一种组合物在制备治疗脂肪肝、肝炎和肝纤维化中的应用

技术领域

本发明属于制药领域，涉及3-甲基-1-苯基-2-吡唑啉-5-酮和冰片组合物在治疗非酒精性脂肪肝（NAFL）、非酒精性脂肪性肝炎（NASH）和肝纤维化及相关障碍的应用。

背景技术

非酒精性脂肪性肝病（nonalcoholic fatty liver disease，NAFLD）是由糖脂代谢紊乱诱发的以肝细胞脂质沉积为特征的肝脏疾病，疾病谱包括单纯性脂肪肝（nonalcoholic fatty liver，NAFL）、非酒精性脂肪性肝炎（nonalcoholicsteatohepatitis，NASH）、NASH相关肝硬化及肝细胞癌（Clinical Liver Disease, 2018,11（4）:81-81）。

在过去20多年中，NAFLD在全球的患病率和发病率不断上升，NAFLD在全世界的患病率为25.24%（Hepatology. 2016;64:73-84）。我国近十年其患病率大幅增长，NAFLD患病率高达26%-45%，已经取代慢性病毒性肝病跃居我国慢性肝病之首（WorldJGastroenterol.2013;19:5334-5339，J Gastroenterol Hepatol. 2014;29:42-51）。

传统药物治疗在NAFLD中效果十分有限，开发新的靶向药物备受NAFLD领域研究者的瞩目和期待。2019年，FDA授予奥贝胆酸治疗伴有肝纤维化的NASH的突破性药物资格、治疗原发性胆汁性肝硬化的快车道地位、治疗原发性胆汁性肝硬化和原发性硬化性胆管炎的孤儿药地位。其他新药包括胰高血糖素样肽-1受体激动剂、过氧化物酶体增殖物激活受体-α/γ双受体激动剂、靶向线粒体的胰岛素敏化剂、靶向胆汁酸信号通路的激动剂、乙酰辅酶A羧化酶抑制剂、甲状腺素类似物、阻断细胞凋亡药物、抑制炎症反应新药、赖氨酰氧化酶样蛋白-2阻断剂、Rho激酶-2抑制剂等已经有小样本的研究甚至2期临床试验数据显示该药物可能有效作用胰岛素抵抗、脂质代谢、细胞凋亡、炎症反应和纤维化过程的多个信号通路，有望成为新的治疗选择，但仍需未来研究进一步明确疗效和安全性（Nat Rev DrugDiscov. 2016;15:249-274）。

近年来，在NAFLD形成过程中参与代谢紊乱、炎症反应及纤维化进展的多条主要分子信号通路和相关调控机制相继取得了重大进展:（1）业已证实NAFLD患者胰岛素抵抗在分子层面为胰岛素受体后信号转导障碍（Cell. 2012;148:852-871），即胰岛素与其受体结合启动受体自身磷酸化激活，并进一步层级传递激活磷脂酰肌醇3激酶、丝/苏氨酸及下游效应分子过程中的障碍。其中脂肪酸代谢的活性产物成分（如鞘脂类、二酰基甘油）激活的蛋白激酶C（Nature. 2014;510:84-91; Prog Lipid Res. 2013;52:175-191）、炎症激活的C-Jun氨基末端激酶1（c-Jun N-terminal kinases, JNK1）均是通过负调控胰岛素分子通路的多个节点磷酸化参与胰岛素抵抗发生和肝脏脂质蓄积的关键环节（Cell. 2012;148:852-871; Nat Med. 2017;23:439-449）; （2）损伤肝细胞并驱动NAFL向NASH发生的炎症通路相继发现（Hepatology. 2010;52:774-788），包括线粒体游离脂肪酸过载诱导活性氧产生所启动的凋亡通路, 病原相关分子模式/损伤相关模式分子（如脂多糖、胆固醇结晶等）激活的炎症小体NLRP3活化Capase-1的促炎通路、炎症因子激活核因子NF-κB和JNK1启动的凋亡通路；（3）启动NAFLD纤维化发生的关键环节——导致肝星形细胞激活的相关通路得到明确，包括肝损伤诱导Shh配体表达下激活的Hedgehog通路（Hepatology. 2012;55:1711-1721）、肝脏局部过度激活的肾素-血管紧张素Ⅱ-醛固酮通路（Liver Int. 2015;35:979-985）和转化生长因子-β信号通路（Gut. 2015;64:791-799）。

