抗-四次穿膜蛋白33药剂及其组合物以及制备和使用方法
文献发布时间：2023-06-19 09:47:53
本专利申请要求于2018年4月6日提交的名称为ANTI-TETRASPANIN 33AGENTS ANDCOMPOSITIONS AND METHODS FOR MAKING AND USING THE SAME，提名Juan E.MOYRON-QUIROZ等人作为发明人并且代理人案号指定为BLD-0110-PV的美国临时专利申请号62/653,898的权益。前述申请的全部内容(包括所有文本、表格和附图)通过引用并入本文。
技术领域
本发明涉及结合四次穿膜蛋白(Tetraspanin)33(TSPAN33)及其变体的药剂(agents)，特别涉及在生理条件下与TSPAN33特异性反应的单克隆抗体、抗体片段和抗体衍生物。通过递送含有此类试剂的药物组合物或其他组合物，此类药剂可以用于治疗和/或预防各种疾病或障碍。
背景技术
以下描述包括可用于理解本发明的信息。并非承认本文提供的任何信息或本文明确或隐含引用的任何出版物是现有技术，或甚至与当前要求保护的发明特别相关。
TSPAN33是四跨膜超家族(transmembrane 4 superfamily，TM4SF)蛋白的成员，具有四个跨膜结构域和细胞内N末端和C末端。该家族的所有成员还表达两个胞外结构域环。一个环(EC1)非常短，而第二个(EC2)相对长。EC2结构域的特征还在于四个或更多个半胱氨酸氨基酸残基。
四次穿膜蛋白家族成员与其他四次穿膜蛋白以及与在细胞生物学中具有多种功能的其他跨膜和细胞内分子的库集(repertoire)相关，例如Charrin等人,J.Cell.Sci.127:3641–3648(2014)。这些相互作用既可以是直接的也可以是间接的，并且四次穿膜蛋白可以调节伴侣蛋白的功能。并且，四次穿膜蛋白能够通过协调信号分子的接近来调节细胞内信号通路。因此，术语“四次穿膜蛋白网”已用于反映可由四次穿膜蛋白家族成员介导的蛋白质-蛋白质相互作用的复杂性。此外，已知四次穿膜蛋白分子占据细胞膜内的特定区域，或“岛”，产生术语“四次穿膜蛋白富集的微结构域”。通过以特定的方式协调几种蛋白质的组装和信号传导，四次穿膜蛋白能够在许多细胞过程(诸如粘附、活化、转移、蛋白水解和病毒感染)中发挥关键作用。
TSPAN33在整个人体中的表达受到严格限制，例如Luu等人,Clin Immunol.149:388–399(2013)和Heikens and Tsai,Blood,109:3244–3252(2007)。在B淋巴细胞系内TSPAN33仅在活化的原代B淋巴细胞上表达。这与CD19和CD20不同，这两种蛋白是在所有人类B细胞上表达的表型标记。TSPAN33还在霍奇金淋巴瘤和弥漫性大B细胞淋巴瘤中高度表达，并且在用作B细胞活化和分化模型的人类伯基特淋巴瘤细胞系中上调。TSPAN33表达在获得自人类风湿性关节炎和系统性红斑狼疮患者的血细胞中也上调，这两种疾病中活化的B细胞促进病理。在这些各种疾病状态下，TSPAN33的这些限制性表达谱使TSPAN33成为用于药物靶向以特异性地降低活化B细胞对病理的影响的有吸引力的分子。
TSPAN33在人体中表达的另一个主要位点是在肾脏中。具体地，TSPAN33在近端和远端小管的上皮细胞上表达，但不在肾小球中表达。这种受限制的肾脏表达使肾脏内的TSPAN33分子不能接近可能与TSPAN33反应的治疗性抗体，因为血源性抗体太大而无法通过肾小球屏障并进入表达TSPAN33的小管。TSPAN33还在骨髓中的小红细胞祖细胞群上表达。TSPAN33敲除小鼠(TSPAN33-/-)表明TSPAN33在正常红细胞生成中起作用，但是TSPAN33的丧失对这些动物没有致死性，例如Heikens and Tsai,Blood,109:3244–3252(2007)。
现在有几种治疗性抗体可用于治疗淋巴瘤。利妥昔单抗(rituximab)(抗-CD20)是第一个批准的抗体治疗剂。CD20蛋白在所有成熟的外周B细胞上表达并且消除该群体引起患者中的机会性感染风险。携带细胞毒性有效载荷的第二代抗-CD20抗体现在可用。实例包括替伊莫单抗(ibritumomab)、具有放射性钇(Y-90)缀合物的抗-CD20、和托西莫单抗(tositumomab)、具有放射性碘(I-131)缀合物的抗-CD20。本妥昔单抗(brentuximab)识别在霍奇金淋巴瘤细胞上表达的CD30分子，但是当本妥昔单抗被治疗性使用时，CD30在T细胞和B细胞上的表达导致严重感染的增加。利妥昔单抗(抗-CD20)已成功用于治疗类风湿性关节炎。对于系统性红斑狼疮的治疗，靶向B细胞功能诸如BlyS(B淋巴细胞刺激因子)蛋白的疗法已成功减轻了症状。这暗示消除活化的B细胞的抗体(诸如靶向TSPAN33的抗体)可能是成功的疗法。
由于TSPAN33的潜在严重副作用(诸如由于消除所有产生免疫球蛋白的细胞而增加的危及生命的感染的风险)的降低，与抗-CD20和抗-CD30抗体相比，TSPAN33对活化的B细胞和某些淋巴瘤的更限制性表达使其成为有吸引力的替代治疗靶。
由于人类TSPAN33和小鼠或大鼠TSPAN33之间的序列同源性大于97％，因此难以产生单克隆抗体。由于小鼠和大鼠是单克隆抗体的最常见来源，因此这种高度的同源性降低了啮齿类对人类蛋白免疫原引发免疫反应的可能性。进行了多次尝试，且由于许多克隆不能与活化的但非静息的B细胞和B细胞淋巴瘤反应，因而其被排斥。
本文描述了针对TSPAN33的特定单克隆抗体，以及也结合TSPAN33的此类抗体的抗原结合片段。这些抗体(及其TSPAN33结合片段)不会与静息人类B细胞发生明显反应，但会与活化的人类B细胞、人类淋巴瘤细胞系以及霍奇金淋巴瘤组织样品(而非非霍奇金淋巴瘤样品)反应。
“受体人框架”是指包含衍生自如本文定义的人免疫球蛋白框架或人共有框架的重链可变结构域(VH)框架或轻链可变结构域(VL)框架的氨基酸序列的框架。“衍生自”人免疫球蛋白框架或人共有框架的受体人框架可包含其相同的氨基酸序列，或其可含有氨基酸序列变化。在一些实施方案中，框架氨基酸变化的数目为10个或更少、9个或更少、8个或更少、7个或更少、6个或更少、5个或更少、4个或更少、3个或更少、或2个或更少。在一些实施方案中，VH和/或VL受体人框架在序列上与VH和/或VL人免疫球蛋白框架氨基酸序列或人共有框架氨基酸序列相同。
“框架”或“FR”是指除了高变区(HVR)残基之外的可变结构域残基。可变结构域的FR通常由四个FR结构域组成：FR1；FR2；FR3；和FR4。因此，HVR和FR序列通常以以下顺序出现在VH(或VL)中：FR1-H1(L1)-FR2-H2(L2)-FR3-H3(L3)-FR4。
“人共有框架”是代表在人免疫球蛋白VL或VH框架序列的选择中最常见的氨基酸残基的框架。通常，人免疫球蛋白VL或VH序列的选择来自可变结构域序列的亚组。通常，序列的亚组是如Kabat等人,Sequences of Proteins of Immunological Interest,第五版,NIH Publication 91-3242,Bethesda Md.(1991),第1-3卷中的亚组。在一些实施方案中，对于VL，亚组是如Kabat等人(同上)中的κI亚组。在一些实施方案中，对于VH，亚组是如Kabat等人(同上)中的III亚组。
如本文所用，术语“高变区”或“HVR”是指抗体可变结构域的每个区域，其在序列上高变和/或形成结构上限定的环(“高变环”)。通常，天然四链抗体包含六个HVR；3个在VH(H1、H2、H3)中，以及3个在VL(L1、L2、L3)中。HVR通常包含来自高变环和/或来自“互补决定区”(CDR)的氨基酸残基，后者具有最高的序列可变性和/或参与抗原识别。示例性高变环出现在氨基酸残基26-32(L1)、50-52(L2)、91-96(L3)、26-32(H1)、53-55(H2)和96-101(H3)处。参见Chothia and Lesk,J.Mol.Biol.196:901-917(1987)。相反，如Kabat等人,Sequences of Proteins of Immunological Interest,第五版.Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,Md.(1991)所描述，示例性CDR(CDR-L1、CDR-L2、CDR-L3、CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3)出现在L1的氨基酸残基24-34、L2的氨基酸残基50-56、L3的氨基酸残基89-97、H1的氨基酸残基31-35B、H2的氨基酸残基50-65、以及H3的氨基酸残基95-102。除VH中的CDR1外，CDR通常包含形成高变环的氨基酸残基。CDR还包含“特异性决定残基”或“SDR”，其为与特定抗原接触的残基。除非另外指明，否则可变结构域中的HVR残基和其他残基(例如FR残基)在本文中根据Kabat等人(同上)编号。
术语“可变区”或“可变结构域”是指参与抗体与抗原结合的抗体重链或轻链的结构域。天然抗体的重链和轻链的可变结构域(分别为VH和VL)通常具有相似的结构，每个结构域包含四个保守框架区(FR)和三个高变区(HVR)。参见例如Kindt等人.KubyImmunology,第6版,W.H.Freeman and Co.,第91页(2007)。单个VH或VL结构域可能足以赋予抗原结合特异性。此外，可使用结合特定抗原的抗体的VH或VL结构域分别筛选互补VL或VH结构域的文库来分离结合所述抗原的抗体。参见例如Portolano等人,J.Immunol.150:880-887(1993)；Clarkson等人,Nature 352:624-628(1991)。
“亲和力”是指分子(例如抗体)的单个结合位点与其结合配偶体(例如抗原)之间的非共价相互作用的总和的强度。除非另外指明，否则“结合亲和力”是指固有结合亲和力，其反映结合对的成员(例如抗体和抗原)之间的1：1相互作用。分子X对其配偶体Y的亲和力通常可由解离常数(Kd)表示。亲和力可以通过本领域已知的常规方法测量，包括本文所述的那些。本文其他地方描述了用于测量结合亲和力的具体说明性和示范性实施方案。在一些情况下，本文的抗体以高亲和力例如以不超过约1×10
“亲和力成熟的”抗体是指与不具有这种改变的亲本抗体相比，在一个或多个高变区(HVR)中具有一个或多个改变的抗体。优选地，这种改变导致抗体对其靶抗原的亲和力提高。
术语“抗-TSPAN33药剂”是指这样的分子，其是或包含一种或多种抗-TSPAN33抗体、TSPAN33结合抗体片段或TSPAN33结合抗体衍生物。
术语“抗-TSPAN33抗体”和“结合TSPAN33的抗体”是指能够以足够的亲和力结合TSPAN33使得该抗体在靶向TSPAN33中用作诊断剂和/或治疗剂的抗体。在一些实施方案中，例如如通过放射免疫测定法(RIA)或通过Scatchard分析或通过表面等离子共振(诸如如Biacore)所测量的，抗-TSPAN33抗体(或其抗原结合片段)与不相关的、非TSPAN33蛋白的结合程度小于所述抗体与TSPAN33的结合的约10％。在某些实施方案中，与TSPAN33结合的抗体具有0.1μM、100nM、10nM、1nM、0.1nM、0.01nM或0.001nM(例如10
本文中的术语“抗体”以最广义使用，并且涵盖各种抗体结构，包括但不限于，单克隆抗体、多克隆抗体、多特异性抗体(例如双特异性抗体)和抗体片段，只要它们表现出所需的抗原结合活性。
“抗体衍生物”是指除完整抗体之外的分子，其包含衍生自完整抗体(或其抗原结合片段)的部分并且其结合完整抗体(或其抗原结合片段)所结合的抗原。抗体衍生物的实例包括但不限于单链可变片段(scFv)，双抗体，三抗体等，包含多个抗原结合抗体片段、单链可变片段、双抗体、三抗体等的适配体、。
“抗体片段”或“抗原结合抗体片段”是指除完整抗体之外的分子，其包含与完整抗体所结合的抗原结合的完整抗体的一部分。抗体片段的实例包括但不限于Fv、Fab、Fab′、Fab′-SH、F(ab')2和由抗体片段形成的多特异性抗体。
术语“全长抗体”、“完整抗体”和“整个抗体”在本文中可互换使用，是指具有基本上与天然抗体结构类似的结构或具有含有如本文定义的Fc区的重链的抗体。
本文中的术语“Fc区”用于定义含有恒定区的至少一部分的免疫球蛋白重链的C末端区域。该术语包括天然序列Fc区和变体Fc区。在一个实施方案中，人IgG重链Fc区从Cys226或从Pro230延伸至重链的羧基端。然而，Fc区的C末端赖氨酸(Lys447)可存在或不存在。除非在本文中另有说明，否则Fc区或恒定区中的氨基酸残基的编号是根据EU编号体系(也称为EU索引)进行的，如Kabat等人,Sequences of Proteins of ImmunologicalInterest,第5版.Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,Md.,1991中所述。
与参考抗体(例如结合TSPAN33的抗体)“结合相同表位的抗体”是指在竞争试验中阻断参考抗体与其抗原的结合达50％或更多的抗体，并且反过来，在竞争试验中，参考抗体将所述抗体与其抗原的结合阻断达50％或更多。
术语“嵌合”抗体是指其中重链和/或轻链的一部分衍生自特定来源或物种，而重链和/或轻链的其余部分衍生自不同来源或物种的抗体。
“人抗体”是具有对应于由人或人细胞产生的或衍生自利用人抗体库集或其他人抗体编码序列的非人来源的抗体的氨基酸序列的抗体。人抗体的这一定义明确排除了包含非人抗原结合残基的“人源化”抗体。
“人源化”抗体是指包含来自非人HVR的氨基酸残基和来自人FR的氨基酸残基的嵌合抗体。在某些实施方案中，人源化抗体将包含基本上至少一个、且通常两个可变结构域的所有，其中所有或基本上所有HVR(例如CDR)对应于非人抗体的那些，并且所有或基本上所有FR对应于人抗体的那些。人源化抗体任选地可包含衍生自人抗体的抗体恒定区的至少一部分。在一些实施方案中，当与受体框架区来源的抗体比对时，人源化抗体(或其抗原结合片段或衍生物)在所需位置包括一个或多个氨基酸取代(或缺失或插入)。在这样的实施方案中，在人(或其他)或其他FR中的特定位置处被取代(或插入或缺失)的氨基酸残基对应于亲本抗体(即CDR或HVR来源的非人抗体)中的相应位置处的氨基酸残基。抗体的“人源化形式”例如非人抗体是指已经过人源化的抗体。
如本文所用，术语“抗体药物缀合物”(ADC)相当于术语“免疫缀合物”，并且表示优选类别的药剂-药物缀合物。在此，“药剂-药物缀合物”是与一种或多种异源分子(包括但不限于细胞毒性药剂)缀合的抗-TSPAN33药剂(例如抗-TSPAN33抗体或TSPAN33结合片段或其衍生物)。
如本文所用，术语“细胞毒性药剂”是指抑制或防止细胞功能和/或引起细胞死亡或破坏的物质。细胞毒性药剂包括但不限于放射性同位素(例如At
“诊断试剂”是指用于进行诊断测定的化合物，例如靶特异性抗体(或其抗原结合)。
“效应子功能”是指可归因于抗体Fc区的那些生物活性，其随着抗体同种型而变化。抗体效应子功能的实例包括：C1q结合和补体依赖性细胞毒性(CDC)；Fc受体结合；抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)；吞噬作用；细胞表面受体(例如B细胞受体)下调；以及B细胞活化。
药剂(例如药物制剂)的“有效量”是指在必要的剂量和时间段有效实现所需治疗或预防结果的量。
术语“表位”是指抗体结合的抗原分子上的特定位点。
术语“宿主细胞”、“宿主细胞系”和“宿主细胞培养物”可互换使用，并且是指已经引入外源核酸的细胞，包括此类细胞的后代。宿主细胞包括“转化体”和“转化的细胞”，其包括原代转化细胞和从其衍生的后代，而与传代次数无关。后代的核酸含量可能与亲代细胞不完全相同，但可能含有突变。具有在原始转化的细胞中筛选或选择的相同功能或生物活性的突变后代包括在本文中。
“兔抗体”具有氨基酸序列的抗体，该氨基酸序列相应于兔或兔细胞产生的或衍生自利用兔抗体库集或其他兔抗体编码序列的非兔来源的抗体的氨基酸序列。
“免疫缀合物”是与一种或多种异源分子(包括但不限于细胞毒性药剂)缀合的抗体(或其抗原结合片段或衍生物)。免疫缀合物相当于术语“抗体药物缀合物”(ADC)。
“个体”或“患者”或“受试者”是哺乳动物。哺乳动物包括但不限于家养动物(例如牛、绵羊、猫、犬和马)，灵长类(例如人和非人灵长类诸如猴)、兔和啮齿动物(例如小鼠和大鼠)。在某些实施方案中，个体或受试者是人。
“分离的”分子是已经与其天然环境的组分分离的分子。在一些实施方案中，例如，通过例如电泳(例如SDS-PAGE、等电聚焦(IEF)、毛细管电泳)或色谱法(例如离子交换或反相HPLC)测定的，将抗体纯化至大于95％或99％的纯度。分离的核酸包括包括在细胞中的核酸分子，该细胞通常含有该核酸分子，但该核酸分子存在于染色体外或存在于与其天然染色体位置不同的染色体位置。
在一些情况下，“分离的”分子(例如核酸、抗体)是指已经从其原始环境(例如天然环境，如果它是天然的；或宿主细胞，如果它是外源表达的)的组分中分离的分子，并且因此通过人为干预(例如，“由人之手”)从其原始环境中改变。在一些实施方案中，例如，通过例如电泳(例如SDS-PAGE、等电聚焦(IEF)、毛细管电泳)或色谱法(例如离子交换或反相HPLC)测定的，将抗体纯化至大于95％或99％的纯度。分离的核酸是指含在细胞中的核酸分子，该细胞通常含有该核酸分子，但该核酸分子存在于染色体外或存在于不同于其天然染色体位置的染色体位置。在一些实施方案中，可以给分离的核酸提供比来源样品中存在的组分的量更少的非核酸组分(例如蛋白质、脂质)。包含分离的核酸的组合物可以是约50％至大于99％不含非核酸组分。包含分离的核酸的组合物可为约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或大于99％不含非核酸组分。
“编码抗-TSPAN33抗体的分离的核酸”是指编码抗体重链和轻链(或其片段)的一种或多种核酸分子，包括在单个载体或单独载体中的这种核酸分子，并且这种核酸分子存在于重组宿主细胞中的一个或多个位置。
如本文所用，术语“TSPAN33”是指由细胞中的TSPAN33前体蛋白的处理所产生的任何天然的、成熟的TSPAN33。除非另有说明，该术语包括来自任何脊椎动物来源的TSPAN33，该脊椎动物来源包括哺乳动物诸如灵长类(例如人和短尾猴或恒河猴)和啮齿类动物(例如小鼠和大鼠)。该术语还包括天然的TSPAN33变体，例如剪接变体或等位基因变体。示例性人TSPAN33前体蛋白的氨基酸序列描述于PCT/US2013/077273(WO2014/100746)及其相应的美国国家阶段申请，美国专利申请序列号14/653,572(公开号US2016/0237152)。
人前体TSPAN33的示例性氨基酸序列由GENBANK登记号NP_848657.1鉴定，并提供如下：
MARRPRAPAASGEEFSFVSPLVKYLLFFFNMLFWVISMVMVAVGVYARLMKHAEAALACLAVDPAILLIVVGVLMFLLTFCGCIGSLRENICLLQTFSLCLTAVFLLQLAAGILGFVFSDKARGKVSEIINNAIVHYRDDLDLQNLIDFGQKKFSCCGGISYKDWSQNMYFNCSEDNPSRERCSVPYSCCLPTPDQAVINTMCGQGMQAFDYLEASKVIYTNGCIDKLVNWlHSNLFLLGGVALGLAIPQLVGILLSQILVNQIKDQIKLQLYNQQHRADPWY(SEQ ID NO：47)
术语“TSPAN33阳性细胞”是指在其表面上表达TSPAN33的任何细胞。一些细胞(包括与一些癌症类型和肿瘤相关的那些)表现出TSPAN33表达的上调。
术语“单克隆抗体”是指从基本上同质的抗体群体获得的抗体，即包含该群体的各个抗体是相同的(如在Ig重链和/或轻链氨基酸序列的水平上所评估的)和/或结合相同表位，除了可能的变体抗体外，例如含有天然产生的突变或在单克隆抗体制剂的生产中产生的变体抗体(这种变体通常以微量存在)。与通常包括针对不同决定簇(表位)的不同抗体的多克隆抗体制剂相反，单克隆抗体制剂的每种单克隆抗体针对抗原上的单一决定簇。因此，修饰语“单克隆”表示抗体的特征为从基本上同质的抗体群体获得，且不应解释为需要通过任何特定方法产生抗体。例如，根据本发明使用的单克隆抗体可通过多种技术制造，包括但不限于杂交瘤方法、重组DNA方法、噬菌体展示方法和利用含有全部或部分人免疫球蛋白基因座的转基因动物的方法，此类方法和用于制造单克隆抗体的其他示例性方法在本文中进行了描述。
术语“包装插页”用于指通常包括在治疗产品的商业包装中的说明书，其含有关于使用此类治疗产品的适应症、用法、剂量、施用、联合疗法、禁忌症和/或警告的信息。
相对于参考多肽序列的“百分比(％)氨基酸序列相同性”被定义为在比对序列和引入缺口(如果需要)以实现最大百分比序列相同性且不考虑任何保守取代作为序列相同性的一部分之后，候选序列中与参考多肽序列中的氨基酸残基相同的氨基酸残基的百分比。用于确定百分比氨基酸序列相同性目的的比对可以通过各种方法实现，这在本领域技术人员能力范围内，例如使用公众可获取的计算机软件如BLAST、BLAST-2、ALIGN或Megalign(DNASTAR)软件。本领域技术人员可以确定用于比对序列的适当参数，包括在所比较的全长序列上实现最大比对所需的任何算法。
术语“药物组合物”是指这样的制剂，其为允许包含在其中的活性成分的有效生物活性的形式，并且其不包含对施用该制剂的受试者不可接受地毒性的其他组分。
“药学上可接受的载体”是指药物制剂中除了活性成分之外的对受试者无毒的成分。药学上可接受的载体包括但不限于缓冲剂、赋形剂、稳定剂或防腐剂。
如本文所用，“治疗(treatment)”(及其语法上的变化形式例如“治疗(treat)”或“治疗(treating)”)是指试图改变所治疗个体的自然病程的临床干预，并且可以用于预防或在临床病理过程中进行。所需的治疗效果包括但不限于预防疾病的发生或复发、减轻症状、减轻疾病的任何直接或间接病理结果、预防转移、降低疾病进展速率、改善或缓解疾病状态和缓和或改善预后。在一些实施方案中，本发明的抗体用于延迟疾病的发展或减缓疾病的进展。
术语“载体”是指能够增殖与其连接的另一核酸的核酸分子。该术语包括作为自我复制核酸结构的载体以及整合至已导入该载体的宿主细胞的基因组中的载体。某些载体能够指导与其可操作连接的核酸的表达。此类载体在本文中称为“表达载体”。
发明内容
本发明提供了抗-TSPAN33药剂，包括抗-TSPAN33抗体、与TSPAN33结合的抗体片段、此类抗体和抗体片段的衍生物和变体(包括免疫缀合物、标记的抗体和抗原结合抗体片段等)，及其制备和使用方法。
在某些方面，本文提供了一种在实验室或生理条件下与四次穿膜蛋白33(TSPAN33)结合的抗-TSPAN33药剂，其中所述药剂包含至少一个免疫球蛋白重链可变结构域和至少一个免疫球蛋白轻链可变结构域，其中：a)所述抗-TSPAN33药剂的每个免疫球蛋白重链可变结构域包含第一、第二和第三重链互补决定区(CDR)，其中所述第一重链CDR(CDRH1)包含与氨基酸序列X
