一种基于外差探测体制的无针孔扫描式共焦显微镜

技术领域

本发明属于显微成像领域，特别是激光共焦显微成像领域。

背景技术

在生物医学及材料学等领域，共焦显微技术已被广泛用于微观样品的三维结构测量。目前 共焦显微技术基本都采用直接探测体制，大体分为无限远工作距离系统和有限远工作距离系统， 如图1和图2所示。而直接探测体制共焦显微技术存在以下两个难以克服的问题：

第一，探测灵敏度低

众所周知的是，与外差探测体制相比，直接探测体制的灵敏度很低，对微弱信号的探测没 有优势。有文献：“I Renhorn,O Steinvall.Performance study of a coherentlaser radar [A].Proc.SPIE,1983,415:39-50”，公开了外差探测的最小可探测功率为10

第二，共轭针孔引起的实际应用困难

为了实现轴向层析能力，直接探测体制共焦显微技术必须在探测器前设置共轭针孔，如图 1和2所示。但微米量级宽度的共轭针孔引起了如下的一些实际操作困难。首先，当与激光汇 聚点对准时，针孔位置即使存在亚微米的偏差，都将产生像差从而导致分辨率下降，如文献 “Wilson T,Carlini A.R,“Effect of detector displacement in confocalimaging systems,” Appl.Opt.27(18),3791-3798,(1988).

Shigeharu K.,Wilson T,“Effect of axial pinhole displacement inconfocal microscopes,” Appl.Opt.32(13),2257-2261(1993).”；因此必须对系统安装调试的精度，以及抗振动干扰的能 力提出苛刻的要求；其次，实际应用中，即使微小的灰尘落到针孔上，也会引入像差并减弱信 号光强度，甚至导致成像失效。而灰尘的擦除又需要拆解共焦显微系统相应的模块，然后重复 高精度的对准工作，这增加了共焦显微技术的应用难度。最后，针孔的尺寸越大，虽然接收到 的信号光功率越多，却会引起分辨率的下降，如文献“Huayong Ge,Qiushi Ren,Baohua Wang and Wangrong Li,“Influence of pinholesize and fiber-optic imaging bundle on resolution in confocal endoscopicimaging system,”SPIE.5633:506-513(2004).”，而针孔过小时信号信噪比又会过低， 因此实际应用中必须谨慎地设计针孔尺寸，并准确加工针孔的孔径。综上所述，共轭针孔给实际应用增添了较大的实际应用困难。

以上是制约当前共焦显微技术进一步发展所面临的主要困难。在2020年公布的一份研究 文献中，如文献“Hongzhou Dong,Mingwu Ao,Xianming Yang,Yong Liu,ChunpingYang, Superresolution technology based on a heterodyne detection system,Applied Optics, 59(10),3132-3144,2020”；本专利的申请人曾经提出了一种新的共焦显微成像系统，用于提高探 测信号的灵敏度。不同于现有的直接探测体制，该系统采用外差探测体制，以中频信号功率作 为探测量，实现三维成像。但是，在该系统中仍然在探测器前设置有针孔和针孔前聚焦透镜， 如图3所示。因此，该系统仍然不能摆脱共轭针孔给实际应用带来的上述众多困难。

发明内容

本发明的目的是针对背景技术的不足，通过理论分析指出，外差探测体制共焦显微技术中， 在无需共轭针孔和针孔前聚焦透镜的情况下，系统的分辨率和直接探测体制共焦显微系统的分 辨率相同。基于这一理论省略了共轭针孔和针孔前聚焦透镜，从而消除了现有技术中针孔对共 焦显微技术的限制，进一步促进了共焦显微技术的发展。

本发明的技术方案包括一种基于外差探测体制的无针孔扫描式共焦显微镜，该装置报包括： 激光器(1)、光纤分束器(2)、声光移频器A(3)、声光移频器B(4)、准直器(5)、光电探 测器(6)、合束片A(7)、光瞳滤波器(8)、准直透镜A(9)，合束片B(10),聚焦透镜(11)，成像样品(12)，三轴高精度移动平台(13)；其特征在于激光器(1)出射的频率为f激光通 过光纤分束器(2)分为两束激光，其中一束经过声光移频器B(4)移频后频率变为f+f

该方法对探测器输出的频率为Δf的中频电流信号做傅里叶变换，再根据信号和噪声的功 率谱密度确定信噪比，即

其中PSD

本发明的无针孔外差探测体制共焦显微系统，与现有的直接探测体制共焦显微系统相比， 具有相同的横向和纵向分辨率。因此，本发明在达到提高探测信号灵敏度的情况下，避免了由 于共轭针孔引起的一系列实际应用困难。

