菌分装保 存-80℃备用。

2.2竞争ELISA方法的建立

2.2.1ELISA方法的建立及条件优化

(1)应用Bradford蛋白定量试剂盒检测浓缩蛋白的浓度：首先将标准品 (2mg/mL的BSA)稀释成浓度为0、50、75、100、150、200μg/mL的BSA， 在酶标板上每孔加入10μL稀释成不同浓度的BSA标准品，做1孔重复孔，在 每孔加入250μL Bradford染色液后混匀，室温放置20min。用酶标仪测定595nm 的吸光值，并计算样品蛋白浓度。

(2)抗原包被浓度和血清最佳稀释度的优化

利用pH＝9.6的含有碳酸钠和碳酸氢钠缓冲液将已知浓度的蛋白稀释为 0.125、0.25，0.5、1、2、4、8μg/mL，加入酶标板中，每孔100μL，4℃包被 过夜后，做1孔重复孔。次日倒掉孔中液体用洗涤液洗涤1-2次后拍干，再每孔 加入150μL 1％BSA溶液37℃封闭2h，PBST洗涤1次。将阴、阳性血清进行 倍比稀释，从1:2稀释至1:32自左而右分别加入各孔中，每孔50μL，同时每孔 加入相同体积工作浓度的竞争抗体，室温下震荡混匀60s，置于37℃作用30min， 洗涤同前，每孔加入100μL鼠抗兔HRP酶标抗体，置于37℃作用30min，洗涤 同前，每孔加入相同体积的TMB，置于37℃显色12-15min，同时每孔加人50μL 终止液，酶标仪上测定450nm吸光值。根据P/N值确定抗原最佳抗原包被浓浓 为2μg/mL，血清最佳稀释度为1:2，结果如表1。

表1抗原浓度和血清最佳浓度的筛选

P：代表阳性血清平均值；N：代表阴性血清平均值；P/N代表阳性和阴性的比值

(3)竞争抗体最佳浓度的确定

方法同(2)，以抗原最佳浓度包被抗原板，参考血清按照最佳稀释度进行 稀释，将竞争抗体稀释5个梯度1:5000、1:10000，1:15000、1:20000、1:25000、1:30000在其他条件相同的情况经方正滴定法，根据P/N值确定竞争抗体的最佳 稀释度为1:20000，结果如表2。

表2竞争抗体浓度确定

P：代表阳性血清平均值；N：代表阴性血清平均值；P/N代表阳性和阴性的比值

(4)鼠抗兔酶标抗体(HRP-IgG)最佳稀释度确定

方法同上，以抗原最佳浓度包被抗原板，上述确定最佳的竞争抗体稀释度1：20000，将HRP-IgG参考说明书推荐的浓度稀释了5个梯度1:5000、1:8000、 1:10000、1:15000在其他条件相同的情况经方正滴定法，根据P/N值确定酶标 抗体最佳稀释度为1:8000。

(5)血清和竞争抗体作用时间的优化

方法同上，将血清和竞争抗体按最佳稀释比例进行稀释，同时按相同体积 加入酶标板中混匀，37℃作用分别30min、45min、60mmin、90min、120min。 其他条件不变的情况下，检测各种待检血清，根据P/N值确定血清和竞争抗体 最佳作用时间，温度为37℃作用30min。

(6)鼠抗兔酶标抗体作用时间的优化

方法同上，将血清和竞争抗体按最佳稀释比例进行稀释，同时按相同体积 加入酶标板中混匀，37℃作用分别30min；加入最佳浓度的稀释好的HRP标记 的二抗，其他条件不变的情况下，37℃作用分别30min、45min、60mmin、90min、 120min，根据P/N值确定血清和鼠抗兔酶标抗体HRP-IgG最佳作用时间为 45min。

(7)TMB作用时间优化

方法相同，按上述所得的最佳实验条件进行，加入TMB在37℃分别作用 10min、15min、20min、25min、30min显色。其他条件不变的情况下，检测各 种待检血清，P/N值确定TMB最佳作用时间及温度为37℃，作用15min。