在某些方面还提供了在实验室或生理条件下与四次穿膜蛋白33(TSPAN33)结合的第一抗-TSPAN33药剂，其中该第一药剂与第二抗-TSPAN33药剂竞争性结合或能够与第二抗-TSPAN33药剂竞争性结合，其中该第二药剂为本文所述的抗-TSPAN33药剂。
在某些方面还提供了在实验室或生理条件下与四次穿膜蛋白33(TSPAN33)结合的第一抗-TSPAN33药剂，其中该第一药剂与第二抗-TSPAN33药剂结合或能够结合相同表位，其中该第二药剂为本文所述的抗-TSPAN33药剂。
在一个方面，本发明提供在生理条件下与四次穿膜蛋白33(TSPAN33)结合的分离的、非天然存在的抗-TSPAN33药剂，特别是抗体或其抗原结合片段或衍生物。在抗-TSPAN33抗体或抗原结合片段的情况下，此类分子通常包含两个免疫球蛋白重链可变结构域和两个免疫球蛋白轻链可变结构域。在此类分子中，每个免疫球蛋白重链和轻链可变结构域包含如下排列的第一、第二和第三链互补决定区(CDR)：FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4。
在重链可变结构域部分中，第一重链CDR包括与氨基酸序列DYYMT(SEQ ID NO：1)具有至少65％的序列相同性、任选地至少80％、至少90％、至少95％和100％的序列相同性的氨基酸序列，第二重链CDR包括与FIRNKANGYTTEYSASVKG(SEQ ID NO：2)具有至少65％的序列相同性、任选地至少80％、至少90％、至少95％和100％的序列相同性的氨基酸序列，以及第三重链CDR包括与氨基酸序列YLQTGNFDY(SEQ ID NO：3)具有至少65％的序列相同性、任选地至少80％、至少90％、至少95％和100％的序列相同性的氨基酸序列。
在轻链可变结构域部分中，第一轻链CDR包括与氨基酸序列RASQDISNFLN(SEQ IDNO：5)具有至少65％的序列相同性、任选地至少80％、至少90％、至少95％和100％的序列相同性的氨基酸序列，第二轻链CDR包括与氨基酸序列FTSRLHS(SEQ ID NO：6)具有至少65％的序列相同性、任选地100％的序列相同性的氨基酸序列，以及第三轻链CDR包括与氨基酸序列QQGYTVPPT(SEQ ID NO：7)具有至少65％的序列相同性、任选地至少80％、至少90％、至少95％和100％的序列相同性的氨基酸序列。
在一些优选的实施方案中，分离的、非天然存在的抗-TSPAN33抗体或其TSPAN33结合片段包括具有氨基酸序列DYYMT(SEQ ID NO：1)的第一重链CDR，第二重链CDR具有氨基酸序列FIRNKANGYTTEYSASVKG(SEQ ID NO：2)，第三重链CDR具有氨基酸序列YLQTGNFDY(SEQID NO：3)，第一轻链CDR具有氨基酸序列RASQDISNFLN(SEQ ID NO：5)，第二轻链CDR具有氨基酸序列FTSRLHS(SEQ ID NO：6)以及第三轻链CDR具有氨基酸序列QQGYTVPPT(SEQ ID NO：7)。
在一些优选的实施方案中，分离的、非天然存在的抗-TSPAN33抗体或其TSPAN33结合片段包括其中免疫球蛋白重链可变结构域与氨基酸序列EVKLVESGGGLVQPGGSLSLSCAASGFTFTDYYMTWVRQPPGKALEWLVFIRNKANGYTTEYSASVKGRFTISRDNSQSILYLQMNALRAEDSATYYCARYLQTGNFDYWGQGTTLTVSS(SEQ ID NO：4)具有至少65％序列相同性，任选地至少80％、至少90％、至少95％和100％的序列相同性的氨基酸序列以及免疫球蛋白轻链可变结构域包括与氨基酸序列EIQMIQTTSSLTASLGDRVTISCRASQDISNFLNWYQQKPDGTIKLLIYFTSRLHSGVPSRFSGSGSGTDYSLTISNLEQEDIATYFCQQGYTVPPTFGGGTKLEIK(SEQ ID NO：8)具有至少65％的序列相同性，任选地具有至少80％、至少90％、至少95％和100％的序列相同性的氨基酸序列的那些。
在一些实施方案中，抗体或其抗原结合抗体片段为单克隆抗体，并且可以为骆驼、人、人源化、小鼠、兔或其他哺乳动物抗体或抗原结合抗体片段。在一些实施方案中，抗体(或抗原结合抗体片段)为IgG。在其他实施方案中，IgG为IgGl、IgG2a或IgG2b，或IgG3或IgG4。
在完全人抗体(即从能够产生全部或部分人抗体库集的哺乳动物产生或衍生的抗体)以外的抗-TSPAN33抗体和抗原结合抗体片段的某些优选实施方案中，这些分子为嵌合或人源化的抗-TSPAN33抗体和抗原结合抗体片段。
在一些优选的实施方案中，抗-TSPAN33抗体、抗原结合抗体片段或其衍生物或变体包括可检测标记。
在一些优选的实施方案中，抗-TSPAN33抗体、抗原结合抗体片段或其衍生物或变体为免疫缀合物的一部分，该免疫缀合物还包括细胞毒性剂，例如核酸、肽、多肽、小分子或适体。
本发明的相关方面涉及包括根据本发明的分离的、非天然存在的抗-TSPAN33抗体或和抗原结合抗体片段的组合物。除了含有本发明的抗-TSPAN33抗体或和抗原结合抗体片段之外，此类组合物通常还包括载体，优选药学上可接受的载体。药学上可接受的载体可包括溶剂、分散介质、包衣、抗细菌剂和抗真菌剂、等渗剂和吸收延迟剂等。短语“药学上或药理学上可接受的”通常是指当施用于动物或人时不产生不利的、过敏或其他不良反应的分子实体和组合物。也可将补充活性成分掺入组合物中。
此类组合物优选包装在容器中，其在许多优选的实施方案中进一步包装在试剂盒中，该试剂盒还包括使用说明书。在药物组合物的上下文中，此类试剂盒说明书是包装插页，其不仅含有使用说明书，而且含有关于药物活性成分(例如抗-TSPAN33抗体、抗原结合抗体片段，或其衍生物或变体)的信息。
另一相关方面涉及经配置以检测生物样品(通常为取自受试者的生物样品)中的TSPAN33的诊断剂。这种试剂盒包括根据本发明的抗-TSPAN33抗体、抗原结合抗体片段或其衍生物或变体，其与可检测试剂(例如荧光团或酶底物)缀合和/或固定在固体支持物上。
本发明的其他方面涉及根据本发明的抗-TSPAN33抗体、抗原结合抗体片段或其衍生物或变体的生产。一个此类方面涉及编码本发明多肽的分离的核酸分子。在一些实施方案中，此类核酸编码免疫球蛋白重链可变结构域，其具有包括与氨基酸序列DYYMT(SEQ IDNO：1)具有至少65％的序列相同性、任选地至少80％、至少90％、至少95％和100％的序列相同性的氨基酸序列的第一重链CDR，包括与氨基酸序列FIRNKANGYTTEYSASVKG(SEQ ID NO：2)具有至少65％的序列相同性、任选地至少80％、至少90％、至少95％和100％的序列相同性的氨基酸序列的第二重链CDR，以及包括与氨基酸序列YLQTGNFDY(SEQ ID NO：3)具有至少65％的序列相同性、任选地至少80％、至少90％、至少95％和100％的序列相同性的氨基酸序列的第三重链CDR。此类核酸还优选地编码免疫球蛋白轻链可变结构域，其中第一轻链CDR包括与氨基酸序列RASQDISNFLN(SEQ ID NO：5)具有至少65％的序列相同性、任选地至少80％、至少90％、至少95％和100％的序列相同性的氨基酸序列，第二轻链CDR包括与氨基酸序列FTSRLHS(SEQ ID NO：6)具有至少65％的序列相同性、任选地100％的序列相同性的氨基酸序列，以及第三轻链CDR包括与氨基酸序列QQGYTVPPT(SEQ ID NO：7)具有至少65％的序列相同性、任选地至少80％、至少90％、至少95％和100％的序列相同性的氨基酸序列。
在某些优选的实施方案中，本发明的核酸分子编码免疫球蛋白重链可变结构域以及免疫球蛋白轻链可变结构域，该免疫球蛋白重链可变结构域具有与氨基酸序列EVKLVESGGGLVQPGGSLSLSCAASGFTFTDYYMTWVRQPPGKALEWLVFIRNKANGYTTEYSASVKGRFTISRDNSQSILYLQMNALRAEDSATYYCARYLQTGNFDYWGQGTTLTVSS(SEQ ID NO：4)具有至少65％的序列相同性、任选地具有至少80％、至少90％、至少95％和100％的序列相同性的氨基酸序列，该免疫球蛋白轻链可变结构域具有与氨基酸序列EIQMIQTTSSLTASLGDRVTISCRASQDISNFLNWYQQKPDGTIKLLIYFTSRLHSGVPSRFSGSGSGTDYSLTISNLEQEDIATYFCQQGYTVPPTFGGGTKLEIK(SEQ ID NO：8)具有至少65％的序列相同性、任选地具有至少80％、至少90％、至少95％和100％的序列相同性的氨基酸序列。
相关方面涉及携带本发明核酸的质粒、及表达盒和载体，以及用这种核酸分子转染的重组宿主细胞。
本发明的其他方面涉及治疗或预防与异常水平的四次穿膜蛋白33(TSPAN33)相关的疾病或病症的方法。此类方法包括以足以实现治疗的量向需要这种治疗的受试者施用抗-TSPAN33抗体、抗原结合抗体片段或其衍生物或变体，从而治疗或预防该疾病或病症。可如此治疗的此类疾病和病症包括白血病；淋巴瘤，任选地，霍奇金病、非霍奇金淋巴瘤、弥漫性大B细胞淋巴瘤和伯基特淋巴瘤；以及自身免疫性疾病，任选地，类风湿性关节炎。
从下面的详细描述、附图和权利要求，本发明的前述和其他方面将变得更加明显。
除非另有定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同的含义。尽管在本发明的实践或测试中可以使用与本文所述的那些类似或相当的方法和材料，但是下面描述了合适的方法和材料。本文提及的所有出版物、专利申请、专利和其他参考文献通过引用整体并入本文。在发生冲突的情况下，以本说明书(包括定义)为准。另外，材料、方法和实例仅是说明性的，并不旨在限制技术。
在以下描述、实例、权利要求和附图中进一步描述了某些实施方案。
附图说明
这些附图示出了该技术的某些实施方案，以及不是限制性的。为了清楚和便于说明，附图不是按比例绘制的，并且在一些情况下，可以夸大或放大示出各个方面，以便于理解特别实施方案。
下面提供了本说明书中描述的每个附图和表格的简要概述，作为本文描述的各种核苷酸和氨基酸序列的列表。
图1和图2示出了以下实施例2中描述的实验的细胞图(cytogram)。简单地说，将人外周血液淋巴细胞用重组人CD40L加IL-4刺激过夜，并与CD20 APC和纯化的小鼠IgG2b、k同种型对照(图1)或根据本发明的纯化的鼠单克隆抗-TSPAN33抗体(图2)染色，然后用抗小鼠IgG PE染色。
图3显示了对TSPAN33克隆的可变重链(VH)和可变轻链(VL)序列分析。Clustal X用于该分析。根据Clustal X：在此分析中使用了三个字符(“*”、“：”和“.”)：“*”表示具有单个完全保守残基的位置。*：″表示以下“强”'组中的一个是完全保守的：STA、NEQK、NHQK、NDEQ、QHRK、MILV、MILF、HY或FYW；“.”表示以下“更弱”组中的一个是完全保守的：CSA、ATV、SAG、STNK、STPA、SGND、SNDEQK、NDEQHK、NEQHRK、FVLIM或HFY。这些都是出现在Gonnet Pam250矩阵中的阳性评分组。强和弱组定义为强得分>0.5，弱得分＝<0.5。空白是与上述三种情况不匹配的那些。
图4显示散点图，其显示在以下实施例5中描述的实验中用于通过流式细胞术检测TSPAN33的门控策略。
图5A和图5B显示了TSPAN33在来自外周血液的静息PBMC上的表达(左)、在无刺激的情况下过夜培养的PBMC上的表达(中)，或用CD40L(TNFSF5)加IL-4活化过夜的PBMC上的表达(右)。数据是在淋巴细胞(FSC
图6A和图6B显示TSPAN33在来自外周血液的静息PBMC上的表达(左)、在无刺激的情况下培养过夜的PBMC上的表达(中)，或用CD40 L(TNFSF5)加IL-4活化过夜的PBMC上的表达(右)。直方图代表单核细胞，其通过FSC
图7A和图7B显示用不同的抗-TSPAN33抗体阻断用CD40L(TNFSF5)加IL-4活化的PBMC上的TSPAN33的染色。第一列表示用于染色细胞的抗体，第二列表示用于阻断染色的抗体；括号中的数字表示B细胞在用所示抗体封闭和染色后的中值荧光强度。黑色直方图对应于仅用同种型对照抗体染色的B细胞，虚线标记这些细胞的中值荧光；灰色直方图显示测试抗体的染色而没有任何阻断。在淋巴细胞(FSC
图8A和图8B显示用不同的抗-TSPAN33抗体阻断TSPAN33在用CD40L(TNFSF5)加IL-4活化的PBMC上的染色。第一列表示用于染色细胞的抗体，第二列表示用于阻断染色的抗体；括号中的数字表示在用所示抗体封闭和染色后单核细胞的中值荧光强度。黑色直方图对应于仅用同种型对照抗体染色的单核细胞，虚线标记了仅用同种型对照染色的单核细胞的中值荧光；灰色直方图显示测试抗体的染色而没有任何阻断。在单核细胞(FSC
图9显示了对用CD40L(TNFSF5)加IL-4培养过夜的B细胞的抗-TSPAN33阻断测定的总结。x轴表示用于阻断染色的抗体，以及柱表示用于染色细胞的抗体；虚线表示用同种型对照(小鼠IgG2b，κ)染色的活化B细胞的中值荧光。
图10显示了在用CD40L(TNFSF5)加IL-4培养过夜的单核细胞的抗-TSPAN33阻断测定的总结。x轴表示用于阻断染色的抗体，以及柱表示抗体染色单核细胞；虚线表示用同种型对照(小鼠IgG2b，κ)染色的单核细胞的平均荧光。
图11显示了在用CD40L(TNFSF5)加IL-4活化的PBMC上的抗-TSPAN33阻断测定的总结的表格。
抗体产生和表征
下文的实施例描述了从治疗角度考虑具有所需特性(包括对TSPAN33和/或其变体的结合亲和力)的抗-TSPAN33药剂，特别是抗-TSPAN33抗体的产生。抗体亲和力可以如下文实施例中所述来测定。优选地，抗体以高亲和力例如以不超过约1×10
除了对TSPAN33具有强结合亲和力的抗体之外，还期望从治疗角度选择具有其他有益特性的嵌合、人源化或变体抗体。例如，抗体可为改变肿瘤进展或降低自身免疫性疾病严重度的抗体。用于测定本发明的抗-TSPAN33抗体的活性的测定方法为基于细胞的ELISA(以测量抗体对细胞上的靶的相对亲和力)、流式细胞术(以测量抗体的细胞特异性)以及细胞毒性(以测量介导直接或间接杀伤表达TSPAN33的靶细胞如淋巴瘤系或自身反应性B细胞的潜能)。优选地，在向人类患者施用治疗有效量的抗体后，人源化或变体抗体不能引起免疫原性反应。如果引发免疫原性反应，优选该反应将使得抗体仍然为用其治疗的患者提供治疗益处。
在一些实施方案中，本文的抗-TSPAN33药剂(例如抗-TSPAN33抗体、人源化抗-TSPAN33抗体)结合相同的表位。根据本发明的一个实施方案，人源化的抗-TSPAN33抗体结合如本文所定义的表位。为了筛选与感兴趣抗体结合的TSPAN33上的表位结合的抗体(例如阻断抗体与TSPAN33结合的那些)，可以进行常规的交叉阻断测定，如Antibodies,ALaboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory,Ed Harlow and David Lane(1988)中所述。或者，可以进行表位作图以确定抗体是否结合感兴趣表位，例如Champe等人,J.Biol.Chem.270:1388-1394(1995),Cunningham and Wells,Science 244:1081–1085(1989)或Davidson和Doranz,Immunology 143:13–20(2014)中所述。
本文的抗体通常具有重链可变结构域，其包含由下式表示的氨基酸序列：FRH1-CDRH1-FRH2-CDRH2-FRH3-CDRH3-FRH4，其中“FRH1-4”表示抗-TSPAN33抗体可变重链结构域的四个重链框架区以及“CDRH1-3”表示抗-TSPAN33抗体可变重链结构域的三个高变区。本发明的抗体具有重链可变结构域，其包含由下式表示的氨基酸序列：FRH1-CDRH1-FRH2-CDRH2-FRH3-CDRH3-FRH4，其中“FRH1-4”表示抗-TSPAN33抗体可变重链结构域的四个重链框架区以及“CDRH1-3”表示抗-TSPAN33抗体可变重链结构域的三个高变区。FRH1-4可衍生自共有序列(例如人免疫球蛋白重链或轻链的类、亚类或亚组的最常见氨基酸)或者可衍生自个体人抗体框架区或者衍生自不同框架区序列的组合。例如Kabat等人(同上)中汇编了许多人抗体框架区序列。在一个实施方案中，如Kabat等人(同上)中汇编的人免疫球蛋白亚组的共有序列提供可变重链FR。
人可变重链FR序列可具有在其中的取代，例如其中人FR残基由相应的非人残基置换(由“相应的非人残基”是指当将人和非人序列比对时具有与感兴趣人残基相同的Kabat位置编号的非人残基)，但是用非人残基置换不是必需的。例如，可通过噬菌体展示选择相应非人残基以外的置换FR残基。
本文的抗体可具有轻链可变结构域，其包含由下式表示的氨基酸序列：FRL1-CDRL1-FRL2-CDRL2-FRL3-CDRL3-FRL4，其中“FRL1-4”表示抗-TSPAN33抗体可变轻链结构域的四个框架区以及“CDRL1-3”表示抗-TSPAN33抗体可变轻链结构域的三个高变区。本文优选实施方案的抗体具有轻链可变结构域，其包含由下式表示的氨基酸序列：FRL1-CDRL1-FRL2-CDRL2-FRL3-CDRL3-FRL4，其中“FRL1-4”表示抗-TSPAN33抗体可变轻链结构域的四个框架区以及“CDRL1-3”表示抗-TSPAN33抗体可变轻链结构域的三个高变区。FRL1-4可衍生自共有序列(例如人免疫球蛋白重链或轻链的类、亚类或亚组的最常见氨基酸)或者可衍生自个体人抗体框架区或者衍生自不同框架区序列的组合。在一个优选的实施方案中，如Kabat等人(同上)中汇编的人免疫球蛋白亚组的共有序列提供可变轻链FR。
人可变轻链FR序列可具有在其中的取代，例如其中人FR残基被相应的小鼠残基置换，但是用非人残基置换不是必需的。例如，可以通过噬菌体展示来选择相应非人残基以外的置换残基。下文更详细地阐述用于产生本文的感兴趣人源化抗-TSPAN33抗体的方法。
抗-TSPAN33药剂
本文提供了与四次穿膜蛋白33(TSPAN33)结合的药剂。此类药剂可被称为抗-TSPAN33药剂并且可以包括抗-TSPAN33抗体、抗-TSPAN33抗体片段(例如抗原结合片段)和抗-TSPAN33抗体衍生物。本文提及抗-TSPAN33抗体可包括抗-TSPAN33药剂、抗-TSPAN33抗体片段(例如抗原结合片段)和抗-TSPAN33抗体衍生物。术语药剂和抗体在本文中可互换使用。
在一些实施方案中，该药剂是分离的(例如与其天然环境的组分(例如动物、生物样品)分开)。在一些实施方案中，该药剂是非天然存在的(例如通过人干预产生的)。在一些实施方案中，该药剂为人源化抗体或其抗原结合片段。在一些实施方案中，该药剂为结合TSPAN33的人源化抗体的衍生物。在一些实施方案中，该药剂在实验室条件下结合TSPAN33(例如在体外结合TSPAN33、在流式细胞术测定中结合TSPAN33、在ELISA中结合TSPAN33、在体外结合分离的细胞上的TSPAN33、在流式细胞术测定中结合分离的细胞上的TSPAN33、在ELISA中结合分离的细胞上的TSPAN33)。在一些实施方案中，该药剂在生理条件下结合TSPAN33(例如结合受试者的细胞上的TSPAN33)。
通常，本文提供的抗-TSPAN33药剂包含至少一个免疫球蛋白重链可变结构域和至少一个免疫球蛋白轻链可变结构域。在一些实施方案中，本文的抗-TSPAN33药剂包含两个免疫球蛋白重链可变结构域和两个免疫球蛋白轻链可变结构域。通常，抗-TSPAN33药剂的每个免疫球蛋白重链可变结构域包含第一、第二和第三重链互补决定区(CDR；CDRH1、CDRH2、CDRH3)，并且抗-TSPAN33药剂的每个免疫球蛋白轻链可变结构域包含第一、第二和第三轻链CDR(CDRL1、CDRL2、CDRL3)。
CDRH1
在一些实施方案中，本文提供的抗-TSPAN33药剂的第一重链CDR(CDRH1)包含与氨基酸序列X
SEQ ID NO：41的氨基酸X
SEQ ID NO：41的氨基酸X
SEQ ID NO：41的氨基酸X
在一些实施方案中，本文提供的抗-TSPAN33药剂的CDRH1包含与选自DYYMT(SEQID NO：1)、SYWMH(SEQ ID NO：9)、NYYMN(SEQ ID NO：17)、NYYMN(SEQ ID NO：25)和SYWMH(SEQ ID NO：33)的氨基酸序列具有至少75％的相同性的多肽。在一些实施方案中，本文提供的抗-TSPAN33药剂的CDRH1包含与选自DYYMT(SEQ ID NO：1)、SYWMH(SEQ ID NO：9)、NYYMN(SEQ ID NO：17)、NYYMN(SEQ ID NO：25)和SYWMH(SEQ ID NO：33)的氨基酸序列具有至少80％的相同性的多肽。在一些实施方案中，本文提供的抗-TSPAN33药剂的CDRH1包含与选自DYYMT(SEQ ID NO：1)、SYWMH(SEQ ID NO：9)、NYYMN(SEQ ID NO：17)、NYYMN(SEQ IDNO：25)和SYWMH(SEQ ID NO：33)的氨基酸序列具有至少85％的相同性的多肽。在一些实施方案中，本文提供的抗-TSPAN33药剂的CDRH1包含与选自DYYMT(SEQ ID NO：1)、SYWMH(SEQID NO：9)、NYYMN(SEQ ID NO：17)、NYYMN(SEQ ID NO：25)和SYWMH(SEQ ID NO：33)的氨基酸序列具有至少90％的相同性的多肽。在一些实施方案中，本文提供的抗-TSPAN33药剂的CDRH1包含与选自DYYMT(SEQ ID NO：1)、SYWMH(SEQ ID NO：9)、NYYMN(SEQ ID NO：17)、NYYMN(SEQ ID NO：25)和SYWMH(SEQ ID NO：33)的氨基酸序列具有至少95％的相同性的多肽。在一些实施方案中，本文提供的抗-TSPAN33药剂的CDRH1包含选自DYYMT(SEQ ID NO：1)、SYWMH(SEQ ID NO：9)、NYYMN(SEQ ID NO：17)、NYYMN(SEQ ID NO：25)和SYWMH(SEQ IDNO：33)的氨基酸序列。
CDRH2
在一些实施方案中，本文提供的抗-TSPAN33药剂的第二重链CDR(CDRH2)包含与氨基酸序列X
SEQ ID NO：42的氨基酸X
SEQ ID NO：42的氨基酸X
SEQ ID NO：42的氨基酸X
SEQ ID NO：42的氨基酸X
SEQ ID NO：42的氨基酸X
SEQ ID NO：42的氨基酸X
SEQ ID NO：42的氨基酸X
SEQ ID NO：42的氨基酸X
SEQ ID NO：42的氨基酸X
SEQ ID NO：42的氨基酸X
SEQ ID NO：42的氨基酸X
SEQ ID NO：42的氨基酸X
SEQ ID NO：42的氨基酸X
SEQ ID NO：42的氨基酸X
SEQ ID NO：42的氨基酸X
