铁皮石斛素类似物及其制备方法和用途

技术领域

本发明属于生物医药领域，具体的说，涉及铁皮石斛素类似物及其制备方法和用途。

背景技术

结肠癌是一种常见的胃肠道恶性肿瘤，是导致癌症相关死亡的第4大原因。近几十年来，尽管在诊断和治疗方面取得了很大进展，但其发病率、死亡率和致残率都没有明显改善，给社会和家庭造成极大的负担。早期结肠癌可以通过手术治愈，而已经发生肝脏或其他部位转移的结肠癌通常难以治愈，五年生存率低。化疗是治疗中晚期结肠癌的主要手段，DDP和5-FU是常见的药物，但毒副作用较大，严重影响患者的生活质量。正因为结肠癌的发病率高，预后不良等特点，结肠癌成为世界范围内主要的公共卫生问题和临床挑战。据报道，许多信号传导途径和分子与结肠癌的发生和发展有关。然而，结肠癌致癌作用的分子机制在很大程度上仍然未知。临床上可用的抗癌药品表现出了疗效限制性，同时伴有一定程度的毒副作用，并且价格也十分昂贵，因此急切需要研究人员开发出新的抗肿瘤化合物。

石斛是兰科的一种多年生附生草本植物，有1500多个种，主要生长在亚洲热带、亚热带和东澳大利亚地区。在中国，已有研究报道的石斛属植物有80多种，主要分布在秦岭以南地区。作为一种观赏药用植物，近年来越来越受到人们的重视。铁皮石斛是世界上最有价值的草本植物之一，在中国和许多南亚国家被用作草药已有几个世纪的历史。在医学实践中，它被用来滋阴、提高体液的产生，以及提供有益的作用，如润肺，调节身体的免疫功能等。石斛的药用成分十分复杂，不仅含有多糖和生物碱，还含有黄酮类化合物、多种氨基酸和微量矿物元素。铁皮石斛素是一种来源于兰科石斛属石斛药材的天然联苄类化合物，前人研究其具有抗炎作用，但生物利用率低，且原料来源昂贵。

发明内容

本发明的目的是提供一种全合成铁皮石斛素类似物，基于其具有更强抗肿瘤作用，进而提供具有药用价值的铁皮石斛素类似物。铁皮石斛素类似物结构如式Ⅰ所示：

式 Ⅰ

本发明还提供了具有抗癌活性的铁皮石斛素类似物及其药学上可接受的盐、水合物。上述药学上可接受的盐又称药用盐，是指铁皮石斛素类似物与有机酸形成的盐；其中有机酸包括酒石酸、柠檬酸、甲酸、乙酸、乙二酸、丙酸、丁酸、草酸、马来酸、琥珀酸、己二酸、澡酸、天冬氨酸、苯磺酸、樟脑酸、樟脑磺酸、二葡萄糖酸、环戊烷丙酸、十一烷基磺酸、十二烷基硫酸、乙磺酸、葡庚糖酸、甘油磷酸、半硫酸、庚酸、己酸、延胡索酸、2-羟基乙磺酸、乳酸、甲磺酸、烟酸、2-萘磺酸、扑酸、果胶酯酸、3-苯基丙酸、苦味酸、新戊酸、硫代氰酸、对甲苯磺酸盐中的一种或多种。

本发明的另一目的在于提供上述铁皮石斛素类似物的制备方法，包括如下步骤：

1）3,5-二甲氧基-4-羟基苯甲醛在氯甲基醚保护后与Triethyl phosphonoacetate在氢化钠条件下得到化合物E-configured α,β-unsaturated ester，在diisobutylaluminium hydride还原后得到肉桂醇物质4；

2）肉桂醇类物质4与3,4-二羟基苯甲醛在氧化银条件下得到cyclo-adduct 2，再与磷酸盐发生Witting 反应得到保护的E/Z diastereomeric产物；