(8)ELISA方法阴阳性血清判定标准的建立

用本发明建立的ELISA方法对200份已知背景的阴性血清检测，计算各已 知背景待检血清的抑制率(PI)的cut-off值，按照阴性对照PI的平均值+2SD 为判定的标准及为cut-off值。抑制率PI＝[1-(样本孔的OD450nm/阴性对照孔的 OD450nm)]×100％。结果如图2，PI的平均值为43.87％；SD＝5.12％，及PI的 cut-off值为55％，因此判定标准为：当待检样本PI≧55％时，可判定为阳性； 50％≦PI﹤55％时为可疑；当待检样本PI﹤50％时为阴性。

(9)交叉反应试验

用包被好的酶标板同时检测牛O型、A型、亚I型FMDV、BVDV、蓝舌 病毒阳性血清，分析结果表明用本发明的试剂盒进行检测时与以上这几种病毒 没有交叉反应。

(10)敏感性、特异性分析

用本发明研制的竞争ELISA试剂盒和国外(ID Screen Capripox Double AntigenMulti-species)试剂盒检测已知背景的10份免疫山羊痘灭活疫苗牛血 清；实验和自然感染LSDV阳性血清27份，30份既没有免疫也没有疫病的阴性 样本。检测结果如表3，本试剂盒的敏感性为94.59％，国外的试剂盒为35.14％； 本发明试剂盒特异性为96％国外试剂盒为100％与国外的试剂盒相比较，研制的 竞争ELISA试剂盒敏感性高于国外的试剂盒，但是特异性低于国外试剂盒。

表3敏感性和特异性比较

(11)批内和批间重复试验

分别用同一批次组建的试剂盒和3个不同批次的试剂盒检测同样的20份血 清，根据计算的标准差和变异系数，结果显示其变异系数小于5％和10％，说明 试剂盒具有很好的稳定性和重复性。

2.2.2酶标板的制备

将抗原按最佳包被浓度(2ug/ML)稀释，每孔100μL均匀的包被在酶标板 孔上，4℃过夜；次日倒掉孔中液体，每孔加入300μL洗涤液洗涤1-2次，然后 每孔中加入150μL封闭液，37℃封闭2h，甩干净孔中液体，室温晾干，装入干 燥剂进行真空包装，置4℃保存。包被缓冲液为0.05M pH＝9.6的碳酸盐缓冲液 (1L溶液中含1.59g Na

2.2.3标准阳性和阴性血清的制备

标准阳性血清的制备：挑选健康的未进行牛结节性皮肤病疫苗免疫和没有 感染的3头牛，利用本实验室分离的LSDV/Xinjiang/2019病毒，在国家口蹄疫 参考实验室(ABSL-3)进行人工感染，感染后的17天利用PCR方法检测核酸 阳性，病毒中和检测为阳性后，麻醉采集颈静脉全血，4℃静置过夜后，5000rpm 离心30min，分离血清，加防腐剂后，分装、标记，置-80℃备用。

标准阴性血清的制备：利用PCR方法及ELISA检测验证没有LSDV感染及 没有免疫的牛只，一次性采集足够多的血清，在4℃静置过夜后，5000rpm，30min， 离心分离血清，加防腐剂后放置-80℃备用。

2.2.4鼠抗兔辣根过氧化物酶(HRP)购于试剂公司santa cruz(mouse anti-rabbit IgG-HRP,SC-2357)。

本发明试剂盒其他溶液配制：①样品稀释液：0.01M磷酸缓冲液添加体积浓 度为0.1％的吐温；②洗涤液25倍浓缩的含有体积浓度为0.1％的吐温的磷酸缓 冲液；酶底物：底物TMB购自公司(SurmoDics.IVD,USA)；终止液：为取111.1 浓度为98％的浓硫酸加蒸馏水至总体积1L可得。