在一些实施方案中，本文提供的抗-TSPAN33药剂的CDRH2包含与选自：FIRNKANGYTTEYSASVKG(SEQ ID NO：2)、RIDPNSGGTKYNEKFKS(SEQ ID NO：10)、DIIPNNGGTIYNQKFKG(SEQ ID NO：18)、DIIPNNGGTIYNQKFKG(SEQ ID NO：26)和EINPNNGGSNYNEKFKN(SEQ ID NO：34)的氨基酸序列具有至少75％相同性的多肽。在一些实施方案中，本文提供的抗-TSPAN33药剂的CDRH2包含与选自：FIRNKANGYTTEYSASVKG(SEQ IDNO：2)、RIDPNSGGTKYNEKFKS(SEQ ID NO：10)、DIIPNNGGTIYNQKFKG(SEQ ID NO：18)、DIIPNNGGTIYNQKFKG(SEQ ID NO：26)和EINPNNGGSNYNEKFKN(SEQ ID NO：34)的氨基酸序列具有至少80％相同性的多肽。在一些实施方案中，本文提供的抗-TSPAN33药剂的CDRH2包含与选自：FIRNKANGYTTEYSASVKG(SEQ ID NO：2)、RIDPNSGGTKYNEKFKS(SEQ ID NO：10)、DIIPNNGGTIYNQKFKG(SEQ ID NO：18)、DIIPNNGGTIYNQKFKG(SEQ ID NO：26)和EINPNNGGSNYNEKFKN(SEQ ID NO：34)的氨基酸序列具有至少85％相同性的多肽。在一些实施方案中，本文提供的抗-TSPAN33药剂的CDRH2包含与选自：FIRNKANGYTTEYSASVKG(SEQ IDNO：2)、RIDPNSGGTKYNEKFKS(SEQ ID NO：10)、DIIPNNGGTIYNQKFKG(SEQ ID NO：18)、DIIPNNGGTIYNQKFKG(SEQ ID NO：26)和EINPNNGGSNYNEKFKN(SEQ ID NO：34)的氨基酸序列具有至少90％相同性的多肽。在一些实施方案中，本文提供的抗-TSPAN33药剂的CDRH2包含与选自：FIRNKANGYTTEYSASVKG(SEQ ID NO：2)、RIDPNSGGTKYNEKFKS(SEQ ID NO：10)、DIIPNNGGTIYNQKFKG(SEQ ID NO：18)、DIIPNNGGTIYNQKFKG(SEQ ID NO：26)和EINPNNGGSNYNEKFKN(SEQ ID NO：34)的氨基酸序列具有至少95％相同性的多肽。在一些实施方案中，本文提供的抗-TSPAN33药剂的CDRH2包含选自FIRNKANGYTTEYSASVKG(SEQ IDNO：2)、RIDPNSGGTKYNEKFKS(SEQ ID NO：10)、DIIPNNGGTIYNQKFKG(SEQ ID NO：18)、DIIPNNGGTIYNQKFKG(SEQ ID NO：26)和EINPNNGGSNYNEKFKN(SEQ ID NO：34)的氨基酸序列。
CDRH3
在一些实施方案中，本文提供的抗-TSPAN33药剂的第三重链CDR(CDRH3)包含与氨基酸序列X
SEQ ID NO：43的氨基酸X
SEQ ID NO：43的氨基酸X
SEQ ID NO：43的氨基酸X
SEQ ID NO：43的氨基酸X
SEQ ID NO：43的氨基酸X
SEQ ID NO：43的氨基酸X
SEQ ID NO：43的氨基酸X
SEQ ID NO：43的氨基酸X
在一些实施方案中，本文提供的抗-TSPAN33药剂的CDRH3包含与选自YLQTGNFDY(SEQ ID NO：3)、FIITGYFDY(SEQ ID NO：11)、RLWSWYFDV(SEQ ID NO：19)、RLWSWYFDV(SEQID NO：22)和SYYSYWYFDY(SEQ ID NO：35)的氨基酸序列具有至少75％相同性的多肽。在一些实施方案中，本文提供的抗-TSPAN33药剂的CDRH3包含与选自YLQTGNFDY(SEQ ID NO：3)、FIITGYFDY(SEQ ID NO：11)、RLWSWYFDV(SEQ ID NO：19)、RLWSWYFDV(SEQ ID NO：22)和SYYSYWYFDY(SEQ ID NO：35)的氨基酸序列具有至少80％相同性的多肽。在一些实施方案中，本文提供的抗-TSPAN33药剂的CDRH3包含与选自YLQTGNFDY(SEQ ID NO：3)、FIITGYFDY(SEQ ID NO：11)、RLWSWYFDV(SEQ ID NO：19)、RLWSWYFDV(SEQ ID NO：22)和SYYSYWYFDY(SEQ ID NO：35)的氨基酸序列具有至少85％相同性的多肽。在一些实施方案中，本文提供的抗-TSPAN33药剂的CDRH3包含与选自YLQTGNFDY(SEQ ID NO：3)、FIITGYFDY(SEQ ID NO：11)、RLWSWYFDV(SEQ ID NO：19)、RLWSWYFDV(SEQ ID NO：22)和SYYSYWYFDY(SEQ ID NO：35)的氨基酸序列具有至少90％相同性的多肽。在一些实施方案中，本文提供的抗-TSPAN33药剂的CDRH3包含与选自YLQTGNFDY(SEQ ID NO：3)、FIITGYFDY(SEQ ID NO：11)、RLWSWYFDV(SEQ ID NO：19)、RLWSWYFDV(SEQ ID NO：22)和SYYSYWYFDY(SEQ ID NO：35)的氨基酸序列具有至少95％相同性的多肽。在一些实施方案中，本文提供的抗-TSPAN33药剂的CDRH3包含选自YLQTGNFDY(SEQ ID NO：3)、FIITGYFDY(SEQ ID NO：11)、RLWSWYFDV(SEQ ID NO：19)、RLWSWYFDV(SEQ ID NO：22)和SYYSYWYFDY(SEQ ID NO：35)的氨基酸序列。
CDRL1
在一些实施方案中，本文提供的抗-TSPAN33药剂的第一轻链CDR(CDRL1)包含与氨基酸序列X
SEQ ID NO：44的氨基酸X
SEQ ID NO：44的氨基酸X
SEQ ID NO：44的氨基酸X
SEQ ID NO：44的氨基酸X
SEQ ID NO：44的氨基酸X
SEQ ID NO：44的氨基酸X
SEQ ID NO：44的氨基酸X
SEQ ID NO：44的氨基酸X
SEQ ID NO：44的氨基酸X
在一些实施方案中，本文提供的抗-TSPAN33药剂的CDRL1包含与选自RASQDISNFLN(SEQ ID NO：5)、KASQDVGAAVA(SEQ ID NO：13)、SASSSVSYMY(SEQ ID NO：21)、SASSSVSYMY(SEQ ID NO：29)和SASSSVNYMH(SEQ ID NO：37)的氨基酸序列具有至少75％相同性的多肽。在一些实施方案中，本文提供的抗-TSPAN33药剂的CDRL1包含与选自RASQDISNFLN(SEQ IDNO：5)、KASQDVGAAVA(SEQ ID NO：13)、SASSSVSYMY(SEQ ID NO：21)、SASSSVSYMY(SEQ IDNO：29)和SASSSVNYMH(SEQ ID NO：37)的氨基酸序列具有至少80％相同性的多肽。在一些实施方案中，本文提供的抗-TSPAN33药剂的CDRL1包含与选自RASQDISNFLN(SEQ ID NO：5)、KASQDVGAAVA(SEQ ID NO：13)、SASSSVSYMY(SEQ ID NO：21)、SASSSVSYMY(SEQ ID NO：29)和SASSSVNYMH(SEQ ID NO：37)的氨基酸序列具有至少85％相同性的多肽。在一些实施方案中，本文提供的抗-TSPAN33药剂的CDRL1包含与选自RASQDISNFLN(SEQ ID NO：5)、KASQDVGAAVA(SEQ ID NO：13)、SASSSVSYMY(SEQ ID NO：21)、SASSSVSYMY(SEQ ID NO：29)和SASSSVNYMH(SEQ ID NO：37)的氨基酸序列具有至少90％相同性的多肽。在一些实施方案中，本文提供的抗-TSPAN33药剂的CDRL1包含与选自RASQDISNFLN(SEQ ID NO：5)、KASQDVGAAVA(SEQ ID NO：13)、SASSSVSYMY(SEQ ID NO：21)、SASSSVSYMY(SEQ ID NO：29)和SASSSVNYMH(SEQ ID NO：37)的氨基酸序列具有至少95％相同性的多肽。在一些实施方案中，本文提供的抗-TSPAN33药剂的CDRL1包含选自RASQDISNFLN(SEQ ID NO：5)、KASQDVGAAVA(SEQ ID NO：13)、SASSSVSYMY(SEQ ID NO：21)、SASSSVSYMY(SEQ ID NO：29)和SASSSVNYMH(SEQ ID NO：37)的氨基酸序列。
CDRL2
在一些实施方案中，本文提供的抗-TSPAN33药剂的第二轻链CDR(CDRL2)包含与氨基酸序列X
SEQ ID NO：45的氨基酸X
SEQ ID NO：45的氨基酸X
SEQ ID NO：45的氨基酸X
SEQ ID NO：45的氨基酸X
SEQ ID NO：45的氨基酸X
SEQ ID NO：45的氨基酸X
在一些实施方案中，本文提供的抗-TSPAN33药剂的CDRL2包含与选自FTSRLHS(SEQID NO：6)、WASTRHT(SEQ ID NO：14)、LTSNLAS(SEQ ID NO：22)、LTSNLAS(SEQ ID NO：30)和DTSKLAP(SEQ ID NO：38)的氨基酸序列具有至少75％相同性的多肽。在一些实施方案中，本文提供的抗-TSPAN33药剂的CDRL2包含与选自FTSRLHS(SEQ ID NO：6)、WASTRHT(SEQ IDNO：14)、LTSNLAS(SEQ ID NO：22)、LTSNLAS(SEQ ID NO：30)和DTSKLAP(SEQ ID NO：38)的氨基酸序列具有至少80％相同性的多肽。在一些实施方案中，本文提供的抗-TSPAN33药剂的CDRL2包含与选自FTSRLHS(SEQ ID NO：6)、WASTRHT(SEQ ID NO：14)、LTSNLAS(SEQ ID NO：22)、LTSNLAS(SEQ ID NO：30)和DTSKLAP(SEQ ID NO：38)的氨基酸序列具有至少85％相同性的多肽。在一些实施方案中，本文提供的抗-TSPAN33药剂的CDRL2包含与选自FTSRLHS(SEQ ID NO：6)、WASTRHT(SEQ ID NO：14)、LTSNLAS(SEQ ID NO：22)、LTSNLAS(SEQ ID NO：30)和DTSKLAP(SEQ ID NO：38)的氨基酸序列具有至少90％相同性的多肽。在一些实施方案中，本文提供的抗-TSPAN33药剂的CDRL2包含与选自FTSRLHS(SEQ ID NO：6)、WASTRHT(SEQID NO：14)、LTSNLAS(SEQ ID NO：22)、LTSNLAS(SEQ ID NO：30)和DTSKLAP(SEQ ID NO：38)的氨基酸序列具有至少95％相同性的多肽。在一些实施方案中，本文提供的抗-TSPAN33药剂的CDRL2包含选自FTSRLHS(SEQ ID NO：6)、WASTRHT(SEQ ID NO：14)、LTSNLAS(SEQ IDNO：22)、LTSNLAS(SEQ ID NO：30)和DTSKLAP(SEQ ID NO：38)的氨基酸序列。
CDRL3
在一些实施方案中，本文提供的抗-TSPAN33药剂的第三轻链CDR(CDRL3)包含与氨基酸序列X
SEQ ID NO：46的氨基酸X
SEQ ID NO：46的氨基酸X
SEQ ID NO：46的氨基酸X
SEQ ID NO：46的氨基酸X
SEQ ID NO：46的氨基酸X
SEQ ID NO：46的氨基酸X
在一些实施方案中，本文提供的抗-TSPAN33药剂的CDRL3包含与选自QQGYTVPPT(SEQ ID NO：7)、HQYRTYPFT(SEQ ID NO：15)、QQWSSNPYT(SEQ ID NO：23)、QQWSSNPYT(SEQID NO：31)和HQWNNYPYT(SEQ ID NO：39)的氨基酸序列具有至少75％相同性的多肽。在一些实施方案中，本文提供的抗-TSPAN33药剂的CDRL3包含与选自QQGYTVPPT(SEQ ID NO：7)、HQYRTYPFT(SEQ ID NO：15)、QQWSSNPYT(SEQ ID NO：23)、QQWSSNPYT(SEQ ID NO：31)和HQWNNYPYT(SEQ ID NO：39)的氨基酸序列具有至少80％相同性的多肽。在一些实施方案中，本文提供的抗-TSPAN33药剂的CDRL3包含与选自QQGYTVPPT(SEQ ID NO：7)、HQYRTYPFT(SEQID NO：15)、QQWSSNPYT(SEQ ID NO：23)、QQWSSNPYT(SEQ ID NO：31)和HQWNNYPYT(SEQ IDNO：39)的氨基酸序列具有至少85％相同性的多肽。在一些实施方案中，本文提供的抗-TSPAN33药剂的CDRL3包含与选自QQGYTVPPT(SEQ ID NO：7)、HQYRTYPFT(SEQ ID NO：15)、QQWSSNPYT(SEQ ID NO：23)、QQWSSNPYT(SEQ ID NO：31)和HQWNNYPYT(SEQ ID NO：39)的氨基酸序列具有至少90％相同性的多肽。在一些实施方案中，本文提供的抗-TSPAN33药剂的CDRL3包含与选自QQGYTVPPT(SEQ ID NO：7)、HQYRTYPFT(SEQ ID NO：15)、QQWSSNPYT(SEQID NO：23)、QQWSSNPYT(SEQ ID NO：31)和HQWNNYPYT(SEQ ID NO：39)的氨基酸序列具有至少95％相同性的多肽。在一些实施方案中，本文提供的抗-TSPAN33药剂的CDRL3包含选自QQGYTVPPT(SEQ ID NO：7)、HQYRTYPFT(SEQ ID NO：15)、QQWSSNPYT(SEQ ID NO：23)、QQWSSNPYT(SEQ ID NO：31)和HQWNNYPYT(SEQ ID NO：39)的氨基酸序列。
CDR组
在一些实施方案中，抗-TSPAN33药剂包含免疫球蛋白重链可变结构域以及免疫球蛋白轻链可变结构域，该免疫球蛋白重链可变结构域包含一组CDR(即CDRH1、CDRH2、CDRH3)；该免疫球蛋白轻链可变结构域包含一组CDR(即CDRL1、CDRL2、CDRL3)。在一些实施方案中，本文的抗-TSPAN33药剂包含两个免疫球蛋白重链可变结构域以及两个免疫球蛋白轻链可变结构域，每个免疫球蛋白重链可变结构域包含一组CDR(即CDRH1、CDRH2、CDRH3)，每个免疫球蛋白轻链可变结构域包含一组CDR(即CDRL1、CDRL2、CDRL3)。CDR组可包含本文提供的CDR氨基酸序列(即CDRH1、CDRH2、CDRH3；以及CDRL1、CDRL2、CDRL3)的任何组合。在一些实施方案中，免疫球蛋白重链可变结构域包含一组CDRH1、CDRH2和CDRH3氨基酸序列，并且免疫球蛋白轻链可变结构域包含一组的CDRL1、CDRL2和CDRL3氨基酸序列，其选自下表中提供的组1-4。对于包含两个免疫球蛋白重链可变结构域和两个免疫球蛋白轻链可变结构域的抗-TSPAN33药剂，每个免疫球蛋白重链可变结构域可包含一组CDRH1、CDRH2和CDRH3氨基酸序列，并且每个免疫球蛋白轻链可变结构域可包含一组CDRL1、CDRL2和CDRL3氨基酸序列，其选自下表中提供的组1-4。
在一些实施方案中，所有CDR来自同一组。例如，对于包含两个免疫球蛋白重链可变结构域和两个免疫球蛋白轻链可变结构域的抗-TSPAN33药剂，每个免疫球蛋白重链可变结构域可包含来自组1的一组CDRH1、CDRH2和CDRH3氨基酸序列，并且每个免疫球蛋白轻链可变结构域可包含来自组1的一组CDRL1、CDRL2和CDRL3氨基酸序列。
在一些实施方案中，CDR来自不同的组。例如，对于包含两个免疫球蛋白重链可变结构域和两个免疫球蛋白轻链可变结构域的抗-TSPAN33药剂，每个免疫球蛋白重链可变结构域可包含来自组1的一组CDRH1、CDRH2和CDRH3氨基酸序列，并且每个免疫球蛋白重链可变结构域可包含来自组2的一组CDRH1、CDRH2和CDRH3氨基酸序列。在另一个实例中，对于包含两个免疫球蛋白重链可变结构域和两个免疫球蛋白轻链可变结构域的抗-TSPAN33药剂，一个免疫球蛋白重链可变结构域可包含来自组1的一组CDRH1、CDRH2和CDRH3氨基酸序列，而另一个免疫球蛋白重链可变结构域可包含来自组2的一组CDRH1、CDRH2和CDRH3氨基酸序列；并且一个免疫球蛋白轻链可变结构域可包含来自组1的一组CDRL1、CDRL2和CDRL3氨基酸序列，而另一个免疫球蛋白轻链可变结构域可以包含来自组2的一组CDRL1、CDRL2和CDRL3氨基酸序列。
可变重链
在一些实施方案中，本文提供的抗-TSPAN33药剂的可变重链包含与SEQ ID NO：4的氨基酸序列具有至少75％相同性的多肽。在一些实施方案中，本文提供的抗-TSPAN33药剂的可变重链包含与SEQ ID NO：4的氨基酸序列具有至少80％相同性的多肽。在一些实施方案中，本文提供的抗-TSPAN33药剂的可变重链包含与SEQ ID NO：4的氨基酸序列具有至少85％相同性的多肽。在一些实施方案中，本文提供的抗-TSPAN33药剂的可变重链包含与SEQ ID NO：4的氨基酸序列具有至少90％相同性的多肽。在一些实施方案中，本文提供的抗-TSPAN33药剂的可变重链包含与SEQ ID NO：4的氨基酸序列具有至少95％相同性的多肽。在一些实施方案中，本文提供的抗-TSPAN33药剂的可变重链包含与SEQ ID NO：4的氨基酸序列具有100％相同性的多肽。
在一些实施方案中，本文提供的抗-TSPAN33药剂的可变重链包含与SEQ ID NO：12的氨基酸序列具有至少75％相同性的多肽。在一些实施方案中，本文提供的抗-TSPAN33药剂的可变重链包含与SEQ ID NO：12的氨基酸序列具有至少80％相同性的多肽。在一些实施方案中，本文提供的抗-TSPAN33药剂的可变重链包含与SEQ ID NO：12的氨基酸序列具有至少85％相同性的多肽。在一些实施方案中，本文提供的抗-TSPAN33药剂的可变重链包含与SEQ ID NO：12的氨基酸序列具有至少90％相同性的多肽。在一些实施方案中，本文提供的抗-TSPAN33药剂的可变重链包含与SEQ ID NO：12的氨基酸序列具有至少95％相同性的多肽。在一些实施方案中，本文提供的抗-TSPAN33药剂的可变重链包含与SEQ ID NO：12的氨基酸序列具有100％相同性的多肽。
在一些实施方案中，本文提供的抗-TSPAN33药剂的可变重链包含与SEQ ID NO：20的氨基酸序列具有至少75％相同性的多肽。在一些实施方案中，本文提供的抗-TSPAN33药剂的可变重链包含与SEQ ID NO：20的氨基酸序列具有至少80％相同性的多肽。在一些实施方案中，本文提供的抗-TSPAN33药剂的可变重链包含与SEQ ID NO：20的氨基酸序列具有至少85％相同性的多肽。在一些实施方案中，本文提供的抗-TSPAN33药剂的可变重链包含与SEQ ID NO：20的氨基酸序列具有至少90％相同性的多肽。在一些实施方案中，本文提供的抗-TSPAN33药剂的可变重链包含与SEQ ID NO：20的氨基酸序列具有至少95％相同性的多肽。在一些实施方案中，本文提供的抗-TSPAN33药剂的可变重链包含与SEQ ID NO：20的氨基酸序列具有100％相同性的多肽。
在一些实施方案中，本文提供的抗-TSPAN33药剂的可变重链包含与SEQ ID NO：28的氨基酸序列具有至少75％相同性的多肽。在一些实施方案中，本文提供的抗-TSPAN33药剂的可变重链包含与SEQ ID NO：28的氨基酸序列具有至少80％相同性的多肽。在一些实施方案中，本文提供的抗-TSPAN33药剂的可变重链包含与SEQ ID NO：28的氨基酸序列具有至少85％相同性的多肽。在一些实施方案中，本文提供的抗-TSPAN33药剂的可变重链包含与SEQ ID NO：28的氨基酸序列具有至少90％相同性的多肽。在一些实施方案中，本文提供的抗-TSPAN33药剂的可变重链包含与SEQ ID NO：28的氨基酸序列具有至少95％相同性的多肽。在一些实施方案中，本文提供的抗-TSPAN33药剂的可变重链包含与SEQ ID NO：28的氨基酸序列具有100％相同性的多肽。
在一些实施方案中，本文提供的抗-TSPAN33药剂的可变重链包含与SEQ ID NO：36的氨基酸序列具有至少75％相同性的多肽。在一些实施方案中，本文提供的抗-TSPAN33药剂的可变重链包含与SEQ ID NO：36的氨基酸序列具有至少80％相同性的多肽。在一些实施方案中，本文提供的抗-TSPAN33药剂的可变重链包含与SEQ ID NO：36的氨基酸序列具有至少85％相同性的多肽。在一些实施方案中，本文提供的抗-TSPAN33药剂的可变重链包含与SEQ ID NO：36的氨基酸序列具有至少90％相同性的多肽。在一些实施方案中，本文提供的抗-TSPAN33药剂的可变重链包含与SEQ ID NO：36的氨基酸序列具有至少95％相同性的多肽。在一些实施方案中，本文提供的抗-TSPAN33药剂的可变重链包含与SEQ ID NO：36的氨基酸序列具有100％相同性的多肽。
可变轻链
在一些实施方案中，本文提供的抗-TSPAN33药剂的可变轻链包含与SEQ ID NO：8的氨基酸序列具有至少75％相同性的多肽。在一些实施方案中，本文提供的抗-TSPAN33药剂的可变轻链包含与SEQ ID NO：8的氨基酸序列具有至少80％相同性的多肽。在一些实施方案中，本文提供的抗-TSPAN33药剂的可变轻链包含与SEQ ID NO：8的氨基酸序列具有至少85％相同性的多肽。在一些实施方案中，本文提供的抗-TSPAN33药剂的可变轻链包含与SEQ ID NO：8的氨基酸序列具有至少90％相同性的多肽。在一些实施方案中，本文提供的抗-TSPAN33药剂的可变轻链包含与SEQ ID NO：8的氨基酸序列具有至少95％相同性的多肽。在一些实施方案中，本文提供的抗-TSPAN33药剂的可变轻链包含与SEQ ID NO：8的氨基酸序列具有100％相同性的多肽。
在一些实施方案中，本文提供的抗-TSPAN33药剂的可变轻链包含与SEQ ID NO：16的氨基酸序列具有至少75％相同性的多肽。在一些实施方案中，本文提供的抗-TSPAN33药剂的可变轻链包含与SEQ ID NO：16的氨基酸序列具有至少80％相同性的多肽。在一些实施方案中，本文提供的抗-TSPAN33药剂的可变轻链包含与SEQ ID NO：16的氨基酸序列具有至少85％相同性的多肽。在一些实施方案中，本文提供的抗-TSPAN33药剂的可变轻链包含与SEQ ID NO：16的氨基酸序列具有至少90％相同性的多肽。在一些实施方案中，本文提供的抗-TSPAN33药剂的可变轻链包含与SEQ ID NO：16的氨基酸序列具有至少95％相同性的多肽。在一些实施方案中，本文提供的抗-TSPAN33药剂的可变轻链包含与SEQ ID NO：16的氨基酸序列具有100％相同性的多肽。