3）还原脱去保护基后得到最终产物，即铁皮石斛素类似物的结构Compound 1。

上述铁皮石斛素类似物或其药学上可接受的盐、水合物在制备抗癌药物组合物或抗癌制剂中的应用。癌症包括原发实体瘤、耐药肿瘤、转移性肿瘤、恶性组织或细胞中的任意一种或多种。进一步，癌症包括肺癌、肝癌、乳腺癌、鼻咽癌、口腔表皮样癌、梭形细胞癌、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌、结肠癌、直肠癌、转移性结肠直肠癌、转移性乳腺癌、转移性HER2阴性乳腺癌、脑癌、脑胶质细胞瘤、脑胶质细胞瘤、胶质瘤、性形细胞瘤、神经管细胞瘤、神经胶质瘤、脑膜瘤、肾癌、膀胱癌、宫颈癌、食管癌、胃癌、头颈部癌、黑色素瘤、骨髓瘤、肉瘤、皮肤癌、胃癌、睾丸癌、甲状腺癌、子宫癌、间皮癌、胆管癌、平滑肌癌、脂肪肉癌、纤维肉癌、神经内分泌癌或唾液腺癌中的任意一种或多种。

上述铁皮石斛素类似物或其药学上可接受的盐、水合物在制备抗肿瘤药物组合物或抗肿瘤制剂中的应用。

进一步的，抗癌药物或抗癌制剂包括作为活性成分的铁皮石斛素类似物或其药学上可接受的盐、水合物，与药剂学上可接受的辅料。

进一步的，抗癌制剂的剂形包括；注射剂、片剂、胶囊剂、颗粒剂、混悬剂、乳剂、溶液剂、溶胶剂、冻干粉针剂、胶浆剂、气雾剂、微囊、微球、纳米制剂、缓释剂或控释制剂中的一种或多种；所述纳米制剂包括：脂质体、纳米囊、纳米球、脂质纳米粒或胶束中的任意一种或多种，优选为脂质体或胶束中的任意一种或多种。

上述铁皮石斛素类似物或其药学上可接受的盐、水合物在制备治疗结肠癌药物组合物中的应用。

除非另有说明，上述药物组合物的各种剂型可以按照药学领域的常规生产方法制备。例如使活性成分与一种或多种载体混合，然后将其制成所需的剂型。

除非另有说明，上述药物组合物优选含有重量比为0.1%~99.5%的活性成分，最优选含有重量比为0.5%~95%的活性成分。

除非另有说明，铁皮石斛素类似物的施用量可根据用药途径、患者的年龄、体重、所治疗的疾病的类型和严重程度等变化，其日剂量可以是0.01~10mg/kg体重，优选0.1~5mg/kg体重。可以一次或多次施用。

本发明的有益效果：

本发明通过简单高效制备方法合成了一种铁皮石斛素S类似物或其在药学上可接受的盐、水合物，首次研究了石斛素联苄类衍生物的抗肿瘤活性，尤其是显著抑制结肠癌SW480细胞的生长，是潜在治疗结肠癌的新化学实体，对于抗结肠癌药物的研究与开发具有重要意义。

附图说明

图1为本发明的铁皮石斛素类似物的化学结构；

图2为本发明的铁皮石斛素类似物Compound 1合成的逆合成分析；

图3为本发明的铁皮石斛素类似物Compound 1的合成路线；

图4为本发明的铁皮石斛素类似物Compound 1对不同细胞株的抑制作用；

图5为本发明的铁皮石斛素类似物Compound 1对结肠癌细胞SW480细胞克隆形成的影响；

图6为本发明的铁皮石斛素类似物Compound 1对SW480细胞凋亡的检测；

图7为本发明的铁皮石斛素类似物Compound 1对SW480细胞凋亡蛋白的检测。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案和有益效果更加清楚，下面将对本发明的优选实施例进行详细的说明，以方便技术人员理解。

实施例1：铁皮石斛素类似物Compound 1的合成

铁皮石斛素类似物Compound 1的合成如图3所示。

化合物7的合成：置换好氮气的250 mL圆底烧瓶中加入3,5-二甲氧基-4-羟基苯甲醛（9.1 g, 50 mmol），N,N-Diisopropylethylamine （14.0 mL, 80 mmol）和4-二甲氨基吡啶（61 mg, 0.5 mmol）并加入100 mL二氯甲烷中充分溶解，在0ºC条件下滴加入氯甲基醚（4.6 mL, 60 mmol），滴加完毕后升高温度到室温反应6 h，TLC显示反应完全。反应液中加入水稀释，加入冷HCl水溶液（50 mL, 0.1 M），萃取得到有机层，并用50 mL二氯甲烷萃取两次后，合并有机相。有机相用水洗，饱和食盐水洗，无水硫酸钠干燥。过滤，减压浓缩，硅胶柱层析（石油醚：乙酸乙酯=4:1）分离得到白色固体化合物7（10.5 g, 95%）。