自由基（free radicals）是指含有不成对电子的离子、原子、原子团或分子。正常情况下，人体内自由基的产生和清除处于动态平衡状态，然而，当肌体损伤引发炎症反应、发生病变或受到外界环境因素影响导致人体内自由基平衡被打破时，多余的自由基就会攻击生物膜，引发一系列的自由基链反应，引起体内蛋白质、酶、脂质和核酸的氧化损伤，影响体内正常的新陈代谢，从而引发疾病（Physiological Reviews, 2002, 82(1):47-95]）。许多人类和动物研究已经观察到NAFL/ NASH的疾病状态与氧化应激或脂质氧化的生物标志物之间的关联（Clin Sci (Lond).2004;106:261–268; Hepatology2011;54:1610–1619）。据报道，与脂肪变性患者相比，使用亚油酸产生的主要脂质过氧化产物在NASH患者中显着升高，并且这些氧化产物与肝脏组织病理学之间存在强烈的相关性，如炎症、纤维化和脂肪变性（J Lipid Res 2010;51:3046–3054）。

3-甲基-1-苯基-2-吡唑啉-5-酮能够清除游离羟基自由基和过氧亚硝酸根（Experimental & Clinical Cardiology, 2004, 9（3）:177）。它通过自由基生成和氧化应激引起的细胞膜损伤限制脂质过氧化的程度，发挥保护和抗氧化作用并延缓疾病进展。据报道，在多种实验模型中，3-甲基-1-苯基-2-吡唑啉-5-酮可保护脑、心脏（Life Sci. 71(2002) 2249）和肝脏（Eur. J. Pharmacol. 465 (2003) 163;Journal of Pharmacologyand Experimental Therapeutics, 2003, 307(1):74-82.）免受自由基介导的损伤。

冰片分为合成冰片和天然冰片。合成冰片含有异龙脑，而天然冰片不含异龙脑。研究表明，冰片能改善肠道吸收（AAPS PharmSciTech. 2011 Dec;12（4）:1044-9），血脑屏障（J Asian Nat Prod Res.2014，16（6）:648-57; J Ethnopharmacol. 2015，162:270-7）和角膜通透性（Pharmazie. 2006，61（9）:783-8），神经保护作用（Neuroscience. 2011，176:408-19；Eur J Pharmacol. 2014，740:522-31），抗炎（Inflammation. 2014，37（4）:1148-57）、抗氧化和保护DNA损伤（J Agric Food Chem. 2014，62（28）:6632-9），增强GABA受体功能（BiochemPharmacol. 2005，69（7）:1101-11），还能改善大鼠凝血功能，抗血栓活性（Am JChin Med. 2008; 36（4）:719-27）。

发明内容

依据现有技术，无法推测3-甲基-1-苯基-2-吡唑啉-5-酮和冰片组合物是否对非酒精性脂肪肝（NAFL）、非酒精性脂肪性肝炎（NASH）和肝纤维化及相关障碍有治疗作用，也无法判断现有质量比10:1~1:10比例组合物是否体现协同作用。

本发明出人意料的发现3-甲基-1-苯基-2-吡唑啉-5-酮和冰片组合物在制备治疗非酒精性脂肪肝（NAFL）、非酒精性脂肪性肝炎（NASH）和肝纤维化及相关障碍的显著性作用。

更进一步地，此药物组合物能协同性增强治疗非酒精性脂肪肝（NAFL）、非酒精性脂肪性肝炎（NASH）和肝纤维化的药效；较单独使用3-甲基-1-苯基-2-吡唑啉-5-酮或其药学上可接受的盐或者单独使用冰片，药效更强。

更进一步地，本发明所述的药物组合物3-甲基-1-苯基-2-吡唑啉-5-酮或其药学上可接受的盐与冰片的重量比为1:10~10:1。

更进一步地，本发明所述的药物组合物3-甲基-1-苯基-2-吡唑啉-5-酮或其药学上可接受的盐与冰片的重量比为1:5~5:1。

本发明所述的冰片包括天然冰片。

其中，所述药物是改善非酒精性脂肪肝（NAFL）、非酒精性脂肪性肝炎（NASH）和肝纤维化的药物。

附图说明

图1 各组别相对细胞活力值

图2 依达拉奉和冰片组合物对由游离脂肪酸引发的HepG2细胞中的脂毒性的保护性作用

图3 依达拉奉和冰片组合物对HepG2细胞中的脂毒性的保护性作用协同性分析的中位效应图

图4 依达拉奉和冰片组合物对由游离脂肪酸引发的HepG2细胞中的脂毒性的保护性作用

图5 依达拉奉和冰片组合物对HepG2细胞中的脂毒性的保护性作用协同性分析的中位效应图

图6 各给药组相对NF-κB p65磷酸化程度

图7 各给药组JNK相对磷酸化程度

图8 各给药组相对α-SMA 相对表达量

具体实施方式

下述实施例举例说明本发明，不应被认为是对本发明的限制。实施例中提及的依达拉奉是3-甲基-1-苯基-2-吡唑啉-5-酮，组合物是3-甲基-1-苯基-2-吡唑啉-5-酮与冰片组合物。