在一些实施方案中，本文提供的抗-TSPAN33药剂的可变轻链包含与SEQ ID NO：24的氨基酸序列具有至少75％相同性的多肽。在一些实施方案中，本文提供的抗-TSPAN33药剂的可变轻链包含与SEQ ID NO：24的氨基酸序列具有至少80％相同性的多肽。在一些实施方案中，本文提供的抗-TSPAN33药剂的可变轻链包含与SEQ ID NO：24的氨基酸序列具有至少85％相同性的多肽。在一些实施方案中，本文提供的抗-TSPAN33药剂的可变轻链包含与SEQ ID NO：24的氨基酸序列具有至少90％相同性的多肽。在一些实施方案中，本文提供的抗-TSPAN33药剂的可变轻链包含与SEQ ID NO：24的氨基酸序列具有至少95％相同性的多肽。在一些实施方案中，本文提供的抗-TSPAN33药剂的可变轻链包含与SEQ ID NO：24的氨基酸序列具有100％相同性的多肽。
在一些实施方案中，本文提供的抗-TSPAN33药剂的可变轻链包含与SEQ ID NO：32的氨基酸序列具有至少75％相同性的多肽。在一些实施方案中，本文提供的抗-TSPAN33药剂的可变轻链包含与SEQ ID NO：32的氨基酸序列具有至少80％相同性的多肽。在一些实施方案中，本文提供的抗-TSPAN33药剂的可变轻链包含与SEQ ID NO：32的氨基酸序列具有至少85％相同性的多肽。在一些实施方案中，本文提供的抗-TSPAN33药剂的可变轻链包含与SEQ ID NO：32的氨基酸序列具有至少90％相同性的多肽。在一些实施方案中，本文提供的抗-TSPAN33药剂的可变轻链包含与SEQ ID NO：32的氨基酸序列具有至少95％相同性的多肽。在一些实施方案中，本文提供的抗-TSPAN33药剂的可变轻链包含与SEQ ID NO：32的氨基酸序列具有100％相同性的多肽。
在一些实施方案中，本文提供的抗-TSPAN33药剂的可变轻链包含与SEQ ID NO：40的氨基酸序列具有至少75％相同性的多肽。在一些实施方案中，本文提供的抗-TSPAN33药剂的可变轻链包含与SEQ ID NO：40的氨基酸序列具有至少80％相同性的多肽。在一些实施方案中，本文提供的抗-TSPAN33药剂的可变轻链包含与SEQ ID NO：40的氨基酸序列具有至少85％相同性的多肽。在一些实施方案中，本文提供的抗-TSPAN33药剂的可变轻链包含与SEQ ID NO：40的氨基酸序列具有至少90％相同性的多肽。在一些实施方案中，本文提供的抗-TSPAN33药剂的可变轻链包含与SEQ ID NO：40的氨基酸序列具有至少95％相同性的多肽。在一些实施方案中，本文提供的抗-TSPAN33药剂的可变轻链包含与SEQ ID NO：40的氨基酸序列具有100％相同性的多肽。
与抗-TSPAN33药剂竞争性结合的药剂
本文提供了抗-TSPAN33药剂，其与本文所述的一种或多种抗-TSPAN33药剂竞争性结合或能够与本文所述的一种或多种抗-TSPAN33药剂竞争性结合。特别地，本文提供了抗-TSPAN33药剂，其与本文所述的一种或多种抗-TSPAN33药剂竞争或能够与本文所述的一种或多种抗-TSPAN33药剂竞争结合TSPAN33。与本文所述的抗-TSPAN33药剂竞争或能够与本文所述的抗-TSPAN33药剂竞争的此类药剂可称为竞争物药剂。在某些情况下，当竞争物与本文所述的抗-TSPAN33药剂结合TSPAN33的相同的通用区域(例如细胞外结构域)时，可认为药剂(即竞争物药剂)竞争结合TSPAN33。在某些情况下，当竞争物与本文所述的抗-TSPAN33药剂结合TSPAN33的完全相同区域(例如完全相同的肽(线性表位))或完全相同的表面氨基酸(构象表位))时，可认为药剂(即竞争物药剂)竞争结合TSPAN33。在某些情况下，当在合适的测定条件下竞争物与本文所述的抗-TSPAN33药剂结合TSPAN33的相同通用区域(例如细胞外结构域)时，可认为药剂(即竞争物药剂)能够竞争结合TSPAN33。在某些情况下，当在合适的测定条件下竞争物与本文所述的抗-TSPAN33药剂结合TSPAN33的完全相同区域(例如完全相同的肽(线性表位))或完全相同的表面氨基酸(构象表位))时，可认为药剂(即竞争物药剂)能够竞争结合TSPAN33。
在某些情况下，当竞争物阻断本文所述的一种或多种抗-TSPAN33药剂与TSPAN33的结合时，可认为药剂(即竞争物药剂)竞争结合TSPAN33。在某些情况下，当在合适的测定条件下竞争物阻断本文所述的一种或多种抗-TSPAN33药剂与TSPAN33的结合时，可认为药剂(即竞争物药剂)能够竞争结合TSPAN33。竞争物是否阻断本文所述的一种或多种抗-TSPAN33药剂与TSPAN33的结合可使用合适的竞争试验或阻断试验(诸如如本文实施例5中所述的阻断试验)来确定。竞争物药剂可在竞争或阻断试验中将本文所述的一种或多种抗-TSPAN33药剂与TSPAN33的结合阻断50％或更多，并且反过来，本文所述的一种或多种抗-TSPAN33药剂可在竞争或阻断试验中将竞争物药剂与TSPAN33的结合阻断约50％或更多。例如，药剂(即竞争物药剂)可在竞争或阻断试验中将本文所述的一种或多种抗-TSPAN33药剂与TSPAN33的结合阻断约55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或100％，并且反过来，本文所述的一种或多种抗-TSPAN33药剂可在竞争或阻断试验中将竞争物药剂与TSPAN33的结合阻断约55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或100％。
在某些情况下，当竞争物阻断本文所述的一种或多种抗-TSPAN33药剂与在特定细胞类型(例如TSPAN33阳性细胞、B细胞、活化的B细胞)上表达的TSPAN33的结合时，可认为该药剂(即竞争物药剂)竞争结合TSPAN33。在某些情况下，当在合适的测定条件下，竞争物阻断本文所述的一种或多种抗-TSPAN33药剂与在特定细胞类型(例如TSPAN33阳性细胞、B细胞、活化的B细胞)上表达的TSPAN33的结合时，可认为该药剂(即竞争物药剂)能够竞争结合TSPAN33。例如，竞争物药剂可在竞争或阻断试验中阻断本文所述的一种或多种抗-TSPAN33药剂与活化B细胞上的TSPAN33的结合50％或更多，并且反过来，本文所述的一种或多种抗-TSPAN33药剂可在竞争或阻断试验中将竞争物药剂与活化的B细胞上的TSPAN33的结合阻断约50％或更多。例如，药剂(即竞争物药剂)可在竞争或阻断试验中将一种或多种本文所述的抗-TSPAN33药剂与活化的B细胞上的TSPAN33的结合阻断约55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、或100％，并且反过来，本文所述的一种或多种抗-TSPAN33药剂可在竞争或阻断试验中将竞争物药剂与TSPAN33的结合阻断约55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或100％。在一些实施方案中，药剂(即竞争物药剂)在竞争或阻断试验中将本文所述的一种或多种抗-TSPAN33药剂与活化的B细胞上的TSPAN33的结合阻断约60％至约90％，并且反过来，在一些实施方案中，本文所述的一种或多种抗-TSPAN33药剂在竞争或阻断试验中将竞争物药剂与TSPAN33的结合阻断约60％至约90％。例如，药剂(即竞争物药剂)可在竞争或阻断试验中将本文所述的一种或多种抗-TSPAN33药剂与活化的B细胞上的TSPAN33的结合阻断约60％、65％、70％、75％、80％、85％或90％，并且反过来，本文所述的一种或多种抗-TSPAN33药剂可在竞争或阻断试验中将竞争物药剂与TSPAN33的结合阻断约60％、65％、70％、75％、80％、85％或90％。
在某些情况下，当竞争物以与本文所述的一种或多种抗-TSPAN33药剂相似的亲和力结合TSPAN33时，可认为药剂(即竞争物药剂)竞争结合TSPAN33。在某些情况下，当在合适的测定条件下，竞争物以与本文所述的一种或多种抗-TSPAN33药剂相似的亲和力结合TSPAN33时，可认为药剂(即竞争物药剂)能够竞争结合TSPAN33。在一些实施方案中，当竞争物以本文所述的一种或多种抗-TSPAN33药剂的亲和力的至少约50％的亲和力结合TSPAN33时，认为该药剂(即竞争物药剂)竞争结合TSPAN33。例如，当竞争物以本文所述的一种或多种抗-TSPAN33药剂的亲和力的至少约55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或100％的亲和力结合TSPAN33时，可认为该药剂(即竞争物药剂)竞争结合TSPAN33。竞争物药剂可包含本文针对抗-TSPAN33药剂描述的任何特征。
本文还提供了抗-TSPAN33药剂，其与本文所述的一种或多种抗-TSPAN33药剂结合相同的表位至或能够与本文所述的一种或多种抗-TSPAN33药剂结合相同的表位。特别地，本文提供了抗-TSPAN33药剂，其与本文所述的一种或多种抗-TSPAN33药剂竞争结合TSPAN33上的相同表位。结合相同表位的此类药剂可称为表位竞争物。在某些情况下，表位竞争物可与本文所述的抗-TSPAN33药剂结合TSPAN33的完全相同的区域(例如完全相同的肽(线性表位)或完全相同的表面氨基酸(构象表位))。在某些情况下，表位竞争物阻断本文所述的一种或多种抗-TSPAN33药剂与TSPAN33的结合。表位竞争物可在竞争试验中将本文所述的一种或多种抗-TSPAN33药剂与TSPAN33的结合阻断约50％或更多，并且反过来，本文所述的一种或多种抗-TSPAN33药剂可在竞争试验中将表位竞争物与TSPAN33的结合阻断50％或更多。在某些情况下，表位竞争物以与本文所述的一种或多种抗-TSPAN33药剂相似的亲和力结合TSPAN33。在一些实施方案中，表位竞争物以本文所述的一种或多种抗-TSPAN33药剂的亲和力的至少约50％的亲和力结合TSPAN33。例如，表位竞争物可以本文所述的一种或多种抗-TSPAN33药剂的亲和力的至少约55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或100％的亲和力结合TSPAN33。表位竞争物可包含本文对于抗-TSPAN33药剂描述的任何特征。
抗体制备
在一些实施方案中，抗-TSPAN33药剂为抗体。在下面的实施例中描述了用于产生抗-TSPAN33抗体和抗-TSPAN33抗体的变体的方法。在一些实施方案中，抗-TSPAN33药剂为结合TSPAN33的人源化抗体或其衍生物。可基于非人抗-TSPAN33抗体制备人源化抗-TSPAN33抗体。还可例如在遗传工程化的(即转基因)小鼠(例如来自Medarex)中制备完全人抗体，该小鼠，当其呈递免疫原时，可以产生不一定需要CDR移植的人抗体。这些抗体是来自动物诸如小鼠的完全人的(100％人蛋白序列)，其中非人抗体基因被抑制并用人抗体基因表达所置换。当将TSPAN33呈递至可能能够产生针对相关CDR的人框架的这些经遗传工程化的小鼠或其他动物时，可产生抗-TSPAN33的抗体。
当产生变体时，制备亲本抗体。用于产生这种非人抗体和亲本抗体的示例性技术将在以下部分中描述。
抗原制备
用于产生抗体的抗原可为例如完整的TSPAN33(特别是在细胞中表达的)或TSPAN33的一部分(例如包含表位的TSPAN33片段)。用于产生抗体的其他形式的抗原对于本领域技术人员将是明显的。
多克隆抗体
优选通过多次皮下(sc)或腹膜内(ip)注射相关抗原和佐剂，在动物(脊椎动物或无脊椎动物，包括哺乳动物、鸟类和鱼类，包括软骨鱼)中产生多克隆抗体。使用双功能或衍生化试剂(例如马来酰亚胺苯甲酰磺基琥珀酰亚胺酯(通过半胱氨酸残基缀合)、N-羟基琥珀酰亚胺(通过赖氨酸残基缀合)、戊二醛、琥珀酸酐、SOCl
通过将例如100μg或5μg的蛋白质或缀合物(分别对于兔或小鼠)与三份体积的弗氏完全佐剂组合并在多个位点皮内注射该溶液，使动物针对抗原、免疫原性缀合物或衍生物进行免疫。一个月后，动物通过在多个位点皮下注射，用弗氏完全佐剂中的原始量的肽或缀合物的五分之一至十分之一加强。7至14天后，将动物放血，并测定血清的抗体滴度。加强动物直到滴度稳定。优选地，用相同抗原但与不同蛋白质缀合和/或通过不同交联剂缀合的缀合物加强动物。还可以在重组细胞培养物中制备缀合物作为蛋白质融合物。另外，聚集剂诸如明矾适合用于增强免疫反应。
单克隆抗体
单克隆抗体可使用Kohler等人,Nature,256:495(1975)首先描述的杂交瘤方法制备，或者可通过其他方法诸如重组DNA方法(美国专利号4,816,567)制备。在杂交瘤方法中，如上所述免疫小鼠或其他合适的宿主动物诸如仓鼠或短尾猴，以引发淋巴细胞产生或能够产生与用于免疫的蛋白质特异性结合的抗体。或者，淋巴细胞可在体外免疫。然后使用合适的融合剂(诸如聚乙二醇)将淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合以形成杂交瘤细胞(Goding,Monoclonal Antibodies:Principles and Practice,第59-103页(AcademiCPress,1986))。
将由此制备的杂交瘤细胞接种并生长在合适的培养基中，该培养基优选含有一种或多种抑制未融合的亲代骨髓瘤细胞生长或存活的物质。例如，如果亲代骨髓瘤细胞缺乏次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶(HGPRT或HPRT)，则杂交瘤的培养基通常将包括次黄嘌呤、氨基蝶呤、胸苷(HAT培养基)，这些物质阻止HGPRT缺陷细胞的生长。
优选的骨髓瘤细胞是那些有效融合，支持所选择的抗体生产细胞稳定高水平生产抗体的并对诸如HAT培养基的培养基敏感的骨髓瘤细胞。其中，优选的骨髓瘤细胞系为鼠骨髓瘤细胞系，诸如可从美国典型培养物保藏中心(Rockville,Md.USA)获得的SP-2或X63-Ag8-653细胞。还描述了人骨髓瘤和小鼠-人异种骨髓瘤细胞系用于生产人单克隆抗体(Kozbor,J.Immunol.,133:3001(1984)；Brodeur等人,Monoclonal Antibody ProductionTechniques and Applications,第51-63页(Marcel Dekker,Inc.,New York,1987))。
测定杂交瘤细胞在其中生长的培养基中针对抗原的单克隆抗体的产生。优选地，杂交瘤细胞产生的单克隆抗体的结合特异性通过免疫沉淀、通过体外结合测定(诸如放射免疫测定(RIA)或酶联免疫吸附测定(ELISA))或通过表达膜抗原的细胞的流式细胞分析来测定。
单克隆抗体的结合亲和力可以例如通过Munson等人,Anal.Biochem.,107:220(1980)的Scatchard分析来测定。
在鉴定产生所需特异性、亲和力和/或活性的抗体的杂交瘤细胞后，克隆可通过有限稀释程序并通过标准方法生长进行亚克隆(Goding,Monoclonal Antibodies:Principles and Practice,第59-103页(AcademiCPress,1986))。用于此目的的合适培养基包括例如D-MEM或RPMI-1640培养基。另外，杂交瘤细胞可在动物中作为腹水肿瘤在体内生长。
通过常规免疫球蛋白纯化方法(诸如如蛋白A-琼脂糖、羟磷灰石层析、凝胶电泳、透析或亲和层析)，将亚克隆分泌的单克隆抗体适当地从培养基、腹水或血清中分离。
编码单克隆抗体的DNA易于使用常规程序(例如，通过使用能够与编码单克隆抗体的重链和轻链的基因特异性结合的寡核苷酸探针)进行分离和测序。或者，可从mRNA制备cDNA，然后对该cDNA进行DNA测序。杂交瘤细胞作为用于cDNA制备的此类基因组DNA或RNA的优选来源。一旦分离，可将DNA置于本领域熟知的表达载体中，然后将其转染至宿主细胞(诸如大肠杆菌细胞、猿猴COS细胞、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞或骨髓瘤细胞，其不会另外产生免疫球蛋白)，以在重组宿主细胞中获得单克隆抗体合成。下面将更详细地描述抗体的重组生产。
人源化和氨基酸序列变体
抗体人源化的一般方法描述于更新的US5861155、US19960652558、19960606、US6479284、US20000660169、20000912、US6407213、US19930146206、19931117、US6639055、US20000705686、20001102、US6500931、US19950435516、19950504、US5530101、US5585089、US19950477728、19950607、US5693761、US19950474040、19950607、US5693762、US19950487200、19950607、US6180370、US19950484537、19950607、US2003229208、US20030389155、20030313、US5714350、US19950372262、19950113、US6350861、US19970862871、19970523、US5777085、US19950458516、19950517、US5834597、US19960656586、19960531、US5882644、US19960621751、19960322、US5932448、US19910801798、19911129、US6013256、US19970934841、19970922、US6129914、US19950397411、19950301、US6210671、US6329511、US19990450520、19991129、US2003166871、US20020078757、20020219、US5225539、US19910782717、19911025、US6548640、US19950452462、19950526、US5624821以及US19950479752、19950607。在某些实施方案中，可能需要产生这些人源化抗体的氨基酸序列变体，特别是在这些变体改善抗体的结合亲和力或其他生物学特性的情况下。
抗-TSPAN33抗体的氨基酸序列变体通过将适当的核苷酸改变引入抗-TSPAN33抗体DNA，或通过肽合成来制备。此类变体包括例如缺失和/或插入进和/或取代本文实施例的抗-TSPAN33抗体的氨基酸序列内的残基。只要最终构建体拥有所需特性，进行缺失、插入和取代的任何组合以制备最终构建体。氨基酸变化还可改变人源化或变体抗-TSPAN33抗体的翻译后过程，诸如改变糖基化位点的数目或位置。
鉴定抗-TSPAN33抗体的用以诱变的优选位置的某些残基或区域的一种有用方法称为“丙氨酸扫描诱变”(如Cunningham and Wells Science,244:1081-1085(1989)所述)。在此，鉴定一个残基或一组靶残基(例如带电残基，诸如arg、asp、his、lys和glu)并用中性或带负电荷的氨基酸(最优选丙氨酸或聚丙氨酸)置换以影响该氨基酸与TSPAN33抗原的相互作用。然后通过在取代位点处或对于取代位点引入另外或其他变体来修饰那些对取代表现出功能敏感性的氨基酸位置。因此，虽然用于引入氨基酸序列变异的位点是预定的，但突变本身的性质无需是预定的。例如，为了分析在给定点处突变的性能，在靶密码子或区域进行丙氨酸扫描或随机诱变，并筛选所表达的抗-TSPAN33抗体变体的所需活性。氨基酸序列插入包括在一个残基到含有一百个或更多个残基的多肽的长度范围内的氨基和/或羧基末端融合，以及单个或多个氨基酸残基的序列内插入。末端插入的实例包括N末端甲硫氨酰基残基或与表位标签融合的抗体。其他插入变体包括增加抗体血清半衰期的酶或多肽与抗体的N末端或C末端的融合。
另一种类型的变体为氨基酸取代变体。这些变体具有从抗体分子去除的至少一个氨基酸残基和在其位置插入的不同残基。取代诱变最感兴趣的位点包括高变区，但也考虑FR改变。优选保守取代，但可引入更多的实质性改变并可筛选产物。取代的实例列举如下：
Ala(A)val；leu；ile val
Arg(R)lys；gln；asn lys
Asn(N)gln；his；asp，lys；gln arg
Asp(D)glu；asn glu
Cys(C)ser；ala ser
Gln(Q)asn；glu asn
Glu(E)asp；gln asp
Gly(G)ala ala
His(H)asn；gln；lys；arg arg
Ile(I)leu；val；met；ala；leu phe；正亮氨酸
Leu(L)正亮氨酸；ile；val；ile met；ala；phe
Lys(K)arg；gln；asn arg
Met(M)leu；phe；ile leu
Phe(F)leu；val；ile；ala；tyr tyr
Pro(P)ala ala
Ser(S)thr thr
Thr(T)ser ser
Trp(W)tyr；phe tyr
Tyr(Y)trp；phe；thr；ser phe
Val(V)ile；leu；met；phe；leu ala；正亮氨酸
通过选择在他们对维持(a)多肽骨架在取代区域中的结构例如片状或螺旋构象、(b)在靶位点分子的电荷或疏水性或(c)侧链大小的影响方面显著不同的取代来实现抗体生物学特性的实质性修饰。基于常见的侧链特性将天然存在的残基分成组：
(1)疏水性：正亮氨酸，met，ala，val，leu，ile；
(2)中性亲水性：cys，ser，thr；
(3)酸性：asp，glu；
(4)碱性：asn，gln，his，lys，arg；
(5)影响链取向的残基：gly，pro；以及
(6)芳香族：trp，tyr，phe。
非保守取代将将这些类别之一的成员交换为另一个类别。
任何不参与维持抗体的适当构象的半胱氨酸残基也可被取代，以改善分子的氧化稳定性并防止异常交联。相反，可以将半胱氨酸键加入抗体以改善其稳定性(特别是当抗体为抗体片段诸如Fv片段时)。
一种类型的取代变体涉及替代亲本抗体(例如人源化或人抗体)的一个或多个高变区残基。通常，相对于产生它们的亲本抗体，选择用于进一步开发的所得变体将具有改善的生物学特性。产生这种取代变体的方便方法是使用噬菌体展示的亲和力成熟。简单地说，突变若干高变区位点(例如6-7个位点)以在每个位点产生所有可能的氨基取代。由此产生的抗体变体以单价形式从丝状噬菌体颗粒展示为与包装在每个颗粒内的M13的基因III产物的融合物。然后如本文所公开的筛选噬菌体展示的变体的生物活性(例如结合亲和力)。为了鉴定用于修饰的候选高变区位点，可以进行丙氨酸扫描诱变以鉴定对抗原结合有显著贡献的高变区残基。或者，或另外，分析抗原-抗体复合物的晶体结构以鉴定抗体和抗原之间的接触点可能是有益的。这种接触残基和相邻残基是根据本文详述的技术的取代的候选物。一旦产生此类变体，如本文所述对该组变体进行筛选，并且可以选择在一种或多种相关试验中具有优良特性的抗体用于进一步开发。
抗体的另一种类型的氨基酸变体改变了抗体的原始糖基化模式。改变是指缺失抗体中发现的一个或多个碳水化合物部分，和/或添加抗体中不存在的一个或多个糖基化位点。
抗体的糖基化通常是N-连接的和/或O-连接的。N-连接指碳水化合物部分与天冬酰胺残基侧链的附着。三肽序列天冬酰胺-X-丝氨酸和天冬酰胺-X-苏氨酸，其中X为除了脯氨酸之外的任何氨基酸，是用于将碳水化合物部分酶促附着至天冬酰胺侧链的最常见的识别序列。因此，这些三肽序列中的任一个在多肽中的存在产生潜在的糖基化位点。O-连接的糖基化是指糖N-乙酰半乳糖胺、半乳糖或木糖中的一种与羟基氨基酸(尽管也可以使用5-羟脯氨酸或5-羟赖氨酸，但最常见的是丝氨酸或苏氨酸)的附着。