2.3本发明的牛结节性皮肤病竞争ELISA抗体检测试剂盒的检测操作步骤：

2.3.1将待检测样本用稀释液1:2稀释，每孔加50μL，同时加入阳性和阴性 对照液，每孔建议做1孔重复，再同时在每孔加入50μL按最佳稀释比例 (1:20000)稀释的竞争抗体，室温下用微量震荡器上或者手动震荡混匀。置于 37℃作用30min后，倒掉孔中液体，每孔加300μL洗涤液洗涤板3-4次拍干， 再在每孔加入稀释好的100μL鼠抗兔HRP–IgG溶液，置于37℃作用45min后， 倒掉孔中液体，每孔加入300μL洗涤液洗涤板3-4次拍干，再在每孔中加入100 μL的酶底物TMB溶液，37℃避光显色15mmin，再加入终止液50μL。最后在 酶标仪测定450nm处各样品吸收值。

2.3.2结果判定

计算同一酶标板上阴、阳性对照孔和每份待检血清孔在450nm波长的平均吸 光值(OD450nm)，根据以下公式计算阴、阳性血清及待检血清的抑制率(PI)

PI＝[1-(样本孔的OD450nm/阴性对照孔的OD450nm)]×100％

公式1

本发明在使用时，阳性对照血清PI﹥60％时检测结果成立，否则该次检测 结果无效。

判断标准：当待检血清的PI≧55％时，判定为阳性；50≧PI﹤55％判定为可 疑；当PI﹤50％时判定为阴性。

序列表

<110> 中国农业科学院兰州兽医研究所

<120> 牛结节性皮肤病的竞争ELISA抗体检测试剂盒及制备方法

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 38

<212> DNA

<213> 人工序列 上游引物(ORF117)

<400> 1

ccgcggtacc ttagcatttt ttaataataa tacatgtg 38

<210> 2

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列 下游引物(ORF117)

<400> 2

ccgcgctcga gttaaaaaaa agatcttaca cag 33

<210> 3

<211> 396

<212> DNA

<213> 牛结节性皮肤病病毒 ORF117胞外区 (ORF117)

<400> 3

atgttagcat tttttaataa taatacatgt gaattaaatc aatttaagga acacaaaccg 60

tactttttaa aaaatccaaa tcctactaca tatagtgacg acgatactga atctgagtta 120

aatgtttata gatcatgtaa aggtattgtt tatagcggat actgttacac ttttaactta 180

gaacctaaaa gttttaatga tgcatacgat gattgtgaaa aaaaaaatag cgaattacca 240

tcaaataatt taatgaatga ttggataagt gactacttag atgggacgtg gggagaagac 300

ggtaacgtac tttttaaaga aaaaaatcaa aaacttgaag ctatagatat aagcgatgag 360

atgagaagct attactgtgt aagatctttt ttttaa 396

<210> 4

<211> 131

<212> PRT

<213> 牛结节性皮肤病病毒 ORF117胞外区 (ORF117)

<400> 4

Met Leu Ala Phe Phe Asn Asn Asn Thr Cys Glu Leu Asn Gln Phe Lys

1 5 10 15

Glu His Lys Pro Tyr Phe Leu Lys Asn Pro Asn Pro Thr Thr Tyr Ser

20 25 30

Asp Asp Asp Thr Glu Ser Glu Leu Asn Val Tyr Arg Ser Cys Lys Gly

35 40 45

Ile Val Tyr Ser Gly Tyr Cys Tyr Thr Phe Asn Leu Glu Pro Lys Ser

50 55 60

Phe Asn Asp Ala Tyr Asp Asp Cys Glu Lys Lys Asn Ser Glu Leu Pro

65 70 75 80

Ser Asn Asn Leu Met Asn Asp Trp Ile Ser Asp Tyr Leu Asp Gly Thr

85 90 95

Trp Gly Glu Asp Gly Asn Val Leu Phe Lys Glu Lys Asn Gln Lys Leu

100 105 110

Glu Ala Ile Asp Ile Ser Asp Glu Met Arg Ser Tyr Tyr Cys Val Arg

115 120 125

Ser Phe Phe

130