化合物8的合成：置换好氮气的100 mL圆底烧瓶中加入化合物7（6.8 g, 30mmol），膦酰基乙酸三乙酯（8.9 mL, 45 mmol）并用20 mL无水四氢呋喃充分溶解。在0ºC条件下分批加入氢化钠（(1.8 g, 45 mmol），加完后升高温度到室温反应4 h，TLC显示反应完全。反应液中加入50 mL水稀释，用乙酸乙酯（2 × 50 mL）萃取得到有机相，合并有机相，用水洗，饱和食盐水洗，无水硫酸钠干燥。过滤，减压浓缩，硅胶柱层析（石油醚：乙酸乙酯=9:1→4:1）分离得到白色固体化合物8（6.8 g, 80%）。

化合物4的合成：置换好氮气的100 mL圆底烧瓶中加入化合物8（5.93 g, 20mmol）并用30 mL甲苯溶解。降低反应液的温度到-10ºC后，加入二异丁基氢化铝（8.9 mL,50 mmol），滴加完后保持温度在-10ºC反应1 h，然后升高温度到室温继续反应，TLC显示反应完全。反应液中加入50 mL水稀释，用乙酸乙酯（2 × 50 mL）萃取得到有机相，合并有机相，用水洗，饱和食盐水洗，无水硫酸钠干燥。过滤，减压浓缩，硅胶柱层析（石油醚：乙酸乙酯=4:1→2:1）分离得到白色固体化合物4（3.9 g, 78%）。

化合物2的合成：在25 mL圆底烧瓶中加入化合物4（50.8 mg, 0.2 mmol），3,4-二羟基苯甲醛，用4.5 mL苯-丙酮（2：1）混合溶剂充分溶解。加入氧化银（9.3 mg, 0.04mmol)）并升高温度回流反应24 h，TLC显示反应完全。冷却到室温后，过滤，得到的滤液减压浓缩，硅胶柱层析（石油醚：乙酸乙酯=2:1）分离得到白色固体化合物2（43.7 mg, 56%）。

化合物9的合成：在25 mL圆底烧瓶中加入化合物2（39.0 mg, 0.1 mmol），鏻盐（86.4 mg, 0.2 mmol）用5 mL甲苯充分溶解。加入氟化铯（45.6 mg 0.3 mmol）并升高温度回流反应24 h，TLC显示反应完全。冷却到室温后，过滤，滤液减压浓缩得到粗产物并在真空条件下充分干燥。上一步充分干燥的产物（49.4 mg, 0.1 mmol）置换好氢气后，10 mL二氯甲烷充分溶解，加入5%钯碳（20 mg），反应液继续反应8 h，TLC显示反应完全。反应液过滤，滤液减压浓缩，硅胶柱层析（石油醚：乙酸乙酯=2:1）分离得到白色固体化合物9（26.1 mg,56 %）。

化合物1的合成：置换好氮气的25 mL圆底烧瓶中加入化合物9（24.8 mg, 0.05mmol）5 mL甲醇充分溶解，加入氯乙酸（20 μL, 0.1 mmol），反应在室温下继续反应20 h，TLC显示反应完全。反应液中加入5 mL的0.1 M HCl溶液，再加入乙酸乙酯（3 × 5 mL）萃取出有机相，合并有机相，用水洗，饱和食盐水洗，无水硫酸钠干燥。过滤，减压浓缩，硅胶柱层析（石油醚：乙酸乙酯=2:1）分离得到白色固体化合物1（18.7 g, 83%）。

实施例2：铁皮石斛素类似物对癌细胞的体外抑制作用

1.实验材料

细胞株：人肺癌细胞株A549，人乳腺癌细胞株MCF-7，人白血病细胞株HL-60，人结肠癌细胞株SW480，人肝癌细胞株HepG2，人皮肤鳞癌细胞株A431

检测原理：MTT法检测细胞活性

2.试验方法

1）接种细胞：用含10%胎牛血清的RMP1640或DMEM培养基配成单个细胞悬液，以每孔10000-20000个细胞接种到96孔板，每孔体积100µL。

2）12h后，细胞换用1%青链霉素DMEM或RMP1640培养基加入待测化合物溶液（固定浓度40µM初筛，在该浓度对肿瘤细胞生长抑制在50%附近的化合物设5个浓度进入梯度复筛，终浓度为40,20,10,5,2.5µM），空白组只加培养液（1%青链霉素的DMEM培养基），每孔终体积200µL，每种处理均设3个复孔，