通过改变氨基酸序列使其含有一个或多个上述三肽序列(对于N-连接的糖基化位点)方便地完成将糖基化位点添加至抗体。还可通过原始抗体的序列中添加一个或多个丝氨酸或苏氨酸残基或由一个或多个丝氨酸或苏氨酸残基取代(对于O-连接的糖基化位点而言)来进行改变。
通过本领域已知的多种方法制备编码抗-TSPAN33抗体的氨基酸序列变体的核酸分子。这些方法包括但不限于从天然来源分离(在天然氨基酸序列变体的情况下)或通过抗-TSPAN33抗体的早期制备的变体或非变体形式的寡核苷酸介导的(或定点)诱变、PCR诱变和盒式诱变准备。
人抗体
作为人源化的替代方案，可以产生人抗体。例如，现在有可能产生在免疫接种后能够在不产生内源免疫球蛋白的情况下产生完整的人类抗体库集的转基因动物(例如小鼠)。例如，已经描述了在嵌合和种系突变小鼠中抗体重链连接区(J
抗原结合抗体片段
在某些实施方案中，抗-TSPAN33药剂是保留至少一种所需活性(包括抗原结合)的抗体片段。已经开发了各种用于生产抗体片段的技术。传统上，这些片段是通过完整抗体的蛋白水解消化衍生的(参见例如Morimoto等人,Journal of Biochemical andBiophysical Methods 24:107-117(1992)和Brennan等人,Science 229:81(1985))。然而，这些片段现在可以通过重组宿主细胞直接产生。例如，Fab'-SH片段可以直接从大肠杆菌中回收并化学偶联以形成F(ab')
多特异性抗体和其他药剂
在一些实施方案中，抗-TSPAN33药剂将包含第一结合部分和第二结合部分，其中第一结合部分与为TSPAN33的第一分子特异性反应，而第二结合部分与是不同于第一分子的分子种类的第二分子特异性反应。此类药剂可包含多个第一结合部分、多个第二结合部分，或多个第一结合部分和多个第二结合部分。优选地，第一结合部分与第二结合部分的比例为约1：1，尽管其可在约1000：1至约1：1000的范围内，其中该比例优选根据价(valency)来测量。
在第一部分是抗体的那些实施方案中，结合部分也可为抗体。在优选的实施方案中，第一部分和第二部分通过接头部分连接，该接头部分可具有两个至数百或甚至数千价，用于通过一种或不同的化学作用附着第一和第二结合部分。双特异性抗体的实例包括对两种不同表位有反应性的那些；在一些实施方案中，一个表位为TSPAN33表位，而第二个表位在不相关的可溶性分子上。在其他实施方案中，双特异性抗体对TSPAN33上的表位和同一细胞表面上发现的不同分子上的表位具有反应性。在其他实施方案中，双特异性抗体对TSPAN33上的表位和对在不同细胞的表面上发现的不同分子上的表位具有反应性。
本发明的组合物还可包含第一药剂和第二药剂，其中第一药剂包含与选自TSPAN33的第一分子特异性反应的第一结合部分，而第二药剂包含与是不同于第一分子的分子种类的第二分子特异性反应的第二结合部分。第一药剂和/或第二药剂可为抗体。尽管优选比例为约1：1，但第一药剂与第二药剂的比例可在约1000：1至1：1000的范围内。在一些实施方案中，可能需要产生对至少两个不同表位具有结合特异性的多特异性(例如，双特异性)抗-TSPAN33抗体。示例性双特异性抗体可结合TSPAN33的两个不同表位。双特异性抗体可制备为全长抗体或抗体片段(例如F(ab')
根据用于制备双特异性抗体的另一种方法，可以工程化一对抗体分子之间的界面以使从重组细胞培养物中回收的异二聚体的百分比最大化。优选的界面包含抗体恒定区的C
双特异性抗体包括交联或“异源缀合物”抗体。例如，异源缀合物中的一个抗体可以与抗生物素蛋白缀合，另一种抗体与生物素缀合。异源缀合物抗体可以使用任何方便的交联方法制备。合适的交联剂是本领域熟知的，并与许多交联技术一起公开于美国专利号4,676,980中。
从抗体片段产生双特异性抗体的技术也已在文献中描述。例如，可以使用化学连接来制备双特异性抗体。Brennan等人,Science 229:81(1985)描述了一种方法，其中完整的抗体被蛋白水解切割以产生F(ab')
还描述了直接从重组细胞培养物中制备和分离双特异性抗体片段的各种技术。例如，已经使用亮氨酸拉链产生双特异性抗体。Kostelny等人,J.Immunol.148(5):1547-1553(1992)。通过基因融合，将来自Fos和Jun蛋白的亮氨酸拉链肽与两种不同抗体的Fab'部分连接。抗体同二聚体在铰链区被还原以形成单体，以及然后被再氧化以形成抗体异二聚体。这个方法也可用于生产抗体同二聚体。由Hollinger等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:6444-6448(1993)描述的“双抗体”技术提供了制备双特异性抗体片段的另一种机制。片段包含通过接头与轻链可变结构域(V
考虑了具有两个以上价的抗体。例如，可以制备三特异性抗体。Tutt等人,J.Immunol.147:60(1991)。
每个臂或其片段包含一个或多个结合位点的本发明的抗体(或聚合物或多肽)在本文中将称为“多价”抗体。例如，本发明的“二价”抗体的每个Fab或其片段包含两个结合位点，而本发明的“三价”多肽的每个Fab或其片段包含三个结合位点。在本发明的多价聚合物中，每个Fab的两个或更多个结合位点可与相同或不同的抗原结合。例如，本发明的多价多肽中的两个或更多个结合位点可针对相同抗原，例如针对所述抗原的相同部分或表位或针对所述抗原的两个或更多个相同或不同部分或表位；和/或可针对不同抗原；或其组合。因此，本发明的二价多肽例如可包含两个相同的结合位点，可包含针对抗原的第一部分或表位的第一结合位点和针对所述抗原的相同部分或表位或针对所述抗原的另一部分或表位的第二结合位点；或者可包含针对抗原的第一部分或表位的第一结合位点和针对不同抗原的第二结合位点。然而，如从上文的描述将清楚的是，本发明不限于此，因为本发明的多价多肽可包含针对相同或不同抗原的任何数目的结合位点。在一个实施方案中，多价多肽包含至少两个配体结合元件，其中一个包含本文所示的一个或多个CDR肽序列。在另一实施方案中，多价多肽包含三个配体结合位点，每个独立地选自本文公开的CDR序列。
至少一种配体结合元件结合TSPAN33。在一个实施方案中，至少一个配体结合元件结合另一靶。在一个实施方案中，在多价结合分子中存在多达10000个结合元件，并且配体结合元件可连接至支架。
每个Fab或其片段含有至少两个结合位点的本发明的抗体(或聚合物或多肽)也将被称为“多特异性”，其中至少一个结合位点针对第一抗原并且第二结合位点针对不同于第一抗原的第二抗原。因此，“双特异性”聚合物包含至少一个针对第一抗原的位点和至少一个针对第二抗原的第二位点，而“三特异性”是包含至少一个针对第一抗原的结合位点、至少一个针对第二抗原的另外的结合位点和至少一个针对第三抗原的另外的结合位点的聚合物，等等。因此，在他们最简单的形式中，本发明的双特异性多肽是本发明的二价多肽(每个Fab)。然而，如从上文的描述将清楚的是，本发明不限于此，因为本发明的多特异性多肽可包含针对两种或更多种不同抗原的任何数目的结合位点。
其他修饰
考虑了抗-TSPAN33抗体的其他修饰。例如，本发明还涉及免疫缀合物，其包含与细胞毒性剂诸如毒素(例如细菌、真菌、植物或动物来源的酶活性毒素或其片段)或放射性同位素(例如放射性缀合物)或细胞毒性药物缀合的本文所述的抗体。此类缀合物有时称为“药剂-药物缀合物”或“ADC”。缀合物使用多种双功能蛋白质偶联剂(诸如N-琥珀酰亚胺基-3-(2-吡啶基二硫基)丙酸酯(SPDP)、iminothiolane(IT)、亚氨酸酯的双功能衍生物(诸如己二亚胺酸二甲酯HCL)、活性酯(诸如二琥珀酰亚胺基辛二酸酯)、醛(诸如戊二醛)、双叠氮基化合物(诸如双(对叠氮基苯甲酰基)己二胺)、双重氮衍生物(诸如双(对重氮基苯甲酰基)乙二胺)、二异氰酸酯(诸如甲苯2,6-二异氰酸酯)以及双活性氟化合物(诸如1,5-二氟-2,4-二硝基苯)制备。
本文公开的抗-TSPAN33抗体还可以配制成免疫脂质体。含有抗体的脂质体通过本领域已知的方法制备，诸如Epstein等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82:3688(1985)；Hwang等人,Proc.Natl Acad.Sci.USA 77:4030(1980)；以及美国专利号4,485,045和4,544,545中所述。具有增加的循环时间的脂质体公开于美国专利号5,013,556中。例如，脂质体可以通过反相蒸发方法用包含磷脂酰胆碱、胆固醇和PEG衍生的磷脂酰乙醇胺(PEG-PE)的脂质组合物产生。脂质体通过限定孔大小的滤器挤出，以产生具有所需直径的脂质体。本发明的抗体的Fab'片段可以通过二硫键交换反应与脂质体缀合，如Martin等人,J.Biol.Chem.257:286-288(1982)中所述。另一种活性成分任选地包含在脂质体内。
通过本领域熟知的技术，诸如使用上述异双功能(heterobifunctional)交联剂，酶或其他多肽可以与抗-TSPAN33抗体共价结合。或者，可以使用本领域熟知的重组DNA技术(参见例如Neuberger等人,Nature 312:604-608(1984))来构建融合蛋白，该融合蛋白至少包含与本发明酶的至少功能活性部分连接的本发明抗体的抗原结合区。
在本发明的某些实施方案中，可能需要使用抗体片段而非完整抗体，以增加例如靶组织和细胞的穿透。在这种情况下，可能需要修饰抗体片段以增加其血清半衰期。这可以例如通过将补救受体结合表位掺入抗体片段中(例如通过抗体片段中适当区域的突变，或通过将该表位掺入肽标签中，通过DNA或肽合成，该肽标签然后在末端或中间与抗体片段融合)来实现。参见1996年10月17日公布的WO 96/32478。
抗-TSPAN33抗体的共价修饰也包括在本发明的范围内。如果适用，它们可以通过化学合成或通过抗体的酶促或化学裂解来制备。通过使抗体的靶向氨基酸残基与能够与所选侧链或N末端或C末端残基反应的有机衍生剂反应，将抗体的其他类型的共价修饰引入到分子中。多肽的共价修饰的实例描述于美国专利号5,534,615中，其具体地通过引用并入本文。抗体的共价修饰的一种优选类型包括以美国专利号4,640,835；4,496,689；4,301,144；4,670,417；4,791,192或4,179,337中所述的方式将抗体连接到各种非蛋白质聚合物(例如聚乙二醇、聚丙二醇或聚氧化乙烯类(polyoxyalkylenes))中的一种。
核酸、载体、宿主细胞和重组方法
本发明还提供了编码抗-TSPAN33抗体的分离的核酸，包含该核酸的载体和宿主细胞，以及用于生产该抗体的重组技术。
本文提供了包含编码抗-TSPAN33药剂或抗体或其片段的核苷酸序列的核酸(例如，分离的核酸)。在一些实施方案中，核酸编码本文提供的抗-TSPAN33药剂的免疫球蛋白重链可变结构域。在一些实施方案中，核酸编码本文提供的抗-TSPAN33药剂的免疫球蛋白轻链可变结构域。在一些实施方案中，核酸编码本文提供的抗-TSPAN33药剂的免疫球蛋白重链可变结构域和免疫球蛋白轻链可变结构域。在一些实施方案中，核酸包含编码SEQ IDNO.1-46的任一个的氨基酸序列的核苷酸序列。例如，核酸可包含编码SEQ ID NO.1-3、5-7、9-11、13-15、17-19、21-23、25-27、29-31、33-35、37-39和41-46的任一个的CDR氨基酸序列的核苷酸序列。核酸可包含编码SEQ ID NO.4、12、20、28和36的任一个的免疫球蛋白重链可变结构域氨基酸序列的核苷酸序列。核酸可包含编码SEQ ID NO.8、16、24、32和40的任一个的免疫球蛋白轻链可变结构域氨基酸序列的核苷酸序列。
为了抗体的重组生产，可分离编码该抗体的核酸并将其插入可复制载体中，以用于进一步克隆(DNA扩增)或表达。在另一实施方案中，抗体可通过同源重组生产，例如如美国专利号5,204,244中所述的，具体地通过引用并入本文。编码单克隆抗体的DNA易于使用常规方法(例如通过使用能够特异性结合编码抗体重链和轻链的基因的寡核苷酸探针)分离和测序。许多载体是可用的。载体组分通常包括但不限于以下的一种或多种：信号序列、复制起点、一个或多个标记基因、增强子元件、启动子和转录终止序列，例如如于1996年7月9日授权的美国专利号5,534,615中所述的，并具体地通过引用并入本文。
用于克隆或表达本文载体中的DNA的合适的宿主细胞为上述原核生物、酵母或高等真核生物细胞。用于此目的的合适的原核生物包括真细菌，诸如革兰氏阴性或革兰氏阳性生物，例如肠杆菌科(Enterobacteriaceae)，诸如埃希氏菌属(Escherichia)，例如大肠杆菌(E.coli)，肠杆菌属(Enterobacter)，欧文氏菌属(Erwinia)，克雷伯氏菌属(Klebsiella)，变形杆菌属(Proteus)，沙门氏菌属(Salmonella)，例如鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)，沙雷氏菌属(Serratia)，例如粘质沙雷氏菌(Serratiamarcescans)，和志贺氏菌属(Shigella)，以及芽孢杆菌属(Bacilli)，诸如枯草芽孢杆菌(B.subtilis)和地衣芽孢杆菌(B.licheniformis)(例如于1989年4月12日公开的DD266,710中披露的地衣芽孢杆菌41P)，假单胞菌属(Pseudomonas)，诸如铜绿假单胞菌(P.aeruginosa)和链霉菌属(Streptomyces)。一种优选的大肠杆菌克隆宿主为大肠杆菌294(ATCC31,446)，尽管诸如大肠杆菌B、大肠杆菌X1776(ATCC31,537)和大肠杆菌W3110(ATCC27,325)的其他菌株也是合适的。这些实例是说明性的而非限制性的。
除原核生物之外，真核微生物(诸如丝状真菌或酵母)是编码抗-TSPAN33抗体载体的合适克隆或表达宿主。酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)或常见的面包酵母是低等真核宿主微生物中最常用的。然而，许多其他属、种和菌株是通常可获得的并且在本文中是有用的，诸如裂殖酵母菌丝(Schizosaccharomyces pombe)；克鲁维酵母菌属(Kluyveromyces)宿主，诸如例如乳酸克鲁维酵母(K.lactis)，脆壁克鲁维酵母(K.fragilis)(ATCC12,424)，保加利亚克鲁维酵母(K.bulgaricus)(ATCC16,045)，维克拉姆克鲁维酵母(K.wickeramii)(ATCC24,178)，K.waltii(ATCC56,500)，果蝇克鲁维酵母(K.drosophilarum)(ATCC36,906)，耐热克鲁维酵母(K.thermotolerans)以及K.marxianus；子囊菌酵母属(yarrowia)(EP 402,226)；毕赤酵母(Pichia pastoris)(EP183,070)；假丝酵母(Candida)；Trichoderma reesia(EP 244,234)；粗糙链孢霉(Neurospora crassa)；许旺酵母属(Schwanniomyces)，诸如西方许旺酵母(Schwanniomyces occidentalis)；以及丝状真菌，诸如例如链孢菌属(Neurospora)，青霉菌属(Penicillium)，Tolypocladium，和曲霉菌属(Aspergillus)宿主，诸如构巢曲菌(A.nidulans)和黑曲霉(A.niger)。
用于表达糖基化的抗-TSPAN33抗体的合适的宿主细胞衍生自多细胞生物。无脊椎动物细胞的实例包括植物和昆虫细胞。已经鉴定出来自宿主(诸如草地贪夜蛾(Spodopterafrugiperda)(毛虫)、埃及伊蚊(Aedes aegypti)(蚊子)、白纹伊蚊(Aedes albopictus)(蚊子)、黑腹果蝇(Drosophila melanogaster)(果蝇)、以及家蚕(Bombyx mori)(蚕蛾))的多种杆状病毒株和变体以及相应的允许的昆虫宿主细胞。多种用于转染的病毒株是公众可获得的，例如苜蓿银纹夜蛾(Autographa californica)NPV的L-1变体和家蚕NPV的Bm-5株，并且这些病毒可用作本发明的病毒，特别是用于草地贪夜蛾细胞的转染。棉花、玉米、马铃薯、大豆、矮牵牛、番茄和烟草的植物细胞培养物也可以用作宿主。
然而，对脊椎动物细胞的兴趣最大，并且脊椎动物细胞在培养(组织培养)中的增殖已经成为常规方法。有用的哺乳动物宿主细胞系的实例为用SV 40转化的猴肾CV1系(COS-7，ATCC CRL 1651)；人胚肾系(在悬浮培养中亚克隆生长的293或293细胞，Graham等人,J.Gen Virol.36:59(1977))；幼仓鼠肾细胞(BHK，ATCC CCL 10)；中国仓鼠卵巢细胞/-DHFR(CHO，Urlaub等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77:4216(1980))；小鼠支持细胞(TM4，Mather,Biol.Reprod.23:243-251(1980))；猴肾细胞(CV1 ATCC CCL 70)；非洲绿猴肾细胞(VERO-76，ATCC CRL-1587)；人宫颈癌细胞(HELA，ATCC CCL 2)；犬肾细胞(MDCK，ATCC CCL34)；buffalo大鼠肝细胞(BRL 3A，ATCC CRL1442)；人肺细胞(W138，ATCC CCL 75)；人肝细胞(Hep G2，HB 8065)；小鼠乳腺肿瘤(MMT 060562，ATCC CCL51)；TRI细胞(Mather等人,Annals N.Y.Acad.Sci.383:44-68(1982))；MRC5细胞；FS4细胞；以及人肝癌细胞系(HepG2)。
用上述用于抗体生产的表达或克隆载体转化宿主细胞，并在常规营养培养基中培养，该营养培养基经适当修饰以诱导启动子、选择转化体或扩增编码所需序列的基因。
用于产生本发明抗体的宿主细胞可在多种培养基中培养。市售培养基，诸如Ham'sF10(Sigma)、最小必需培养基((MEM)，Sigma)、RPMI-1640(Sigma)和Dulbecco's改良Eagle's培养基((DMEM)，Sigma)适于培养宿主细胞。另外，如Ham等人,Meth.Enz.58:44(1979)，Barnes等人,Anal.Biochem.102:255(1980)，美国专利号4,767,704；4,657,866；4,927,762；4,560,655；或5,122,469；WO 90/03430；WO 87/00195；或U.S.Pat.Re.30,985中描述的任何培养基可用作宿主细胞的培养基。这些培养基中的任一种均可根据需要补充激素和/或其他生长因子(诸如胰岛素、转铁蛋白或表皮生长因子)，盐(诸如氯化钠、钙、镁，和磷酸盐)，缓冲液(诸如HEPES)，核苷酸(诸如腺苷和胸苷)，抗生素(诸如GENTAMYCIN
当使用重组技术时，抗体可以在细胞内、周质空间中产生，或直接分泌到培养基中。如果抗体在细胞内产生，则作为第一步骤，例如通过离心或超滤，除去宿主细胞或裂解片段的颗粒碎片。Carter等人,Bio/Technology 10:163-167(1992)描述了分离分泌到大肠杆菌周质空间的抗体的方法。简单地说，将细胞糊在乙酸钠(pH 3.5)、EDTA和苯甲基磺酰氟(PMSF)存在下解冻30分钟。可通过离心去除细胞碎片。当抗体分泌到培养基中时，通常首先使用市售蛋白质浓缩过滤器(例如Amicon或Millipore Pellicon超滤单元)浓缩来自这种表达体系的上清液。蛋白酶抑制剂(诸如PMSF)可包括在任何前述步骤中，以抑制蛋白水解并且可包括抗生素以防止外来污染物的生长。
从细胞制备的抗体组合物可以使用例如羟基磷灰石层析、凝胶电泳、透析和亲和层析进行纯化，其中亲和层析是优选的纯化技术。蛋白A作为亲和配体的适合性取决于抗体中存在的任何免疫球蛋白Fc结构域的种类和同种型。蛋白A可以用于纯化基于人重链的抗体(Lindmark等人，J.Immunol.Meth.62:1-13(1983))。蛋白G被推荐用于所有小鼠同种型和人γ3(Guss等人，EMBO J.5:15671575(1986))。亲和配体附着的基质最通常为琼脂糖，但也可使用其他基质。机械稳定的基质(诸如受控孔玻璃或聚(苯乙烯二乙烯基)苯)允许比用琼脂糖可实现的更快的流速和更短的处理时间。其中抗体包含CH3结构域，BakerbondABX.TM.树脂(J.T.Baker，Phillipsburg，N.J.)可用于纯化。根据所回收的抗体，也可使用其他蛋白质纯化技术诸如在离子交换柱上分级、乙醇沉淀、反相HPLC、在二氧化硅上的层析、在肝素SEPHAROSE
在任何初步纯化步骤之后，可使用pH在约2.5-4.5之间的洗脱缓冲液对包含感兴趣抗体和污染物的混合物进行低pH疏水相互作用层析，优选在低盐浓度(例如约0-0.25M的盐)下进行。
药物制剂、给药和施用途径
本发明提供了抗-TSPAN33抗体和相关组合物以及方法，其导致从身体中消除表达TSPAN33的细胞，并鉴定和定量组织样品中表达TSPAN33的细胞的数目。
本发明的治疗方法和组合物被认为是“基于TSPAN33的”以表明这些治疗可以改变不希望的或毒性的表达TSPAN33的细胞(诸如淋巴瘤或自身免疫性B淋巴细胞)的相对或绝对数目。
一种控制患者中不期望的表达TSPAN33的细胞的量的方法是通过提供包含一种或多种抗-TSPAN33抗体的组合物来引起对表达TSPAN33的细胞的细胞毒性活性。
抗-TSPAN33抗体可被配制成用于各种目的(包括治疗疾病、病症或物理创伤)的药物组合物。可将包含一种或多种本发明的抗-TSPAN33抗体的药物组合物掺入用于这种治疗的试剂盒和医疗装置中。医疗装置可用于将本发明的药物组合物施用于需要其的患者，并且根据本发明的一个实施方案，提供了包括此类装置的试剂盒。此类装置和试剂盒可设计用于本发明的药物组合物的常规施用，包括自我施用。
通过将具有所需纯度的抗体与任选的生理学可接受的载体、赋形剂或稳定剂(Remington's Pharmaceutical Sciences第16版，Osol，A.Ed.(1980))以冻干制剂或水性溶液的形式混合来制备抗体的治疗制剂以进行储存。可接受的载体、赋形剂或稳定剂在所采用的剂量和浓度对接受者是无毒的，并且包括缓冲液诸如磷酸盐、柠檬酸盐和其他有机酸；抗氧化剂，包括抗坏血酸和甲硫氨酸；防腐剂(诸如十八烷基二甲基苄基氯化铵(octadecyldimethylbenzyl ammonium chloride)；氯化六甲季铵；苯扎氯铵，苄索氯铵；苯酚，丁醇或苯甲醇；对羟基苯甲酸烷基酯(alkyl parabens)，诸如对羟基苯甲酸甲酯或对羟基苯甲酸丙酯；儿茶酚；间苯二酚；环己醇；3-戊醇；以及间甲酚)；低分子量(少于约10个残基)多肽；蛋白质，诸如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水性聚合物，诸如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，诸如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、精氨酸或赖氨酸；单糖、二糖和其他碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精类；螯合剂，诸如EDTA；糖，诸如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨糖醇；成盐抗衡离子，诸如钠；金属络合物(例如锌蛋白络合物)；和/或非离子表面活性剂，诸如TWEEN