实施例1：依达拉奉与冰片组合物对由游离脂肪酸引发的HepG2细胞中的脂毒性的保护性作用

1 材料与方法

1.1 细胞

HepG2购自ATCC，使用含10%胎牛血清，1%青霉素和链霉素的DMEM培养基培养，于37℃，5% CO2孵箱培养。

1.2 药品与试剂

依达拉奉与冰片组合物，质量比100:1~1:100

依达拉奉（Sigma-Aldrich，M70800-100G）

冰片（Sigma-Aldrich，420247-1G）

FFAs(油酸/棕榈酸，2:1)

油酸（Sigma-Aldrich，O1008-1G）

棕榈酸（Sigma-Aldrich，P5585-10G）

Cell titer Glo细胞活力检测试剂盒（Promega，G7571）

1.3 试验方法

1.3.1细胞模型

在处理前至少24小时将所有细胞接种在细胞培养瓶中。为了诱导FFA过载，将70％汇合的HepG2细胞暴露于含有1％不含FFA的BSA的培养基中的不同浓度的长链FFA（油酸/棕榈酸，2:1）的混合物中。将30mM FFA的储备溶液在含有1％BSA的培养基中稀释，以获得所需的最终浓度。

将HepG2细胞以8×10

分组如下表（表1）：

表1依达拉奉和冰片组合给药示意图

其中：

E0列至E5列给药依达拉奉浓度分别为0，0.1，0.3，1，3，10（μg/ml），n=4；

B0行至B5行给药冰片浓度分别为0，0.1，0.3，1，3，10（μg/ml），n=4；

EB为依达拉奉和冰片组合；

BLANK为空白对照组，造模时不加入FFAs以及冰片和依达拉奉的组合物。

1.3.2检测指标

细胞活力

使用酶标仪检测各孔化学发光强度，以BLANK对照组平均值为100%细胞活力，其他各组化学发光强度值与BLANK对照组化学发光强度值作比，计算相对细胞活力。

1.4 统计学方法

采用Graph Pad Prism7统计软件进行分析，计量资料以X±s 表示，多组间均数比较采用单因素方差分析，两两比较采用Dunnett检验，P<0.05表示差异有统计学意义。

2 试验结果

如图1所示，FFAs诱导HepG2游离脂肪酸过载产生HepG2细胞毒性，相比于BLANK组，造模组E0B0的相对细胞活力显著下降。E1B1给药组合相对E1B0组、E2B1给药组合相对E2B0组、E3B1给药组合相对E3B0组、E4B1给药组合相对E4B0组、E5B1给药组合相对E5B0组对于游离脂肪酸过载引起的细胞毒性的保护作用并无显著性差异（P>0.05），这说明组合物中的冰片在0.1μg/ml浓度下对于依达拉奉的细胞保护作用并无协同增益作用。而E1B2组、E1B3组、E1B4组、E1B5组、相对于E1B0组的保护作用具有显著性差异（P<0.05）；E2B2组、E2B3组、E2B4组、E2B5组、相对于E2B0组的保护作用具有显著性差异（P<0.05）；E3B2组、E3B3组、E3B4组、E3B5组、相对于E3B0组的保护作用具有显著性差异（P<0.05）；E4B2组、E4B3组、E4B4组、E4B5组、相对于E4B0组的保护作用具有显著性差异（P<0.05）；E5B2组、E5B3组、E5B4组、E5B5组、相对于E5B0组的保护作用具有显著性差异（P<0.05）；这些说明组合物中的冰片在0.3、1、3、10μg/ml浓度下对于依达拉奉的细胞保护作用具有协同增益作用。