3）显色：37摄氏度5%二氧化碳培养48小时后，细胞活力通过MTT比色法定量检测。每孔加MTT溶液20µL（终浓度0.5mg/mL），继续孵育4小时后，吸掉上清液，细胞内的甲瓒用150µLDMSO进行溶解。

4）比色：选择490nm波长，酶联免疫检测仪（Bio-Rad 680）读取各孔光吸收值，记录结果，以浓度为横坐标，细胞存活率为纵坐标绘制细胞生长曲线，应用两点法（Reed andMuench法）计算化合物IC50值。

细胞存活率=（测试组OD值-空白组OD值）/（正常组OD值-空白组OD值）*100%，其中测试组指给药组。对于正常组，细胞存活率为100%。

3.实验结果

结果如图4所示，铁皮石斛素类似物Comp.1能够显著抑制人肝癌细胞株HepG2，人皮肤鳞癌细胞株A431和人结肠癌SW480 细胞系的生长，并呈浓度依赖性。其中对结肠癌SW480细胞抑制作用较强。

实施例3：铁皮石斛素类似物对结肠癌SW480细胞的体外抑制作用

取对数生长期细胞调整细胞悬液浓度，细胞接种量1000/孔。同时设置空白孔、阳性对照孔。在37℃、5%二氧化碳的培养箱中培养24 h。以1%青链霉素的1640培养基加入待测化合物，处理24 h后，换回10%胎牛血清培养基，继续培养14天。

结果如图5所示，铁皮石斛素类似物能够显著抑制结肠癌SW480细胞生长，并呈浓度依赖性。

实施例4：铁皮石斛素类似物对结肠癌SW480细胞凋亡情况的影响

取对数生长期细胞调整细胞悬液浓度，接种于6孔板中，接种细胞量为100×104 /皿。实验设置对照组，铁皮石斛素类似物不同浓度处理组，无血清培养基处理24小时后，收集各个处理组细胞，离心后用PBS洗两遍。使用Annexin V/propidium iodide (PI) 检测试剂盒(BD Biosciences, PA, USA)进行避光染色15min，染色结束后，加入600ul预冷的1×Buffer终止染色，过滤之后将样品放置在冰上，使用细胞流式仪（BD FACS JAZZ）进行检测及结果分析，比较各组的细胞凋亡情况。

结果如图6所示，铁皮石斛素类似物能够显著促进结肠癌SW480细胞凋亡，并呈浓度依赖性。

实施例5：石斛素类似物对结肠癌SW480细胞凋亡蛋白及其剪切化的影响

1.实验材料：结肠癌SW480细胞株

2.检测原理：Western Blot法检测细胞中相关蛋白的变化情况

3.实验方法:

1）细胞无血清饥饿处理过夜后，进行不同浓度石斛素类似物处理24小时，同时设置空白组、阳性对照组

2）提蛋白

3）蛋白定量：采用BCA蛋白定量法

4）SDS-PAGE 原理根据不同蛋白质所带电荷量不同，通过电场强度将不同分子量的蛋白质分开。然后将分离的蛋白质转移到PVDF膜上，通过共价键的形式吸附蛋白质，并不会破坏蛋白质多肽的生物学活性。再将转移到膜上的蛋白质作为抗原，将对应的抗体与抗原结合4℃过夜或者室温两小时。与HRP标记的第二抗体室温结合1小时，经过底物显色可检测目的蛋白的表达。

4.实验结果

结果如图7所示，石斛素类似物显著增加结肠癌SW480细胞中PARP蛋白的剪切，并呈浓度依赖性。

最后说明的是，以上优选实施例仅用于说明本发明的技术方案而非限制，尽管通过上述优选实施例已经对本发明进行了详细的描述，但本领域技术人员应当理解，可以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离本发明权利要求书所限定的范围。