根据所治疗的特别适应症的需要，本文的制剂还可含有多于一种的活性化合物，优选具有彼此不会不利影响的互补活性的那些。这类分子合适地以对预期目的有效的量组合存在。
活性成分也可被包埋在例如通过凝聚技术或通过界面聚合制备的微胶囊中，例如分别在胶体药物递送体系(例如脂质体、白蛋白微球、微乳液、纳米颗粒和纳米胶囊)中或在粗乳液(macroemulsion)中的羟甲基纤维素或明胶-微胶囊和聚-(甲基丙烯酸甲酯)微胶囊。此类技术公开于Remington's Pharmaceutical Sciences第16版，Osol，A.Ed.(1980)。
用于体内施用的制剂必须是无菌的。这可以容易地实现，例如通过无菌滤膜过滤。
可制备缓释制剂。缓释制剂的合适实例包括含有抗体的固体疏水性聚合物的半透性基质，该基质为成型制品的形式，例如薄膜、或微胶囊。缓释基质的实例包括聚酯，水凝胶(例如聚(甲基丙烯酸2-羟乙酯)或聚(乙烯醇))，聚丙交酯(美国专利号3，773，919)，L-谷氨酸和γ-L-谷氨酸乙酯的共聚物，不可降解的乙烯-乙酸乙烯酯，可降解的乳酸-乙醇酸共聚物诸如Lupron Depot
对于治疗应用，本发明的抗-TSPAN33药剂例如抗体以药学上可接受的剂型(诸如以上所讨论的那些)施用于哺乳动物，优选人，所述药学上可接受的剂型包括可以以推注或通过一段时间的连续输注静脉内施用于人的剂型，或通过肌内、腹膜内、脑脊髓内、皮下、关节内、滑膜内、鞘内、口服、局部或吸入途径施用于人的剂型。
对于疾病的预防或治疗，抗体的适当剂量将取决于所治疗疾病的类型(如上所定义)，疾病的严重度和病程，是否出于预防或治疗目的而施用抗体，既往治疗，患者的临床史和对抗体的反应，以及主治医师的判断。可以一次或通过一系列治疗将抗体适当地施用于患者。
取决于疾病的类型和严重度，约1μg/kg至约50mg/kg(例如0.1-20mg/kg)的抗体是用于施用于患者的初始候选剂量，无论例如通过一次或多次单独施用，还是通过连续输注。典型的每日或每周剂量可在约1μg/kg至约20mg/kg或更高的范围内，取决于上述提及因素。对于几天或更长的重复施用，根据病症，重复治疗直至出现所期望的疾病症状的抑制。然而，其他剂量方案可能是有用的。通过常规技术和试验，包括例如放射成像，可以容易地监测这种治疗的进展。可以采用使用所述抗体测定体液或组织中的TSPAN33水平的检测方法以优化患者对治疗性抗体的暴露。
根据本发明的另一实施方案，包含干扰TSPAN33活性的药剂例如mAb的组合物作为单一疗法施用，而在其他优选实施方案中，包含干扰TSPAN33活性的药剂的组合物作为联合疗法的部分施用。在一些情况下，抗体在预防或治疗疾病中的有效性可通过抗体的连续施用或与对那些目的有效的另一种药剂(诸如用于治疗癌症的化疗药物)组合施用来改善。在其他情况下，抗-TSPAN33药剂可用于增强或敏感化细胞对化疗治疗，从而允许在较低剂量和较低毒性下的功效。除了施用包含减少表达TSPAN33的细胞的数目的药剂的组合物之外，优选的联合疗法还包括递送选自以下的第二治疗方案：施用化疗剂、放射疗法、手术和任何前述的组合。
此类其他药剂可存在于所施用的组合物中或可单独施用。此外，抗体适当地连续施用或与其他药剂或方式例如用于治疗癌症的化疗药物或放射或免疫抑制药物组合施用。
本发明的抗-TSPAN33药剂的研究和诊断(包括临床诊断)用途
本发明的抗-TSPAN33药剂(例如抗体)可用于检测和/或纯化例如来自体液或在体液或组织中的细胞上表达的TSPAN33。在某些情况下，本文提供的抗-TSPAN33药剂可用作B细胞活化的生物标志物，用于诊断其中存在TSPAN33的变态反应、自身免疫性疾病和/或淋巴瘤。
本文提供了包含本文所述的抗-TSPAN33药剂的诊断试剂。例如，本文提供的抗-TSPAN33药剂(例如抗体)可用于检测和/或纯化例如来自体液或在体液或组织中的细胞上表达的TSPAN33。本文还提供了用于检测TSPAN33的方法。例如，一种方法可包含使样品(例如已知或疑似含有TSPAN33的生物样品)与本文提供的抗-TSPAN33药剂接触，并且，如果该样品含有TSPAN33，则检测TSPAN33：抗-TSPAN33复合物。本文还提供了包含本文所述的抗-TSPAN33药剂的试剂和检测TSPAN33用于研究目的的方法。
抗-TSPAN33抗体可用于TSPAN33的诊断测定，例如检测其在特定细胞、组织或体液中的存在。此类诊断方法可用于诊断例如过度增殖性疾病或病症。因此，本发明包括临床诊断用途以及研究用途。
在一些实施方案中，抗-TSPAN33药剂/抗体包含可检测的标志或标记。在一些实施方案中，抗-TSPAN33药剂/抗体与可检测的标志或标记缀合。对于研究和诊断应用，抗体可用可检测部分标记。有许多标记可用，其通常可以分为以下类别：
(a)放射性同位素，诸如
(b)荧光标记物，诸如稀土螯合物(铕螯合物)或荧光素及其衍生物、若丹明及其衍生物、丹磺、丽丝胺、藻红蛋白、德克萨斯红和Brilliant Violet
(c)各种酶-底物标记是可获得的，并且美国专利号4,275,149对其中一些进行了综述。酶通常催化发色底物的化学变化，其可以使用各种技术测量。例如，酶可催化底物的颜色变化，其可以用分光光度法测量。或者，酶可改变底物的荧光或化学发光。用于定量荧光变化的技术如上所述。化学发光底物通过化学反应变得被电子激发，以及然后发射可以被测量(例如使用化学发光计)的光或将能量供给荧光受体。酶标记的实例包括萤光素酶类(例如萤火虫萤光素酶和细菌萤光素酶；美国专利号4,737,456)，萤光素、2,3-二氢酞嗪二酮、苹果酸脱氢酶、脲酶、过氧化物酶诸如辣根过氧化物酶(HRPO)、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶、葡糖淀粉酶、溶菌酶、糖氧化酶(例如葡糖氧化酶、半乳糖氧化酶和葡萄糖-6-磷酸脱氢酶)、杂环氧化酶(诸如尿酸酶和黄嘌呤氧化酶)、乳过氧化物酶、微过氧化物酶等。将酶与抗体缀合的技术描述于O'Sullivan等人，Methods for the Preparation of Enzyme-Antibody Conjugates for use in Enzyme Immunoassay，in Methods in Enzym.(edJ.Langone&H.Van Vunakis)，AcademiCpress，New York，73:147-166(1981)。
例如，酶-底物组合的实例包括：
(i)以过氧化氢酶为底物的辣根过氧化物酶(HRPO)，其中过氧化氢酶氧化染料前体(例如邻苯二胺(OPD)或3,3',5,5'-四甲基联苯胺盐酸盐(TMB))；
(ii)以对硝基苯基磷酸酯作为发色底物的碱性磷酸酶(AP)；和
(iii)β-D-半乳糖苷酶(β-D-Gal)，其具有发色底物(例如对硝基苯基-β-D-半乳糖苷酶)或荧光底物4-甲基伞形酮基-β-D-半乳糖苷酶。
本领域技术人员可使用许多其他酶-底物组合。关于这些的一般性综述，参见美国专利号4,275,149和4,318,980。
有时，标记与抗体间接缀合。本领域技术人员将知晓用于实现这一点的各种技术。例如，抗体可以与生物素缀合，并且上述三个宽泛类别标记中的任一种可以与抗生物素蛋白缀合，或反之亦然。生物素选择性地结合抗生物素蛋白，并且因此标记可以以这种间接方式与抗体缀合。或者，为了实现标记与抗体的间接缀合，抗体与小半抗原(例如地高辛)缀合，且上述不同类型标记中的之一与抗-半抗原抗体(例如抗-地高辛抗体)缀合。因此，可以实现标记与抗体的间接缀合。
在本发明的另一实施方案中，不需要标记抗-TSPAN33抗体，并且可以例如使用结合抗-TSPAN33抗体的标记抗体来检测其存在。
在一些实施方案中，将本文的抗-TSPAN33药剂/抗体固定在固体支持物或基材上。在一些实施方案中，本文的抗-TSPAN33药剂/抗体非扩散地固定在固体支持物上(例如抗-TSPAN33药剂/抗体不会从固体支持物上分离)。固体支持物或基材可以为抗-TSPAN33药剂/抗体可以直接或间接附着于其上的任何物理上可分离的固体，包括但不限于由微阵列和孔提供的表面，以及颗粒诸如珠(例如顺磁珠、磁珠、微珠、纳米珠)，微粒和纳米颗粒。固体支持物还可以包括例如芯片，柱，光纤，擦拭物(wipes)，过滤器(例如平面过滤器)，一个或多个毛细管，玻璃和改性或功能化的玻璃(例如可控孔玻璃(CPG))，石英，云母，重氮化膜(纸或尼龙)，聚甲醛，纤维素，醋酸纤维素，纸，陶瓷，金属，类金属，半导体材料，量子点，包覆珠或颗粒，其他色谱材料，磁性颗粒；塑料(包括丙烯酸类，聚苯乙烯，苯乙烯或其他材料的共聚物，聚丁烯，聚氨酯，TEFLON
本发明的抗体可用于任何已知的测定方法中，诸如流式细胞术、免疫组织化学、免疫荧光、质谱流式细胞术(mass cytometry)(例如Cytof仪器)、竞争结合测定、直接和间接夹心测定和免疫沉淀测定。Zola，Monoclonal Antibodies:A Manual of Techniques，第147-158页(CRC Press，Inc.1987)。
流式细胞术和质谱流式细胞术测定涉及使用单一的一抗来特异性识别在个体细胞的分散悬浮液的表面上表达的靶分子的存在。分散的细胞通常获自生物流体样品(例如血液)，但也可获自由固体组织样品(诸如脾或肿瘤活检)制备的单细胞分散体。一抗可直接与可检测部分(例如荧光团诸如用于流式细胞术的藻红蛋白或用于质谱流式细胞术的重金属螯合物)缀合。或者，一抗可未标记或使用诸如生物素的不可检测的标签进行标记，然后由可检测标记的二抗检测一抗，该二抗特异性识别一抗本身或一抗上的标签。然后在能够进行单细胞检测的仪器(例如流式细胞仪、质谱流式细胞仪、荧光显微镜或明视场光学显微镜)中分析经标记的细胞，以鉴定在分散的群体或组织样品中表达被一抗识别的靶的那些个体细胞。流式细胞术原理的技术基础和实际应用的详细说明可在例如Shapiro，Practical Flow Cytometry，第4版，Wiley，2003中找到。
夹心测定涉及使用两种抗体，每种能够与被检测蛋白的不同免疫原性部分或表位结合。在夹心测定中，测试样品分析物与固定在固体支持物上的第一抗体结合，之后第二抗体与分析物结合，从而形成不溶的三部分复合物。参见例如美国专利号4,376,110。第二抗体本身可用可检测部分标记(直接夹心测定)或可使用用可检测部分标记的抗免疫球蛋白抗体测量(间接夹心测定)。例如，一种类型的夹心测定为ELISA测定，在这种情况下，可检测部分为酶。在细胞ELISA中，可使用首先附着于支持物并识别不同细胞表面蛋白的抗体将靶细胞群附着于固体支持物。这些第一抗体将细胞捕获到支持物上。然后可以通过向捕获的细胞加入抗-TSPAN33抗体并检测附着于细胞的TSPAN33抗体的量来检测细胞表面上的TSPAN33。
对于免疫组织化学，血液或组织样品可为新鲜的或冷冻的，或者可包埋在石蜡中，并用例如防腐剂(诸如福尔马林)固定。
抗体也可用于体内诊断测定。通常，抗体用放射性核素(诸如
细胞上的TSPAN33的检测
本文提供了用于检测细胞上的TSPAN33的药剂和方法。在一些实施方案中，本文提供了用于检测免疫细胞上的TSPAN33的药剂和方法。免疫细胞上TSPAN33的检测可指在免疫细胞表面上(例如通过表面染色)和/或在免疫细胞内(例如通过细胞内染色)检测。在一些实施方案中，提供了用于检测免疫细胞的异质群体中的TSPAN33的药剂和方法。免疫细胞的异质群体可包含两种或更多种类型的免疫细胞。例如，免疫细胞的异质群体可包含以下两种或更多种：B细胞、浆细胞样树突细胞(pDC)、淋巴细胞、白细胞、T细胞、单核细胞、巨噬细胞、嗜中性粒细胞、髓样树突细胞(mDC)、先天淋巴细胞、肥大细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞、自然杀伤细胞等。在一些实施方案中，免疫细胞的异质群体包含外周血液单个核细胞(PBMC)，其可包括例如T细胞、B细胞、自然杀伤细胞和单核细胞。
在一些实施方案中，本文提供了用于检测B细胞上的TSPAN33的药剂和方法。B细胞上TSPAN33的检测可指在B细胞表面上(例如通过表面染色)和/或B细胞内部(例如通过细胞内染色)的检测。在一些实施方案中，本文提供了用于检测活化的B细胞上的TSPAN33的药剂和方法。活化的B细胞上的TSPAN33的检测可指在活化的B细胞的表面上(例如通过表面染色)和/或在活化的B细胞内(例如通过细胞内染色)的检测。B细胞可在体外活化(例如通过将培养物中的B细胞暴露于某些刺激因子(例如CD40配体(也称为CD40L、CD154、TNFSF5、CD40LG、HIGMl、IGM、IMD3、T-BAM、TRAP和gp39)和IL-4))。在某些情况下，B细胞在体内活化。例如，B细胞在体内可作为对病原体的过敏反应和/或免疫反应的部分被活化；并且可在某些疾病或病症(例如白血病、淋巴瘤(例如霍奇金病、非霍奇金淋巴瘤、弥漫性大B细胞淋巴瘤、伯基特淋巴瘤)和自身免疫性疾病(类风湿性关节炎)中活化。
在一些实施方案中，本文提供了用于检测单核细胞上的TSPAN33的药剂和方法。在一些实施方案中，本文提供用于在存在活化的B细胞和/或用刺激因子(例如CD40L和/或IL-4)活化的PBMC群中检测单核细胞上的TSPAN33的药剂和方法。单核细胞上的TSPAN33的检测可指在单核细胞表面上(例如通过表面染色)和/或在单核细胞内部(例如通过细胞内染色)的检测。
通常，使细胞(例如PBMC、B细胞、活化的B细胞、单核细胞)与本文所述的抗-TSPAN33药剂接触(例如在如实施例5中所述的流式细胞术测定中；或在任何合适的蛋白质或细胞检测测定中)。在一些实施方案中，TSPAN33在某些免疫细胞中被本文所述的抗-TSPAN33药剂以显著水平检测到。TSPAN33可在某些免疫细胞中被本文所述的抗-TSPAN33药剂以显著水平检测到，而在其他免疫细胞中没有被显著检测到。例如，TSPAN33可在活化的B细胞中通过本文所述的抗-TSPAN33药剂被以显著水平检测到，而在静息B细胞中没有被显著检测到。在另一个实例中，TSPAN33可在活化的B细胞中通过本文所述的抗-TSPAN33药剂以显著水平检测到，而在T细胞中没有被显著检测到。在某些免疫细胞中检测TSPAN33的水平可根据某些因素诸如例如检测测定的类型、检测试剂的类型(例如染料类型)、抗体浓度、供体细胞变异性等而变化。
以显著水平检测到TSPAN33可指在流式细胞术测定中测量的特定信噪比(S：N)(例如阈值或范围)。在一些实施方案中，以显著水平检测到TSPAN33是指信噪比(S：N)为约2.0或更大。例如，以显著水平检测到TSPAN33可指信噪比(S：N)为约2或更大、约2.5或更大、约3或更大、约4或更大、约5或更大、约6或更大、约7或更大、约8或更大、约9或更大、约10或更大、约11或更大、约12或更大、约13或更大、约14或更大、约15或更大、约16或更大、约17或更大、约18或更大、约19或更大、约20或更大、约25或更大、约30或更大、约35或更大、约40或更大、约45或更大、约50或更大、约55或更大、或约60或更大。没有显著检测到TSPAN33可指在流式细胞术测定中测量的特定信噪比(S：N)(例如阈值或范围)。在一些实施方案中，没有显著检测到TSPAN33是指信噪比(S：N)为约1.5或更小。在一些实施方案中，没有显著检测到TSPAN33是指信噪比(S：N)为约1或更小。
本文提供了诊断与异常水平的TSPAN33相关的疾病或病症的方法。异常水平的TSPAN33可指相对于对照蛋白的水平、相对于对照受试者(例如健康受试者)中的TSPAN33的水平、相对于疾病或病症发作之前相同受试者中的TSPAN33的水平、或相对于对照细胞中的TSPAN33的表达，TSPAN33的水平升高。TSPAN33水平升高可指约10％升高、约25％升高、约50％升高、约100％升高、约200％升高、约500％升高或更高。与异常水平的TSPAN33相关的疾病或病症可包括白血病、淋巴瘤和自身免疫性疾病，其实例在下文提供。
含有本发明的抗-TSPAN33药剂的诊断试剂盒
为方便起见，本发明的抗体可以在试剂盒(例如用于进行诊断测定的预定量的试剂和说明书的包装组合)中提供。当抗体用荧光团标记时，试剂盒将包括与抗-TSPAN33抗体的非特异性结合的对照相同的同种型阴性对照无关抗体。当抗体用酶标记时，试剂盒将包括酶所需的底物和辅因子(例如提供可检测发色团或荧光团的底物前体)。此外，可包括其他添加剂，诸如稳定剂、缓冲剂(例如阻断缓冲剂或裂解缓冲剂)等。各种试剂的相对量可以广泛变化以提供极大地优化测定灵敏度的试剂溶液浓度。特别地，试剂可作为干粉(通常是冻干的)提供，其包括在溶解时将提供具有适当浓度的试剂溶液的赋形剂。
抗-TSPAN33药剂的治疗用途
本文提供了治疗或预防与异常水平的TSPAN33相关的疾病或病症的方法。异常水平的TSPAN33可指相对于对照蛋白的水平、相对于对照受试者(例如健康受试者)中的TSPAN33的水平、相对于疾病或病症发作之前相同受试者中的TSPAN33的水平、或相对于对照细胞中的TSPAN33的表达，TSPAN33的水平升高。TSPAN33水平升高可指约10％升高、约25％升高、约50％升高、约100％升高、约200％升高、约500％升高或更高。
本文还提供了治疗或预防与异常水平的活化的B细胞相关的疾病或病症的方法。异常水平的活化的B细胞的可指相对于对照受试者(例如健康受试者)中活化的B细胞的水平、或相对于疾病或病症发作之前相同受试者中活化的B细胞的水平，活化的B细胞的水平升高。活化的B细胞的水平升高可指约10％升高、约25％升高、约50％升高、约100％升高、约200％升高、约500％升高或更高。
本文的方法可包含向需要治疗的受试者施用本文的抗-TSPAN33药剂。在一些实施方案中，本文提供了用于治疗疾病和病症的治疗性抗体，该疾病和病症包括TSPAN33-阳性淋巴瘤和白血病，以及涉及活化的B细胞的自身免疫性疾病。在一些实施方案中，抗-TSPAN33药剂与细胞毒性剂(诸如放射性药剂、自由基或毒素)缀合。将抗-TSPAN33药剂与细胞毒性剂缀合可改善抗-TSPAN33药剂的治疗用途，例如通过使用抗-TSPAN33药剂作为靶向剂将细胞毒性剂递送至特定靶(例如活化的B细胞、病变的B细胞)来提高抗体的效力。在一些实施方案中，抗-TSPAN33药剂不与细胞毒性剂缀合。
本文的抗-TSPAN33药剂可以靶向表达TSPAN33的活化的和/或病变的B细胞并通过补体介导的细胞毒性(CMC)或抗体依赖性细胞毒性(ADCC)或通过改变细胞行为来导致他们耗竭。在某些情况下，抗-TSPAN33药剂用作抗体-药物缀合物以提高抗体对表达TSPAN33的细胞的杀伤能力。
本文还提供了选择性靶向受试者中的TSPAN33阳性细胞的方法，其包含向该受试者施用本文所述的抗-TSPAN33药剂。选择性靶向TSPAN33阳性细胞通常是指抗-TSPAN33药剂与TSPAN33阳性细胞结合且不与其他细胞或细胞类型结合(或不显著结合)。当抗-TSPAN33药剂与细胞类型的结合水平相对于抗-TSPAN33药剂与TSPAN33阳性细胞的结合为约10％或更低时，抗-TSPAN33药剂被认为与某些细胞类型不显著结合。在一些实施方案中，抗-TSPAN33药剂与TSPAN33阳性细胞上的TSPAN33结合。在一些实施方案中，抗-TSPAN33药剂与TSPAN33阳性细胞上的TSPAN33结合且与TSPAN33阴性细胞不结合或不显著结合。TSPAN33阳性细胞可包括例如B细胞、活化的B细胞、单核细胞、活化的单核细胞、活化的B细胞存在时的单核细胞、活化的PBMC存在时的单核细胞、T细胞、活化的T细胞、内皮细胞、上皮细胞、淋巴细胞、中枢神经系统的细胞等。在一些实施方案中，TSPAN33阳性细胞包含活化的B细胞。在一些实施方案中，TSPAN33阳性细胞包含病变细胞。在一些实施方案中，TSPAN33阳性细胞包含病变的B细胞。在一些实施方案中，TSPAN33阳性细胞包含癌细胞。在一些实施方案中，TSPAN33阳性细胞包含癌B细胞。
本文还提供了选择性靶向受试者中的活化的B细胞的方法，其包含向该受试者施用本文所述的抗-TSPAN33药剂。选择性靶向活化的B细胞通常是指抗-TSPAN33药剂与活化的B细胞结合且不与其他细胞或细胞类型结合(或不显著结合)。当抗-TSPAN33药剂与细胞类型的结合水平相对于抗-TSPAN33药剂与活化的B细胞和/或病变的B细胞的结合为约10％或更低时，抗-TSPAN33药剂被认为与某些细胞类型不显著结合。在一些实施方案中，抗-TSPAN33药剂与活化的B细胞上的TSPAN33结合。在一些实施方案中，抗-TSPAN33药剂与病变的B细胞上的TSPAN33结合。在一些实施方案中，抗-TSPAN33药剂与活化的B细胞上的TSPAN33结合且不与其他类型的免疫细胞(例如T细胞)结合或不显著结合。在一些实施方案中，抗-TSPAN33药剂与活化的B细胞上的TSPAN33结合且不与静息B细胞结合或不显著结合。在一些实施方案中，抗-TSPAN33药剂与病变的B细胞上的TSPAN33结合且不与健康B细胞结合或不显著结合。
本文所述的抗-TSPAN33药剂或其组分(例如一个或多个CDR、一个或多个可变轻链、一个或多个可变重链)可由治疗性细胞表达。例如，本文所述的抗-TSPAN33药剂或其组分(例如一个或多个CDR、一个或多个可变轻链、一个或多个可变重链)可由嵌合抗原受体修饰的T(CAR-T)细胞表达。CAR T细胞是修饰的T细胞，其可用于针对某些疾病(例如癌症)的免疫治疗。通常，从血液中收集患者的T细胞的样品，然后修饰以在其表面上产生嵌合抗原受体(CAR)。在某些情况下，CAR可包含本文所述的抗-TSPAN33药剂或其组分(例如一个或多个CDR、一个或多个可变轻链、一个或多个可变重链)。在某些情况下，CAR可包含本文所述的抗-TSPAN33组分与任何抗-TSPAN33组分的组合(例如本文提供的一个或多个CDR与任何其他抗-TSPAN33的一个或多个CDR组合；本文提供的一个或多个可变轻链与任何其他抗-TSPAN33的一个或多个重链组合；本文提供的一个或多个可变重链与任何其他抗-TSPAN33的一个或多个轻链组合)。
在一些实施方案中，本文提供了治疗某些类型的淋巴瘤或白血病(例如TSPAN33阳性的淋巴瘤或白血病类型)的方法。淋巴瘤类型可包括例如霍奇金病、非霍奇金淋巴瘤、弥漫性大B细胞淋巴瘤、伯基特淋巴瘤、前体T细胞白血病/淋巴瘤、滤泡性淋巴瘤、套细胞淋巴瘤、B细胞慢性淋巴细胞性白血病/淋巴瘤、MALT淋巴瘤、外周T细胞淋巴瘤、结节性硬化型霍奇金淋巴瘤和霍奇金淋巴瘤的混合细胞性亚型。白血病类型可包括例如急性淋巴细胞性白血病、急性髓性白血病、慢性淋巴细胞性白血病、慢性髓性白血病、毛细胞白血病和骨髓增生异常综合征。