3结论

依达拉奉和冰片联合给药组相对于E0B0对照组能够剂量依赖的降低FFAs诱导的肝细胞损伤，同时，两药在质量比1:10~10:1内联用，与对照组相比较有显著性差异。

实施例2：依达拉奉与冰片组合物对由游离脂肪酸引发的HepG2细胞中的脂毒性的保护性作用的协同性分析

1.1细胞

HepG2购自ATCC，使用含10%胎牛血清，1%青霉素和链霉素的DMEM培养基培养，于37℃，5% CO2孵箱培养。

1.2 药品与试剂

依达拉奉与冰片组合物，质量比10:1~1:10

依达拉奉（Sigma-Aldrich，M70800-100G）

冰片（Sigma-Aldrich，420247-1G）

FFAs (油酸/棕榈酸，2:1)

油酸（Sigma-Aldrich，O1008-1G）

棕榈酸（Sigma-Aldrich，P5585-10G）

Cell titer Glo细胞活力检测试剂盒（Promega，G7571）

1.3 试验方法

1.3.1：细胞模型

在处理前至少24小时将所有细胞接种在细胞培养瓶中。为了诱导FFA过载，将70％汇合的HepG2细胞暴露于含有1％不含FFA的BSA的培养基中的不同浓度的长链FFA（油酸/棕榈酸，2:1）的混合物中。将30mM FFA的储备溶液在含有1％BSA的培养基中稀释，以获得所需的最终浓度。

将HepG2细胞以8×10

分组如下表（表2，表3，表4，表5）：

表2依达拉奉和冰片单独给药浓度（Eda.为依达拉奉；Bor.为冰片）

表3依达拉奉和冰片以10：1比例组合给药浓度（Eda.为依达拉奉；Bor.为冰片）

表4依达拉奉和冰片以1：1比例组合给药浓度（Eda.为依达拉奉；Bor.为冰片）

表5依达拉奉和冰片以1：10比例组合给药浓度（Eda.为依达拉奉；Bor.为冰片）

1.4 统计学方法

采用Graph Pad Prism7统计软件进行分析，并使用log(inhibitor) vs. normalizedresponse -- Variable slope方程拟合剂量依赖曲线。通过CalcuSyn2.0 软件，使用多药物效应方程计算其联合用药指数。

实验结果：

2.1依达拉奉与冰片不同比例组合物对由游离脂肪酸引发的HepG2细胞中的脂毒性的保护性作用拟合曲线如图2所示，不同比例的组合物（依达拉奉:冰片=10:1、1:1和1:10）在总浓度6.0~13200ng/mL范围内，能剂量依赖性地减少游离脂肪酸过载对HepG2细胞的毒性。

2.2协同性分析（表6，图3）

通过CalcuSyn2.0 软件，使用多药物效应方程计算其联合用药指数（表3），可知，当依达拉奉和冰片在给药组合比为10:1、1:1和1:10时，二者组合物对由游离脂肪酸引发的HepG2细胞中的脂毒性的保护性作用具有协同作用（CI值<0.9），图3为依达拉奉和冰片组合物对HepG2细胞中的脂毒性的保护性作用协同性分析的中位效应图。

表6依达拉奉和冰片组合物对HepG2细胞中的脂毒性的保护性作用协同性分析 （Eda.为依达拉奉；Bor.为冰片；CI为联合作用指数）

2.3结论

由协同性分析可知，当依达拉奉和冰片质量比在1:10~10:1之间时，联合用药指数CI<0.9，可证明依达拉奉和冰片组合物具有协同降低由游离脂肪酸造成的HepG2细胞的脂毒性的作用。

实施例3：依达拉奉与冰片组合物对由游离脂肪酸引发的HepG2细胞中的脂毒性的保护性作用的协同性分析

1.1细胞

HepG2购自ATCC，使用含10%胎牛血清，1%青霉素和链霉素的DMEM培养基培养，于37℃，5% CO2孵箱培养。

1.2 药品与试剂

依达拉奉与冰片组合物，质量比5:1~1:5

依达拉奉（Sigma-Aldrich，M70800-100G）

冰片（Sigma-Aldrich，420247-1G）

FFAs (油酸/棕榈酸，2:1)

油酸（Sigma-Aldrich，O1008-1G）

棕榈酸（Sigma-Aldrich，P5585-10G）

Cell titer Glo细胞活力检测试剂盒（Promega，G7571）

1.3 试验方法

1.3.1：细胞模型

在处理前至少24小时将所有细胞接种在细胞培养瓶中。为了诱导FFA过载，将70％汇合的HepG2细胞暴露于含有1％不含FFA的BSA的培养基中的不同浓度的长链FFA（油酸/棕榈酸，2:1）的混合物中。将30mM FFA的储备溶液在含有1％BSA的培养基中稀释，以获得所需的最终浓度。