附图说明

图1为现有的基于直接探测体制的无限远距共焦显微系统。

图2为现有的基于直接探测体制的无限远距共焦显微系统有限远距共焦显微系统。

图3为文献1中提出的基于外差探测体制的共焦显微系统。

图4为本发明基于外差体制的无针孔扫描式共焦显微成像系统。

图5为图1和图4的等效光路图。

图6为图5中部分成像光路，其中图6(a)用于横向分辨率分析说明，图6(b)用于纵向分辨率分析说明。

具体实施方式

基于外差探测体制的无针孔扫描式共焦显微成像方法，该方法包括：

步骤1：打开激光器(1)使频率为f的光场经过光纤分束器(2)后分为两路，一路经声 光移频器A(3)后移频为f+Δf

步骤2：移频为f+Δf

步骤3：移频为f+Δf

步骤4：成像样品(12)反射的光经合束片(10)反射后一次通过光瞳滤波器(8)、合束 片B(7)后，入射到光电探测器(6)上；

步骤5：入射到光电探测器(6)上的信号光与本振光相干，产生频率为Δf

步骤6：在探测完一个成像样品(12)反射点对应的中频信号后，三轴高精度移动平台(13) 移动到下一个扫描点，以此实现扫描式成像。该发明公开了一种外差探测体制的无针孔扫描式 共焦显微成像方法及装置，属于激光共焦显微成像领域，特别是能够省略掉现有共焦显微系统 中的共轭针孔。根据外差探测的性质，同时也可以省略针孔前的聚焦透镜，从而减小系统的应 用难度。

与现有的直接探测共焦显微系统相比，本发明提出的外差探测共焦显微系统，在无需共轭 针孔的情况下，仍然具有相同的横向和纵向分辨率。现通过对比图1所示现有的直接探测体制 共焦显微系统，和本发明提出的图4所示的外差探测体制的共焦显微系统的分辨率特性进行比 较，比较如下。

为了便于比较分析，将图1描述的现有的直接探测体制共焦显微系统，和图4所示的本发 明的外差探测体制共焦显微系统，综合等效为图5所示的系统。等效描述如下：

A.在图5中，当无本振光入射，无合束器，且光电探测器位于位置2时，图5等效于图1所示的系统；

B.在图5中，当有本振光入射，有合束器，无透镜4，无针孔，探测器放置于图中位置1 时，图5等效于图4所示的本发明系统。

图5中由透镜1和透镜2组成了双透镜照明系统，而透镜3和透镜4组成了双透镜收集系 统。其中(ξ,η)为成像样品面，(x

1.横向分辨率对比分析

对于直接探测体制共焦显微系统来说，其分辨率的理论结果是在成像物体为点物，且探测 器为点探测器的假设下得到的，如文献“C.R.J.Sheppard,T.Wilson,“Depth ofField in the Scanning Microscopy,”Opt.Lett,3(3),115-117(1978)”。此时当成像物体是图5中(ξ,η)面 上离轴距离为r

I(v,u)＝|h

其中h

其中P(ρ)和T(ρ)分别为照明臂孔径函数和光瞳滤波器的透过率函数，J

I(r

I(0,Δz)＝|h

在本发明提出的外差体制共焦显微系统中，同样，假设成像物体为点物，通过研究该点物 发出的信号光与本振光产生的中频信号功率，分析外差体制共焦显微系统的分辨率特性。对于 横向分辨率来说，当图5中系统工作于外差探测体制时(等效于图4时，即有本振光入射，有 合束器，无透镜4，无针孔，探测器放置于图中位置1时)，为了单独分析横向分辨率，令Δz＝0。 此时考察物平面(ξ,η)上离轴距离为r

其中β为探测器响应度，f

令上式中ρ'＝aρ，并根据

其中v与(1)式中定义相同。将E

P

对比(4)式可知，当以中频信号电流功率为探测量时，外差探测体制和直接探测体制共焦 显微系统的横向分辨率是相同的。

2.纵向分辨率对比分析

对于纵向分辨率来说，考察光轴上距离透镜距离为d＝f

同样设传输到(x

同样有E

P

对比(12)和(5)可知，两种体制的纵向分辨也相同。即是说，图1和图4中所示两种系统 的横向和纵向分辨率是相同的。需要指出的是以上分析是在光瞳滤波技术应用于外差体制和直 接探测体制共焦显微的情况下得出的，而对于常规的无光瞳滤波器的情况则对应于(3)式中 T(ρ)＝1的情况，此时两种系统分辨率相同的结论也是适用的。

从以上分析结果可以看出，本发明的无共轭针孔系统的横向和纵向分辨率与现有的直接探 测体制共焦显微系统相同；但解决了背景技术中因共轭针孔引起了如下的一些实际操作难题。