在一些实施方案中，本文提供了治疗某些类型的过敏或自身免疫性疾病(例如TSPAN33阳性的过敏和自身免疫性疾病)的方法。例如，可以使用TSPAN33作为治疗性抗体的靶来耗尽过敏性变应性B淋巴细胞。同样地，使用TSPAN33作为治疗性抗体的靶可以类似地耗尽自体反应性B淋巴细胞。自身免疫性疾病可包括例如类风湿性关节炎、银屑病、特应性皮炎、干燥综合征(Sjogren's syndrome)、自身免疫性肝炎、原发性胆汁性肝硬化、溃疡性结肠炎、克罗恩病、硬皮病、过敏性肺炎、自身免疫性甲状腺炎、桥本甲状腺炎、格雷夫斯病、强直性脊柱炎、乳糜泻、特发性血小板减少性紫癜、混合型结缔组织疾病、多发性硬化、多发性骨髓瘤、寻常天疱疮、颞动脉炎、白癜风以及系统性红斑狼疮。
制品
在本发明的另一方面，提供了含有用于治疗或诊断上述病症的材料的制品。该制品包含容器和标签。合适的容器包括例如瓶、小瓶、注射器和试管。容器可由多种材料(诸如玻璃或塑料)形成。容器存有对治疗状况有效的组合物并可具有无菌进入端口(例如该容器可为静脉注射溶液袋或具有可由皮下注射针刺穿的塞子的小瓶)。该组合物中的活性物质为抗-TSPAN33抗体。容器上或与容器相关的标签指示组合物用于治疗或诊断所选择的状况。制品还可包含第二容器，该第二容器包含药学上可接受的缓冲液，诸如磷酸盐缓冲盐水、林格氏溶液和右旋糖溶液。其还可包括从商业和使用者的观点所需的其他材料，包括其他缓冲剂、稀释剂、过滤器、针、注射器和具有使用说明的包装插页。
通过参考以下实施例将更好地理解本发明，这些实施例旨在仅说明现在已知用于实践本发明的最佳模式。本发明的范围不应被认为限于此。
实施例
下文阐述的实施例说明某些实施方案，但并不限制技术。将通过参考以下具体实施例进一步描述本发明。这些实施例绝不应当被认为以任何方式限制本发明的范围。
实施例1：抗-TSPAN33杂交瘤的产生和表征
可以如本实施例中所述制备分泌单克隆抗体的杂交瘤，该单克隆抗体与在体内在活化的B细胞和淋巴瘤上表达的TSPAN33反应。所得抗-TSPAN33抗体可以用于识别人组织样品中的活化的B细胞和人淋巴瘤细胞。
实验小鼠的常见品系(例如BALB/c或C57/B16)或大鼠的常见品系(例如SpragueDawley)是用于用TSPAN33免疫原(例如人TSPAN33的胞外区或已被工程化以在其细胞膜上表达人TSPAN33的细胞)进行免疫的合适宿主。在成功免疫小鼠后，使用标准方案形成杂交瘤，将骨髓瘤细胞与从动物收集的脾和引流淋巴结细胞进行融合。在HAT培养基中选择成功的融合物并在微量滴定板中克隆到约一个细胞/孔后，可以通过流式细胞术针对表达TSPAN33的细胞转染子(例如HEK 293或RBL)测试培养上清液。然后将具有成功染色谱(staining profiles)的孔传代培养进更大器皿中，直到存在足够的细胞以允许亚克隆。可以使用TSPAN33-转染的细胞通过流式细胞术再次进行杂交瘤亚克隆候选物的进一步表征。然后，例如通过针对分成不同亚群(例如淋巴细胞，单核细胞，粒细胞等)的人血细胞以及针对已知TSPAN33表达上调的病变的人细胞例如淋巴瘤细胞产生的一种或多种细胞系的流式细胞术，对选择作为最佳候选物的克隆进一步筛选。与同种型对照相比，可以定量每个血细胞亚群中阳性细胞的百分比。理想的候选克隆将对表达TSPAN33的病变人类细胞具有强反应性，但对其他血细胞群没有明显的反应性。
实施例2：表达TSPAN33的细胞的检测
本实施例描述了使用优选的鼠抗-TSPAN33单克隆抗体基于流式细胞术检测人外周血液单个核细胞(PBMC)。
材料和方法
根据制造商的说明，在无菌条件下通过Ficoll-Paque PLUS(GE Healthcare)梯度分离人外周血液单个核细胞(PBMC)。
在完全RPMI-1640(10％胎牛血清、1000U/ml青霉素和1mg/ml链霉素)中计数PBMC并调节至1×10
次日，将细胞用Biolegend的细胞染色缓冲液洗涤，并将1×10
除非另有说明，所有使用的试剂均来自BioLegend。
结果
用CD40L和IL-4刺激的人B细胞显示出TSPAN33表达增强。大部分B细胞(CD20+)和一小部分CD20-细胞经历了TSPAN33表达上调并用抗-人TSPAN33染色。相反，同种型对照抗体未染色任何一个群体。参见图1和图2。
实施例3：抗-TSPAN33抗体可变区的测序
使来自性能良好的抗-TSPAN33杂交瘤细胞系(描述于以上实施例2中)的细胞在标准哺乳动物组织培养基中生长。使用基于RNeasy Mini试剂盒(Qiagen)的方法从杂交瘤细胞中分离总RNA。RNA用于产生第一链cDNA。轻链和重链可变结构域cDNA均通过5’-RACE技术扩增。通过PCR制备阳性克隆，然后对多个克隆进行DNA测序。
重链和轻链的各个可变结构域(CDR1、CDR2、CDR3)的氨基酸序列示于下表1。
克隆24的重链和轻链的整个可变区(前导序列、CDR和框架区)的氨基酸序列如下表2所示。
实施例4：抗-TSPAN33抗体序列
实施例5：表达TSPAN33的细胞的检测和阻断试验
本实施例描述了使用本文提供的鼠抗-TSPAN33单克隆抗体基于流式细胞术检测活化的B细胞和单核细胞。本实施例还描述了使用本文所述的抗-TSPAN33抗体进行的阻断试验。
B细胞活化
根据制造商的说明，在无菌条件下通过Ficoll-Paque PLUS(GE Healthcare)梯度分离人外周血液单个核细胞(PBMC)；然后对细胞进行计数并用补充有10％FBS和抗生素加CD40L(TNFSF 5)(BioLegend，cat.#591704)1μg/mL和IL-4(BioLegend，cat.#574002)100U/mL)的RPMI1640(Gibco Laboratories)将细胞密度调节为1×10
表面和染色
在细胞染色缓冲液(BioLegend，cat.#420201)中对PBMC进行计数并调节至1×10
流式细胞术/门控分级(Gating Hierarchy)
根据DAPI染色将死细胞排除在分析之外；淋巴细胞和单核细胞根据其前向(FSC)和侧向散射(SSC)谱进行门控(图4)。淋巴细胞为FSC
阻断试验
对于阻断研究，将静息或活化的PBMC与10μg纯化的抗体抗-TSPAN33(AB1、AB2、AB3、AB4和AB5)或小鼠IgG2b，κ同种型对照温育15分钟，然后用CD20 APC和小鼠IgG2b，κ，PE(BioLegend，cat.#400312)或指定的抗-TSPAN33抗体(AB1、AB2、AB3、AB4和AB5)染色。
计算阻断％
通过将用同种型对照或AB1、AB2、AB3、AB4、AB5阻断的样品的MFI除以没有阻断的MFI来计算初始中值荧光染料强度(Median Fluorochrome Intensity，MFI)百分比。从100中减去该值以得到阻断百分比。公式如下所示：
阻断试验结果
同种型对照(无阻断；图7A、7B、8A、8B的每个图中顶部直方图)以及每个抗-TSPAN33抗体AB1、AB2、AB3、AB4、AB5(无阻断；图7A、7B、8A、8B的每个图中从顶部开始的第二个直方图；每个图根据各个染色抗体#进行编号)的染色结果示于图7A、7B、8A、8B中。在大多数情况下，小鼠IgG2b未显著改变由活化的B细胞或单核细胞表达的TSPAN的MFI(中值荧光强度)(图7A、7B、8A、8B的每个图中的第三个直方图(从顶部开始))。阻断试验中所用的AB1、AB2、AB3、AB4和AB5使活化的B细胞上的TSPAN33表达的MFI降低约61％至约90％，单核细胞上的TSPAN33表达的MFI降低约12％至约40％。总体上，阻断试验中所用的AB1、AB2、AB3、AB4和AB5使活化的B细胞上的TSPAN33表达的MFI降低了平均80.3％以及使单核细胞上的TSPAN33表达的MFI降低了平均28.7％(图7A、7B、8A、8B的每个图中的底部五个直方图)。图9和图10分别示出了TSPAN33对活化的B细胞和单核细胞的阻断的总结。图11中的表格展示了活化的B细胞(左侧表格)和单核细胞(右侧表格)的MFI和阻断％结果。
实施例6：实施方案的实例
下文阐述的实例说明某些实施方案但不限制技术。
A1.一种抗-TSPAN33药剂，任选地，一种分离的、非天然存在的抗体，或其抗原结合片段或衍生物，其在生理条件下与四次穿膜蛋白33(TSPAN33)结合，其中所述药剂包含至少一个免疫球蛋白重链可变结构域和一个免疫球蛋白轻链可变结构域，其中：
(a)抗-TSPAN33药剂的每个免疫球蛋白重链可变结构域包含第一、第二和第三重链互补决定区(CDR)，其中所述第一重链CDR包含与氨基酸序列DYYMT(SEQ ID NO：1)具有至少65％序列相同性，任选地具有至少80％、至少90％、至少95％、和100％的序列相同性的氨基酸序列；所述第二重链CDR包含与氨基酸序列FIRNKANGYTTEYSASVKG(SEQ ID NO：2)具有至少65％序列相同性，任选地具有至少80％、至少90％、至少95％、和100％的序列相同性的氨基酸序列，以及所述第三重链CDR包含与氨基酸序列YLQTGNFDY(SEQ ID NO：3)具有至少65％序列相同性，任选地具有至少80％、至少90％、至少95％、和100％的序列相同性的氨基酸序列；并且，
(b)抗-TSPAN33药剂的每个免疫球蛋白轻链可变域包含第一、第二和第三轻链CDR，其中所述第一轻链CDR包含与氨基酸序列RASQDISNFLN(SEQ ID NO：5)具有至少65％序列相同性，任选地具有至少80％、至少90％、至少95％、和100％的序列相同性的氨基酸序列；所述第二轻链CDR包含与氨基酸序列FTSRLHS(SEQ ID NO：6)具有至少65％序列相同性，任选地具有100％的序列相同性的氨基酸序列，以及所述第三轻链CDR包含与氨基酸序列QQGYTVPPT(SEQ ID NO：7)具有至少65％序列相同性，任选地具有至少80％、至少90％、至少95％、和100％的序列相同性的氨基酸序列。
A2.实施方案A1的抗-TSPAN33药剂，其包含非天然存在的抗-TSPAN33抗体或其TSPAN33结合片段或衍生物，其中所述第一重链CDR包含氨基酸序列DYYMT(SEQ ID NO：1)，所述第二重链CDR包含氨基酸序列FIRNKANGYTTEYSASVKG(SEQ ID NO：2)，所述第三重链CDR包含氨基酸序列YLQTGNFDY(SEQ ID NO：3)，所述第一轻链CDR包含氨基酸序列RASQDISNFLN(SEQ ID NO：5)，所述第二轻链CDR包含氨基酸序列FTSRLHS(SEQ ID NO：6)，以及所述第三轻链CDR包含氨基酸序列QQGYTVPPT(SEQ ID NO：7)。
A3.实施方案A1的抗-TSPAN33药剂为与TSPAN33结合的人源化抗体或人源化抗体的抗原结合片段或衍生物。
A4.一种组合物，其包含载体，任选地包含药学上可接受的载体，和实施方案A1的抗-TSPAN33药剂。
A5.实施方案A4的组合物，其中实施方案A1的抗-TSPAN33药剂为与TSPAN33结合的人源化抗体或人源化抗体的抗原结合片段或衍生物。
A6.实施方案A1的抗-TSPAN33药剂，其包含抗-TSPAN33抗体或其TSPAN33结合片段或衍生物，其中每个免疫球蛋白重链可变结构域包含与氨基酸序列EVKLVESGGGLVQPGGSLSLSCAASGFTFTDYYMTWVRQPPGKALEWLVFIRNKANGYTTEYSASVKGRFTISRDNSQSILYLQMNALRAEDSATYYCARYLQTGNFDYWGQGTTLTVSS(SEQ ID NO：4)具有至少65％的序列相同性，任选地具有至少80％、至少90％、至少95％、和100％的序列相同性的氨基酸序列，以及每个免疫球蛋白轻链可变结构域包含与氨基酸序列EIQMIQTTSSLTASLGDRVTISCRASQDISNFLNWYQQKPDGTIKLLIYFTSRLHSGVPSRFSGSGSGTDYSLTISNLEQEDIATYFCQQGYTVPPTFGGGTKLEIK(SEQ ID NO：8)具有至少65％的序列相同性，任选地具有至少80％、至少90％、至少95％、和100％的序列相同性的氨基酸序列。
A7.实施方案A1的抗-TSPAN33药剂，其包含非天然存在的抗-TSPAN33抗体或其TSPAN33结合片段或衍生物，其中每个免疫球蛋白重链可变结构域包含氨基酸序列EVKLVESGGGLVQPGGSLSLSCAASGFTFTDYYMTWVRQPPGKALEWLVFIRNKANGYTTEYSASVKGRFTISRDNSQSILYLQMNALRAEDSATYYCARYLQTGNFDYWGQGTTLTVSS(SEQ ID NO：4)，以及每个免疫球蛋白轻链可变结构域包含氨基酸序列EIQMIQTTSSLTASLGDRVTISCRASQDISNFLNWYQQKPDGTIKLLIYFTSRLHSGVPSRFSGSGSGTDYSLTISNLEQEDIATYFCQQGYTVPPTFGGGTKLEIK(SEQ ID NO：8)。
A8.实施方案A1的抗-TSPAN33药剂，其为与TSPAN33结合的人源化抗体或人源化抗体的抗原结合片段或衍生物。
A9.一种组合物，其包含载体，任选地包含药学上可接受的载体，和实施方案A7的抗-TSPAN33药剂。
A10.实施方案A9的组合物，其中抗-TSPAN33药剂为与TSPAN33结合的人源化抗体或人源化抗体的抗原结合片段或衍生物。
A11.一种配置为检测生物样品中的四次穿膜蛋白33(TSPAN33)的诊断试剂盒，所述试剂盒包含实施方案A1的抗-TSPAN33药剂，该抗-TSPAN33药剂与可检测的标志缀合或非扩散地固定在固体支持物上。
A12.实施方案A1的抗-TSPAN33药剂，其还包含可检测标记。
A13.实施方案A12的标记的抗-TSPAN33药剂，其中抗-TSPAN33药剂为与TSPAN33结合的人源化抗体或人源化抗体的抗原结合片段或衍生物。
A14.一种组合物，其包含载体，任选地包含药学上可接受的载体，和实施方案A12的标记的抗-TSPAN33药剂。
A15.一种药剂-药物缀合物，其包含实施方案A1的抗-TSPAN33药剂和药物部分，其中所述药物部分任选地包含核酸、肽、多肽、小分子或适体。
A16.实施方案A15的药剂-药物缀合物，其中抗-TSPAN33药剂为与TSPAN33结合的人源化抗体或人源化抗体的抗原结合片段或衍生物。
A17.一种组合物，其包含载体，任选地包含药学上可接受的载体，和实施方案A15的药剂-药物缀合物。
A18.一种分离的核酸分子，其选自：(i)编码抗体或其抗原结合片段或衍生物的免疫球蛋白重链可变结构域的核酸分子，所述抗体或其抗原结合片段或衍生物在生理条件下与四次穿膜蛋白33(TSPAN33)结合，其中所述核酸分子编码第一、第二和第三重链互补决定区(CDR)，其中所述第一重链CDR包含与氨基酸序列DYYMT(SEQ ID NO：1)具有至少65％的序列相同性，任选地具有至少80％、至少90％、至少95％、和100％的序列相同性的氨基酸序列；所述第二重链CDR包含与氨基酸序列FIRNKANGYTTEYSASVKG(SEQ ID NO：2)具有至少65％的序列相同性，任选地具有至少80％、至少90％、至少95％、和100％的序列相同性的氨基酸序列，以及所述第三重链CDR包含与氨基酸序列YLQTGNFDY(SEQ ID NO：3)具有至少65％的序列相同性，任选地具有至少80％、至少90％、至少95％、和100％的序列相同性的氨基酸序列；以及(ii)编码抗体或其抗原结合片段或衍生物的免疫球蛋白轻链可变结构域的核酸分子，所述抗体或其抗原结合片段或衍生物在生理条件下与TSPAN33结合，其中所述核酸分子编码第一、第二和第三轻链CDR，其中所述第一轻链CDR包含与氨基酸序列RASQDISNFLN(SEQ ID NO：5)具有至少65％的序列相同性，任选地具有至少80％、至少90％、至少95％、和100％的序列相同性的氨基酸序列；所述第二轻链CDR包含与氨基酸序列FTSRLHS(SEQ ID NO：6)具有至少65％的序列相同性，任选地具有至少100％的序列相同性的氨基酸序列，以及所述第三轻链CDR包含与氨基酸序列QQGYTVPPT(SEQ ID NO：7)具有至少65％的序列相同性，任选地具有至少80％、至少90％、至少95％、和100％的序列相同性的氨基酸序列。
A19.实施方案A18的分离的核酸分子，其选自：(i)编码抗体或其抗原结合片段或衍生物的免疫球蛋白重链可变结构域的核酸分子，所述抗体或其抗原结合片段或衍生物与TSPAN33结合，其中所述第一重链CDR包含氨基酸序列DYYMT(SEQ ID NO：1)，所述第二重链CDR包含氨基酸序列FIRNKANGYTTEYSASVKG(SEQ ID NO：2)，以及所述第三重链CDR包含氨基酸序列YLQTGNFDY(SEQ ID NO：3)，以及(ii)编码抗体或其抗原结合片段或衍生物的免疫球蛋白轻链可变结构域的核酸分子，所述抗体或其抗原结合片段或衍生物在生理条件下与TSPAN33结合，其中所述第一轻链CDR包含氨基酸序列RASQDISNFLN(SEQ ID NO：5)，所述第二轻链CDR包含氨基酸序列FTSRLHS(SEQ ID NO：6)，以及所述第三轻链CDR包含氨基酸序列QQGYTVPPT(SEQ ID NO：7)。
A20.实施方案A18的分离的核酸分子，其选自：(i)编码免疫球蛋白重链可变结构域的核酸分子，所述免疫球蛋白重链可变结构域包含与在生理条件下与TSPAN33结合的抗体或其抗原结合片段或衍生物的氨基酸序列EVKLVESGGGLVQPGGSLSLSCAASGFTFTDYYMTWVRQPPGKALEWLVFIRNKANGYTTEYSASVKGRFTISRDNSQSILYLQMNALRAEDSATYYCARYLQTGNFDYWGQGTTLTVSS(SEQ ID NO：4)具有至少65％的序列相同性，任选地具有至少80％、至少90％、至少95％、和100％的序列相同性的氨基酸序列，以及(ii)编码免疫球蛋白轻链可变结构域的核酸分子，所述免疫球蛋白轻链可变结构域包含与在生理条件下与TSPAN33结合的抗体或其抗原结合片段或衍生物的氨基酸序列EIQMIQTTSSLTASLGDRVTISCRASQDISNFLNWYQQKPDGTIKLLIYFTSRLHSGVPSRFSGSGSGTDYSLTISNLEQEDIATYFCQQGYTVPPTFGGGTKLEIK(SEQ ID NO：8)具有至少65％的序列相同性，任选地具有至少80％、至少90％、至少95％、和100％的序列相同性的氨基酸序列。
A21.一种重组表达载体，其包含第一表达盒和第二表达盒，其中第一表达盒包含启动子和编码与TSPAN33结合的抗体或其抗原结合片段或衍生物的免疫球蛋白重链可变结构域的核酸分子，其中第一重链CDR包含与氨基酸序列DYYMT(SEQ ID NO：1)具有至少65％的序列相同性，任选地具有至少80％、至少90％、至少95％、和100％的序列相同性的氨基酸序列；第二重链CDR包含与氨基酸序列FIRNKANGYTTEYSASVKG(SEQ ID NO：2)具有至少65％的序列相同性，任选地具有至少80％、至少90％、至少95％、和100％的序列相同性的氨基酸序列，以及第三重链CDR包含与氨基酸序列YLQTGNFDY(SEQ ID NO：3)具有至少65％的序列相同性，任选地具有至少80％、至少90％、至少95％、和100％的序列相同性的氨基酸序列，并且第二表达盒包含启动子和编码与TSPAN33结合的抗体或其抗原结合片段或衍生物的免疫球蛋白轻链可变结构域的核酸分子，其中第一轻链CDR包含与氨基酸序列RASQDISNFLN(SEQ ID NO：5)具有至少65％的序列相同性，任选地具有至少80％、至少90％、至少95％、和100％的序列相同性的氨基酸序列；第二轻链CDR包含与氨基酸序列FTSRLHS(SEQ ID NO：6)具有至少65％的序列相同性，任选地具有100％的序列相同性的氨基酸序列，以及第三轻链CDR包含与氨基酸序列QQGYTVPPT(SEQ ID NO：7)具有至少65％的序列相同性，任选地具有至少80％、至少90％、至少95％、和100％的序列相同性的氨基酸序列。
A22.一种用实施方案A21的重组表达载体转染的重组宿主细胞。
A23.一种治疗或预防与异常水平的TSPAN33相关的疾病或病症的方法，其包含以足以有效治疗的量向需要这种治疗的受试者施用实施方案A1的抗-TSPAN33药剂，从而治疗或预防所述疾病或病症。
A24.实施方案A23的方法，其选自：白血病；淋巴瘤；任选地，霍奇金病，非霍奇金淋巴瘤，弥漫性大B细胞淋巴瘤和伯基特淋巴瘤；以及自身免疫性疾病，任选地，类风湿性关节炎。
B1.一种在实验室或生理条件下与四次穿膜蛋白33(TSPAN33)结合的抗-TSPAN33药剂，其中所述药剂包含至少一个免疫球蛋白重链可变结构域和/或至少一个免疫球蛋白轻链可变结构域，其中：
a)抗-TSPAN33药剂的每个免疫球蛋白重链可变结构域包含第一、第二和第三重链互补决定区(CDR)，其中
第一重链CDR(CDRH1)包含与氨基酸序列X
X
X
X
第二重链CDR(CDRH2)包含与氨基酸序列X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
第三重链CDR(CDRH3)包含与氨基酸序列X
X
X
X
X
X
X
X
X
b)抗-TSPAN33药剂的每个免疫球蛋白轻链可变结构域包含第一、第二和第三轻链CDR，其中
第一轻链CDR(CDRL1)包含与氨基酸序列X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
第二轻链CDR(CDRL2)包含与氨基酸序列X
X
X
X
X
X
X
第三轻链CDR(CDRL3)包含与氨基酸序列X
X
X
X
X
X
X
B1.1在实验室或生理条件下与四次穿膜蛋白33(TSPAN33)结合的抗-TSPAN33药剂，其中所述药剂包含至少一个免疫球蛋白重链可变结构域和至少一个免疫球蛋白轻链可变结构域，其中：
a)抗-TSPAN33药剂的每个免疫球蛋白重链可变结构域包含第一、第二和第三重链互补决定区(CDR)，其中
第一重链CDR(CDRH 1)包含与氨基酸序列X
X
X
X
第二重链CDR(CDRH2)包含与氨基酸序列X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
第三重链CDR(CDRH3)包含与氨基酸序列X
X
X
X
X
X
X
X
X
b)抗-TSPAN33药剂的每个免疫球蛋白轻链可变结构域包含第一、第二和第三轻链CDR，其中
第一轻链CDR(CDRL1)包含与氨基酸序列X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
第二轻链CDR(CDRL2)包含与氨基酸序列X
X
X
X
X
X
X
第三轻链CDR(CDRL3)包含与氨基酸序列X
X
X
X
X
X
X
B2.实施方案B1或B1.1的抗-TSPAN33药剂，其中CDRH1包含与SEQ ID NO：41的氨基酸序列具有至少80％的相同性的多肽。
B3.实施方案B1或B1.1的抗-TSPAN33药剂，其中CDRH1包含与SEQ ID NO：41的氨基酸序列具有至少85％的相同性的多肽。
B4.实施方案B1或B1.1的抗-TSPAN33药剂，其中CDRH1包含与SEQ ID NO：41的氨基酸序列具有至少90％的相同性的多肽。
B5.实施方案B1或B1.1的抗-TSPAN33药剂，其中CDRH1包含与SEQ ID NO：41的氨基酸序列具有至少95％的相同性的多肽。