将HepG2细胞以8×10

分组如下表（表7，表8，表9，表10，）：

表7依达拉奉和冰片单独给药浓度（Eda.为依达拉奉；Bor.为冰片）

表8依达拉奉和冰片以5：1比例组合给药浓度（Eda.为依达拉奉；Bor.为冰片）

表9依达拉奉和冰片以1：1比例组合给药浓度（Eda.为依达拉奉；Bor.为冰片）

表10依达拉奉和冰片以1：5比例组合给药浓度（Eda.为依达拉奉；Bor.为冰片）

1.4 统计学方法

采用Graph Pad Prism7统计软件进行分析，并使用log(inhibitor) vs. normalizedresponse -- Variable slope方程拟合剂量依赖曲线。通过CalcuSyn2.0 软件，使用多药物效应方程计算其联合用药指数。

实验结果：

2.1依达拉奉与冰片不同比例组合物对由游离脂肪酸引发的HepG2细胞中的脂毒性的保护性作用拟合曲线如图4所示，不同比例的组合物（依达拉奉:冰片=5:1、1:1和1:5）在总浓度6.0~13200ng/mL范围内，能剂量依赖性地减少游离脂肪酸过载对HepG2细胞的毒性。

2.2协同性分析（表11，图5）

通过CalcuSyn2.0 软件，使用多药物效应方程计算其联合用药指数（表8），可知，当依达拉奉和冰片在给药组合比为5:1、1:1和1:5时，二者组合物对由游离脂肪酸引发的HepG2细胞中的脂毒性的保护性作用具有协同作用（CI值<0.9），图5为依达拉奉和冰片组合物对HepG2细胞中的脂毒性的保护性作用协同性分析的中位效应图。

表11依达拉奉和冰片组合物对HepG2细胞中的脂毒性的保护性作用协同性分析 （Eda.为依达拉奉；Bor.为冰片；CI为联合作用指数）

2.3结论

由协同性分析可知，当依达拉奉和冰片质量比在1:5~5:1之间时，联合用药指数CI<0.9，可证明依达拉奉和冰片组合物具有协同降低由游离脂肪酸造成的HepG2细胞的脂毒性的作用。

实施例4：依达拉奉与冰片组合物对TNF-α激活的HepG2细胞中的JNK，NF-κB信号通路作用研究

1 材料与方法

1.1 细胞

HepG2购自ATCC，使用含10%胎牛血清，1%青霉素和链霉素的DMEM培养基培养，于37℃，5% CO2孵箱培养。

1.2 药品与试剂

依达拉奉与冰片组合物，质量比10:1~1:10

依达拉奉（Sigma-Aldrich，M70800-100G）

冰片（Sigma-Aldrich，420247-1G）

人重组TNF-α（Abcam，ab9642）

抗体Phospho-NF-κB p65（Ser536）（CST，#3031）

抗体NF-κB p65（CST，#8242）

抗体phospho c-Jun NH2-terminal kinase（JNK）（CST，#3270）

抗体c-Jun（JNK）（CST，#9165）

1.3 试验方法

1.3.1：细胞模型

将细胞与指定浓度的试剂一起预温育2小时，然后再与10 ng / mL TNF-α孵育4小时。于4小时后加入含有抗体XL-665 labeled Phospho-NF-κB p65 （Ser536）、抗体EulabeledNF-κB p65、抗体XL-665 labeled phospho c-Jun NH2-terminal kinase（JNK）和抗体Eulabeledc-Jun（JNK）的细胞裂解液，分别孵育1小时后，使用HTRF方法检测NF-κBp65和JNK磷酸化程度。

分组如下表（表12）：

表12依达拉奉和冰片组合给药示意图

其中：

E0列至E3列给药依达拉奉浓度分别为0，1，5，10（μg/ml），n=4。

B0行至B3行给药冰片浓度分别为0，1，5，10（μg/ml），n=4。

BLANK为空白对照组，造模时不加入TNF-α以及冰片和依达拉奉的组合物。

1.3.2检测指标

1.3.2.1NF-κB p65磷酸化程度

使用含有抗体XL-665 labeled Phospho-NF-κB p65（Ser536）、抗体EulabeledNF-κBp65的裂解液裂解细胞，并使用HTRF方法检测各组细胞裂解液中665nm和620nm波长，用665nm波长荧光强度除以620nm波长强度可计算出相对NF-κB p65的磷酸化强度。