B6.实施方案B1或B1.1的抗-TSPAN33药剂，其中CDRH1包含与SEQ ID NO：41的氨基酸序列具有100％的相同性的多肽。
B7.实施方案B1至B6中任一项的抗-TSPAN33药剂，其中CDRH2包含与SEQ ID NO：42的氨基酸序列具有至少80％的相同性的多肽。
B8.实施方案B1至B6中任一项的抗-TSPAN33药剂，其中CDRH2包含与SEQ ID NO：42的氨基酸序列具有至少85％的相同性的多肽。
B9.实施方案B1至B6中任一项的抗-TSPAN33药剂，其中CDRH2包含与SEQ ID NO：42的氨基酸序列具有至少90％的相同性的多肽。
B10.实施方案B1至B6中任一项的抗-TSPAN33药剂，其中CDRH2包含与SEQ ID NO：42的氨基酸序列具有至少95％的相同性的多肽。
B11.实施方案B1至B6中任一项的抗-TSPAN33药剂，其中CDRH2包含与SEQ ID NO：42的氨基酸序列具有100％的相同性的多肽。
B12.实施方案B1至B11中任一项的抗-TSPAN33药剂，其中CDRH3包含与SEQ ID NO：43的氨基酸序列具有至少80％的相同性的多肽。
B13.实施方案B1至B11中任一项的抗-TSPAN33药剂，其中CDRH3包含与SEQ ID NO：43的氨基酸序列具有至少85％的相同性的多肽。
B14.实施方案B1至B11中任一项的抗-TSPAN33药剂，其中CDRH3包含与SEQ ID NO：43的氨基酸序列具有至少90％的相同性的多肽。
B15.实施方案B1至B11中任一项的抗-TSPAN33药剂，其中CDRH3包含与SEQ ID NO：43的氨基酸序列具有至少95％的相同性的多肽。
B16.实施方案B1至B11中任一项的抗-TSPAN33药剂，其中CDRH3包含与SEQ ID NO：43的氨基酸序列具有100％的相同性的多肽。
B17.实施方案B1至B16中任一项的抗-TSPAN33药剂，其中CDRL1包含与SEQ ID NO：44的氨基酸序列具有至少80％的相同性的多肽。
B18.实施方案B1至B16中任一项的抗-TSPAN33药剂，其中CDRL1包含与SEQ ID NO：44的氨基酸序列具有至少85％的相同性的多肽。
B19.实施方案B1至B16中任一项的抗-TSPAN33药剂，其中CDRL1包含与SEQ ID NO：44的氨基酸序列具有至少90％的相同性的多肽。
B20.实施方案B1至B16中任一项的抗-TSPAN33药剂，其中CDRL1包含与SEQ ID NO：44的氨基酸序列具有至少95％的相同性的多肽。
B21.实施方案B1至B16中任一项的抗-TSPAN33药剂，其中CDRL1包含与SEQ ID NO：44的氨基酸序列具有100％的相同性的多肽。
B22.实施方案B1至B21中任一项的抗-TSPAN33药剂，其中CDRL2包含与SEQ ID NO：45的氨基酸序列具有至少80％的相同性的多肽。
B23.实施方案B1至B21中任一项的抗-TSPAN33药剂，其中CDRL2包含与SEQ ID NO：45的氨基酸序列具有至少85％的相同性的多肽。
B24.实施方案B1至B21中任一项的抗-TSPAN33药剂，其中CDRL2包含与SEQ ID NO：45的氨基酸序列具有至少90％的相同性的多肽。
B25.实施方案B1至B21中任一项的抗-TSPAN33药剂，其中CDRL2包含与SEQ ID NO：45的氨基酸序列具有至少95％的相同性的多肽。
B26.实施方案B1至B21中任一项的抗-TSPAN33药剂，其中CDRL2包含与SEQ ID NO：45的氨基酸序列具有100％的相同性的多肽。
B27.实施方案B1至B26中任一项的抗-TSPAN33药剂，其中CDRL3包含与SEQ ID NO：46的氨基酸序列具有至少80％的相同性的多肽。
B28.实施方案B1至B26中任一项的抗-TSPAN33药剂，其中CDRL3包含与SEQ ID NO：46的氨基酸序列具有至少85％的相同性的多肽。
B29.实施方案B1至B26中任一项的抗-TSPAN33药剂，其中CDRL3包含与SEQ ID NO：46的氨基酸序列具有至少90％的相同性的多肽。
B30.实施方案B1至B26中任一项的抗-TSPAN33药剂，其中CDRL3包含与SEQ ID NO：46的氨基酸序列具有至少95％的相同性的多肽。
B31.实施方案B1至B26中任一项的抗-TSPAN33药剂，其中CDRL3包含与SEQ ID NO：46的氨基酸序列具有100％的相同性的多肽。
B32.实施方案B1至B31中任一项的抗-TSPAN33药剂，其中CDRH1包含选自DYYMT(SEQ ID NO：1)、SYWMH(SEQ ID NO：9和33)和NYYMN(SEQ ID NO：17和25)的氨基酸序列。
B33.实施方案B1至B32中任一项的抗-TSPAN33药剂，其中CDRH2包含选自FIRNKANGYTTEYSASVKG(SEQ ID NO：2)、RIDPNSGGTKYNEKFKS(SEQ ID NO：10)、DIIPNNGGTIYNQKFKG(SEQ ID NO：18和26)和EINPNNGGSNYNEKFKN(SEQ ID NO：34)的氨基酸序列。
B34.实施方案B1至B33中任一项的抗-TSPAN33药剂，其中CDRH3包含选自YLQTGNFDY(SEQ ID NO：3)、FIITGYFDY(SEQ ID NO：11)、RLWSWYFDV(SEQ ID NO：19和27)和SYYSYWYFDY(SEQ ID NO：35)的氨基酸序列。
B35.实施方案B1至B34中任一项的抗-TSPAN33药剂，其中CDRL1包含选自RASQDISNFLN(SEQ ID NO：5)、KASQDVGAAVA(SEQ ID NO：13)、SASSSVSYMY(SEQ ID NO：21和29)和SASSSVNYMH(SEQ ID NO：37)的氨基酸序列。
B36.实施方案B1至B35中任一项的抗-TSPAN33药剂，其中CDRL2包含选自FTSRLHS(SEQ ID NO：6)、WASTRHT(SEQ ID NO：14)、LTSNLAS(SEQ ID NO：22和30)和DTSKLAP(SEQ IDNO：38)的氨基酸序列。
B37.实施方案B1至B36中任一项的抗-TSPAN33药剂，其中CDRL3包含选自QQGYTVPPT(SEQ ID NO：7)、HQYRTYPFT(SEQ ID NO：15)、QQWSSNPYT(SEQ ID NO：23和31)和HQWNNYPYT(SEQ ID NO：39)的氨基酸序列。
B38.实施方案B1至B37中任一项的抗-TSPAN33药剂，其包含两个免疫球蛋白重链可变结构域和两个免疫球蛋白轻链可变结构域。
B39.实施方案B38的抗-TSPAN33药剂，其中所述两个免疫球蛋白重链可变结构域各自包含一组CDRH1、CDRH2和CDRH3氨基酸序列。
B40.实施方案B38或B39的抗-TSPAN33药剂，其中所述两个免疫球蛋白轻链可变结构域各自包含一组CDRL1、CDRL2和CDRL3氨基酸序列。
B41.实施方案B1至B40中任一项的抗-TSPAN33药剂，其中每个免疫球蛋白重链可变结构域包含一组选自组1-4的CDRH1、CDRH2和CDRH3氨基酸序列，并且每个免疫球蛋白轻链可变结构域包含一组选自组1-4的CDRL1、CDRL2和CDRL3氨基酸序列：
B42.实施方案B41的抗-TSPAN33药剂，其中所有CDR序列来自相同组。
B43.实施方案B1至B42中任一项的抗-TSPAN33药剂，其中免疫球蛋白重链可变结构域包含与选自SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：28和SEQ ID NO：36的氨基酸序列具有至少75％的相同性的多肽。
B44.实施方案B1至B42中任一项的抗-TSPAN33药剂，其中免疫球蛋白重链可变结构域包含与选自SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：28和SEQ ID NO：36的氨基酸序列具有至少80％的相同性的多肽。
B45.实施方案B1至B42中任一项的抗-TSPAN33药剂，其中免疫球蛋白重链可变结构域包含与选自SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：28和SEQ ID NO：36的氨基酸序列具有至少85％的相同性的多肽。
B46.实施方案B1至B42中任一项的抗-TSPAN33药剂，其中免疫球蛋白重链可变结构域包含与选自SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：28和SEQ ID NO：36的氨基酸序列具有至少90％的相同性的多肽。
B47.实施方案B1至B42中任一项的抗-TSPAN33药剂，其中免疫球蛋白重链可变结构域包含与选自SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：28和SEQ ID NO：36的氨基酸序列具有至少95％的相同性的多肽。
B48.实施方案B1至B42中任一项的抗-TSPAN33药剂，其中免疫球蛋白重链可变结构域包含选自SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：28和SEQ ID NO：36的氨基酸序列。
B48.实施方案B1至B48中任一项的抗-TSPAN33药剂，其中免疫球蛋白轻链可变结构域包含与选自SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：24、SEQ ID NO：32和SEQ ID NO：40的氨基酸序列具有至少75％的相同性的多肽。
B49.实施方案B1至B48中任一项的抗-TSPAN33药剂，其中免疫球蛋白轻链可变结构域包含与选自SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：24、SEQ ID NO：32和SEQ ID NO：40的氨基酸序列具有至少80％的相同性的多肽。
B50.实施方案B1至B48中任一项的抗-TSPAN33药剂，其中免疫球蛋白轻链可变结构域包含与选自SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：24、SEQ ID NO：32和SEQ ID NO：40的氨基酸序列具有至少85％的相同性的多肽。
B51.实施方案B1至B48中任一项的抗-TSPAN33药剂，其中免疫球蛋白轻链可变结构域包含与选自SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：24、SEQ ID NO：32和SEQ ID NO：40的氨基酸序列具有至少90％的相同性的多肽。
B52.实施方案B1至B48中任一项的抗-TSPAN33药剂，其中免疫球蛋白轻链可变结构域包含与选自SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：24、SEQ ID NO：32和SEQ ID NO：40的氨基酸序列具有至少95％的相同性的多肽。
B53.实施方案B1至B48中任一项的抗-TSPAN33药剂，其中免疫球蛋白轻链可变结构域包含选自SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：24、SEQ ID NO：32和SEQ ID NO：40的氨基酸序列。
B54.实施方案B1至B53中任一项的抗-TSPAN33药剂，其中所述药剂是分离的。
B55.实施方案B1至B54中任一项的抗-TSPAN33药剂，其中药剂是非天然存在的。
B56.实施方案B1至B55中任一项的抗-TSPAN33药剂，其中所述药剂为抗体或其抗原结合片段。
B57.实施方案B1至B55中任一项的抗-TSPAN33药剂，其中所述药剂为抗体或其衍生物。
B58.实施方案B1至B57中任一项的抗-TSPAN33药剂，其中所述药剂为人源化抗体或其抗原结合片段。
B59.实施方案B1至B57中任一项的抗-TSPAN33药剂，其中所述药剂为与TSPAN33结合的人源化抗体的衍生物。
B60.实施方案B1至B59中任一项的抗-TSPAN33药剂，其中所述药剂包含可检测的标志或标记。
B61.实施方案B1至B60中任一项的抗-TSPAN33药剂，其中所述药剂与可检测的标志或标记缀合。
B62.实施方案B1至B61中任一项的抗-TSPAN33药剂，其中所述药剂非扩散地固定在固体支持物上。
B63.一种诊断试剂，其包含实施方案B1至B62中任一项的抗-TSPAN33药剂。
B64.一种试剂盒，其包含实施方案B1至B62中任一项的抗-TSPAN33药剂或实施方案B63的诊断试剂。
B65.一种配置为检测生物样品中的四次穿膜蛋白33(TSPAN33)的诊断试剂盒，其中所述试剂盒包含实施方案B1至B62中任一项的抗-TSPAN33药剂或实施方案B63的诊断试剂。
B66.一种分离的核酸分子，其包含编码实施方案B1至B62中任一项的抗-TSPAN33药剂的免疫球蛋白重链可变结构域的核苷酸序列。
B67.一种分离的核酸分子，其包含编码实施方案B1至B62中任一项的抗-TSPAN33药剂的免疫球蛋白轻链可变结构域的核苷酸序列。
B68.一种重组表达载体，其包含第一表达盒和第二表达盒，其中第一表达盒包含启动子和核酸分子，该核酸分子包含编码实施方案B1至B62中任一项的抗-TSPAN33药剂的免疫球蛋白重链可变结构域的核苷酸序列，并且第二表达盒包含启动子和核酸分子，该核酸分子包含编码实施方案B1至B62中任一项的抗-TSPAN33药剂的免疫球蛋白轻链可变结构域的核苷酸序列。
B69.一种用实施方案B68的重组表达载体转染的重组宿主细胞。
B70.一种检测TSPAN33的方法，其包含使已知或疑似含有TSPAN33的样品与实施方案B1至B62中任一项的抗-TSPAN33药剂接触，并且如果样品含有TSPAN33，则检测TSPAN33:抗-TSPAN33复合物。
B71.一种组合物，其包含药学上可接受的载体和实施方案B1至B62之一的抗-TSPAN33药剂。
B72.一种药剂-药物缀合物，其包含实施方案B1至B62中任一项的抗-TSPAN33药剂和药物部分。
B73.实施方案B72的药剂-药物缀合物，其中所述药物部分包含核酸、肽、多肽、小分子或适体。
B74.一种组合物，其包含药学上可接受的载体和实施方案B72或B73的药剂-药物缀合物。
B75.一种诊断与异常水平的TSPAN33相关的疾病或病症的方法，其包含使用实施方案B1至B62中任一项的抗-TSPAN33药剂检测异常水平的TSPAN33，从而诊断所述疾病或病症。
B76.一种治疗或预防与异常水平的TSPAN33相关的疾病或病症的方法，其包含以足以有效治疗的量向需要这种治疗的受试者施用实施方案B1至B62中任一项的抗-TSPAN33药剂，从而治疗或预防所述疾病或病症。
B77.一种治疗或预防与异常水平的TSPAN33相关的疾病或病症的方法，其包含以足以实现治疗的量向需要这种治疗的受试者施用实施方案B72或B73的药剂-药物缀合物，从而治疗或预防所述疾病或病症。
B78.实施方案B75、B76或B77的方法，其中所述疾病或病症选自白血病、淋巴瘤和自身免疫性疾病。
B79.实施方案B78的方法，其中淋巴瘤为霍奇金病、非霍奇金淋巴瘤、弥漫性大B细胞淋巴瘤或伯基特淋巴瘤。
B80.实施方案B78的方法，其中自身免疫性疾病为类风湿性关节炎。
B81.一种选择性靶向受试者中的活化的B细胞的方法，其包含向受试者施用实施方案B1至B62中任一项的抗-TSPAN33药剂，其中所述抗-TSPAN33药剂与活化的B细胞上的TSPAN33结合。
B82.一种选择性靶向受试者中的活化的B细胞的方法，其包含向受试者施用实施方案B72或B73的药剂-药物缀合物，其中所述药剂-药物缀合物中的抗-TSPAN33药剂与活化的B细胞上的TSPAN33结合。
B83.实施方案B81或B82的方法，其中所述抗-TSPAN33药剂不与T细胞结合。
B84.实施方案B81至B83中任一项的方法，其中受试者患有选自白血病、淋巴瘤和自身免疫性疾病的疾病或病症。
B85.实施方案B84的方法，其中淋巴瘤为霍奇金病、非霍奇金淋巴瘤、弥漫性大B细胞淋巴瘤或伯基特淋巴瘤。
B86.实施方案B84的方法，其中自身免疫性疾病为类风湿性关节炎。
B87.一种嵌合抗原受体修饰的T(CAR-T)细胞，其包含实施方案B1至B62中任一项的抗-TSPAN33药剂，或实施方案B66或B67的分离的核酸分子。
C1.一种在实验室或生理条件下与四次穿膜蛋白33(TSPAN33)结合的第一抗-TSPAN33药剂，其中第一药剂与第二抗-TSPAN33药剂竞争性结合或能够与第二抗-TSPAN33药剂竞争性结合，该第二药剂为实施方案B1至B62中任一项的抗-TSPAN33药剂。
C2.一种在实验室或生理条件下与细胞上的四次穿膜蛋白33(TSPAN33)结合的第一抗-TSPAN33药剂，其中第一药剂与第二抗-TSPAN33药剂竞争性结合或能够与第二抗-TSPAN33药剂竞争性结合，该第二药剂为实施方案B1至B62中任一项的抗-TSPAN33药剂。
C3.一种在实验室或生理条件下与活化的B细胞上的四次穿膜蛋白33(TSPAN33)结合的第一抗-TSPAN33药剂，其中第一药剂与第二抗-TSPAN33药剂竞争性结合或能够与第二抗-TSPAN33药剂竞争性结合，该第二药剂为实施方案B1至B62中任一项的抗-TSPAN33药剂。
C4.一种在实验室或生理条件下与四次穿膜蛋白33(TSPAN33)结合的第一抗-TSPAN33药剂，其中第一药剂与第二抗-TSPAN33药剂结合相同的表位或能够与第二抗-TSPAN33药剂结合相同的表位，该第二药剂为实施方案B1至B62中任一项的抗-TSPAN33药剂。
C5.实施方案C1至C4中任一项的第一抗-TSPAN33药剂，其为分离的。
C6.实施方案C1至C5中任一项的第一抗-TSPAN33药剂，其为非天然存在的。
C7.实施方案C1至C6中任一项的第一抗-TSPAN33药剂，其为抗体或其抗原结合片段。
C8.实施方案C1至C6中任一项的第一抗-TSPAN33药剂，其为抗体或其衍生物。
C9.实施方案C1至C8中任一项的第一抗-TSPAN33药剂，其为人源化抗体或其抗原结合片段。
C10.实施方案C1至C8中任一项的第一抗-TSPAN33药剂，其为与TSPAN33结合的人源化抗体的衍生物。
C11.实施方案C1至C10中任一项的第一抗-TSPAN33药剂，其包含可检测的标志或标记。
C12.实施方案C1至C11中任一项的第一抗-TSPAN33药剂，其与可检测的标志或标记缀合。
C13.实施方案C1至C12中任一项的第一抗-TSPAN33药剂，其中所述药剂非扩散地固定在固体支持物上。
C14.一种诊断试剂，其包含根据实施方式C1至C13中任一项的第一抗-TSPAN33药剂。
C15.一种试剂盒，其包含实施方案C1至C13中任一项的第一抗-TSPAN33药剂或实施方案C14的诊断试剂。
C16.一种配置为检测生物样品中的四次穿膜蛋白33(TSPAN33)的诊断试剂盒，其中所述试剂盒包含实施方案C1至C13中任一项的第一抗-TSPAN33药剂或实施方案C14的诊断试剂。
C17.一种分离的核酸分子，其包含编码实施方案C1至C13中任一项的第一抗-TSPAN33药剂的免疫球蛋白重链可变结构域的核苷酸序列。
C18.一种分离的核酸分子，其包含编码实施方案C1至C13中任一项的第一抗-TSPAN33药剂的免疫球蛋白轻链可变结构域的核苷酸序列。
C19.一种重组表达载体，其包含第一表达盒和第二表达盒，其中第一表达盒包含启动子和核酸分子，该核酸分子包含编码实施方案C1至C13中任一项的第一抗-TSPAN33药剂的免疫球蛋白重链可变结构域的核苷酸序列，并且第二表达盒包含启动子和核酸分子，该核酸分子包含编码实施方案C1至C13中任一项的第一抗-TSPAN33药剂的免疫球蛋白轻链可变结构域的核苷酸序列。
C20.一种用实施方案C19的重组表达载体转染的重组宿主细胞。
C21.一种检测TSPAN33的方法，其包含使已知或疑似含有TSPAN33的样品与实施方案C1至C13中任一项的第一抗-TSPAN33药剂接触，并且如果样品含有TSPAN33，则检测TSPAN33:抗-TSPAN33复合物。
C22.一种组合物，其包含药学上可接受的载体和实施方案C1至C13任一项的第一抗-TSPAN33药剂。
C23.一种药剂-药物缀合物，其包含实施方案C1至C13中任一项的第一抗-TSPAN33药剂和药物部分。
C24.实施方案C23的药剂-药物缀合物，其中所述药物部分包含核酸、肽、多肽、小分子或适体。
C25.一种组合物，其包含药学上可接受的载体和实施方案C23或C24的药剂-药物缀合物。
C26.一种诊断与异常水平的TSPAN33相关的疾病或病症的方法，其包含使用实施方案C1至C13中任一项的第一抗-TSPAN33药剂检测异常水平的TSPAN33，从而诊断所述疾病或病症。
C27.一种治疗或预防与异常水平的TSPAN33相关的疾病或病症的方法，其包括以足以实现治疗的量向需要这种治疗的受试者施用实施方案C1至C13中任一项的第一抗-TSPAN33药剂，从而治疗或预防所述疾病或病症。
C28.一种治疗或预防与异常水平的TSPAN33相关的疾病或病症的方法，其包括以足以实现治疗的量向需要这种治疗的受试者施用实施方案C23或C24的药剂-药物缀合物，从而治疗或预防所述疾病或病症。
C29.实施方案C26、C27或C28的方法，其中所述疾病或病症选自白血病、淋巴瘤和自身免疫性疾病。
C30.实施方案C29的方法，其中淋巴瘤为霍奇金病、非霍奇金淋巴瘤、弥漫性大B细胞淋巴瘤或伯基特淋巴瘤。
C31.实施方案C29的方法，其中自身免疫性疾病为类风湿性关节炎。
C32.一种选择性靶向受试者中的活化的B细胞的方法，其包含向受试者施用实施方案C1至C13中任一项的第一抗-TSPAN33药剂，其中第一抗-TSPAN33药剂与活化的B细胞上的TSPAN33结合。
C33.一种选择性靶向受试者中的活化的B细胞的方法，其包含向受试者施用实施方案C23或C24的药剂-药物缀合物，其中所述药剂-药物缀合物中的第一抗-TSPAN33药剂与活化的B细胞上的TSPAN33结合。
C34.实施方案C32或C33的方法，其中所述第一抗-TSPAN33药剂不与T细胞结合。
C35.实施方案C32至C34中任一项的方法，其中受试者患有选自白血病、淋巴瘤和自身免疫性疾病的疾病或病症。
C36.实施方案C35的方法，其中淋巴瘤为霍奇金病、非霍奇金淋巴瘤、弥漫性大B细胞淋巴瘤或伯基特淋巴瘤。
C37.实施方案C35的方法，其中自身免疫性疾病为类风湿性关节炎。
C38.一种嵌合抗原受体修饰的T(CAR-T)细胞，其包含实施方案C1至C13中任一项的第一抗-TSPAN33药剂，或实施方案C17或C18的分离的核酸分子。
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以下权利要求中阐述了该技术的某些实施方案。
- 抗-四次穿膜蛋白33药剂及其组合物以及制备和使用方法
- 一种药物组合物及艾瑞昔布在制备抗神经根颈椎病药剂中的应用