1.3.2.2JNK磷酸化程度

使用包含抗体XL-665 labeled phospho c-Jun NH2-terminal kinase （JNK）和抗体Eulabeledc-Jun（JNK）的细胞裂解液裂解细胞，并使用HTRF方法检测各组细胞裂解液中665nm和620nm波长，用665nm波长荧光强度除以620nm波长强度可计算出相对JNK的磷酸化强度。

1.4 统计学方法

采用Graph Pad Prism7统计软件进行分析，计量资料以X±s 表示，多组间均数比较采用单因素方差分析，两两比较采用Dunnett检验，P<0.05表示差异有统计学意义。

2 试验结果

2.1 依达拉奉冰片组合物对NF-κB磷酸化的影响

以E0B0组NF-κB p65的磷酸化程度为对照，采用单因素方差分析（one-way ANOVA）对数据进行统计。结果见图6。结果表明，E0B2，E0B3，E1B1，E1B2，E1B3，E2B0，E2B1，E2B2，E2B3，E3B0，E3B1，E3B2，E3B3组相对于E0B0组的JNF-κB p65的磷酸化程度有显著性差异（P<0.05）。

2.2依达拉奉冰片组合物JNK磷酸化的影响

以E0B0组JNK磷酸化程度为对照，采用单因素方差分析（one-way ANOVA）对数据进行统计，结果见图7。结果表明，E0B2，E0B3，E1B1，E1B2，E1B3，E2B0，E2B1，E2B2，E2B3，E3B0，E3B1，E3B2，E3B3组相对于E0B0组的JNK磷酸化程度有显著性差异（P<0.05）。

3结论

由以上结果可知，依达拉奉和冰片联合给药组相对于E0B0对照组能够显著降低TNF-α激活的肝细胞中NF-κB的磷酸化程度和JNK的磷酸化程度，且相对于两种药物单独给药具有较大优势。

实施例5：依达拉奉与冰片组合物对TGF-β激活的LX-2细胞中的α-SMA信号通路作用研究

1 材料与方法

1.1 细胞

LX-2购自ATCC，使用含10%胎牛血清，1%青霉素和链霉素的DMEM培养基培养，于37℃，5%CO2孵箱培养。

1.2 药品与试剂

依达拉奉与冰片组合物，质量比10:1~1:10

依达拉奉（Sigma-Aldrich，M70800-100G）

冰片（Sigma-Aldrich，420247-1G）

人重组TGF-β（Abcam，ab50036）

ELISA检测α-SMA试剂盒（Abcam，ab240678）

ELISA检测β-actin试剂盒（LSBio，LS-F10737-1）

1.3 试验方法

1.3.1：细胞模型

将细胞与指定浓度的试剂一起预温育3.5小时，然后再与5 ng / mL TGF-β孵育48小时。

于48小时后裂解细胞，使用ELISA检测α-SMA和β-actin表达程度。

正交分组如下（表13）：

表13依达拉奉和冰片组合给药示意图

其中：

E0列至E3列给药依达拉奉浓度分别为0，1，5，10（μg/ml），n=4。

B0行至B3行给药冰片浓度分别为0，1，5，10（μg/ml），n=4。

BLANK为空白对照组，造模时不加入TGF-β以及冰片和依达拉奉的组合物。

1.3.2检测指标

ELISA检测α-SMA和β-actin表达情况，使用α-SMA绝对表达量除以β-actin绝对表达量，可得相对的α-SMA表达量。

1.4 统计学方法

采用Graph Pad Prism7统计软件进行分析，计量资料以X±s 表示，多组间均数比较采用单因素方差分析，两两比较采用Dunnett检验，P<0.05表示差异有统计学意义。

2 试验结果

使用α-SMA绝对表达量除以β-actin绝对表达量，可得相对的α-SMA表达量。以E0B0组α-SMA相对表达量为对照，采用单因素方差分析（one-way ANOVA）对数据进行统计。结果见图8。结果表明，E0B2，E0B3，E1B1，E1B2，E1B3，E2B0，E2B1，E2B2，E2B3，E3B0，E3B1，E3B2，E3B3组相对于E0B0组的α-SMA相对表达量有显著性差异（P<0.05）。

2.2结论

由以上结果可知，依达拉奉和冰片联合给药组相对于对照组能够显著降低TGF-β激活的肝星状细胞中α-SMA的表达程度，且相对于两种药物单独给药具有较大优势。