酶转化高效制备淫羊藿苷元的方法

技术领域

本发明涉及一种淫羊藿苷元的制备方法，尤其是一种酶转化高效制备淫羊藿苷元的方法。

背景技术

淫羊藿是常用的传统中药，其茎叶入药，具有补肾壮阳、强筋骨、祛风湿、治疗阳痿遗精、风湿痛等药效。目前已发现的淫羊藿属中50余种淫羊藿，其中2015年版《中国药典》所收载的药用淫羊藿为：小蘖科植物淫羊藿(

常见的淫羊藿黄酮苷，如下表所示。

但是，淫羊藿中药材中90%以上的淫羊藿黄酮苷为带2个糖基的淫羊藿苷和带3个糖基的朝藿定A、朝藿定B和朝藿定C等，人体不能直接吸收，生理活性低。口服后，淫羊藿苷和朝藿定A、朝藿定B和朝藿定C的糖基，在肠道消化系统酶和肠道微生物的作用下被降解为无糖基的淫羊藿苷元，吸收其药效。但人体消化系统的转化非常有限，导致大部分淫羊藿黄酮苷很难吸收。淫羊藿苷元吸收率高，具有良好的抗肿瘤、抗血栓、抗肝纤维化、抗骨质疏松、神经保护、改善前列腺功能、提高免疫、抗炎、抗氧化、抗皮肤老化等功能。

为了得到低糖基淫羊藿黄酮和苷元，中国发明专利号为ZL0313363.53，名称为“酶法水解淫羊藿甙糖基制备低糖基淫羊藿甙或甙元的方法”，公开了细菌、霉菌、酵母菌所产的酶逐步水解淫羊藿甙-1（朝藿定A）或淫羊藿甙-2（朝藿定B）或淫羊藿甙-3（朝藿定C）糖基，变成淫羊藿甙-7（箭藿苷A）或淫羊藿甙-8（箭藿苷B）或淫羊藿甙-9（箭藿苷C）；进一步水解成淫羊藿甙-15（淫羊藿次苷II或宝藿苷I），最终变成淫羊藿苷元。细菌、霉菌、酵母菌所产的酶逐步水解淫羊藿苷（淫羊藿甙-1）变成淫羊藿甙-15（淫羊藿次苷II或宝藿苷I）或淫羊藿甙-16（淫羊藿次苷I），最终变成淫羊藿苷元。但是此方法中间产物多，淫羊藿苷元收率很低，得率不到10%。

又有：李慧灵，陈宏基，林育成，叶德晓和周金林等，2020年发表了“生物酶法制备淫羊藿素工艺条件的研究”《生物化工》杂志，2020 年2月、第6卷（第1期），62-64，68页。该文主要研究了β-葡萄糖苷酶、酶解淫羊藿苷糖基转化为淫羊藿素（苷元）过程中，优化温度、pH、缓冲液倍数、底物与酶比以及酶解时间等5个因素，提高淫羊藿素（苷元）转化率方法。但是，文中并没有公开朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C的酶转化，仅研究酶反应底物—淫羊藿苷，存在着反应浓度低、反应容器大，产业化成本高等缺点。

迄今为止，还没有关于利用耐有机溶剂的淫羊藿黄酮苷酶与淫羊藿黄酮苷（朝藿定A或朝藿定B或朝藿定C或淫羊藿苷）在加有有机溶剂的反应体系中反应，高效制备淫羊藿苷元的相关报道。

发明内容

本发明是为了解决现有技术所存在的上述技术问题，提供一种酶转化高效制备淫羊藿苷元的方法。

本发明的技术解决方案是：一种酶转化高效制备淫羊藿苷元的方法，其特征在于：制备耐有机溶剂淫羊藿黄酮苷酶，将耐有机溶剂淫羊藿黄酮苷酶与淫羊藿黄酮苷在含有有机溶剂的反应体系中反应，制备淫羊藿苷元。

依次按照如下步骤制备：

a．在培养基干物中添加质量比例为5～20%的淫羊藿或甘草茎叶或槐花为产酶诱导物，用液态发酵法或固态发酵法对曲霉菌或黑曲霉菌或酵母菌发酵5～8天，得到原酶液，所述原酶液是液态发酵法所得发酵液或固态发酵法所得培养基的浸提液；

b．将原酶液经离心收集上清液，在上清液中加入3倍体积的甲醇或乙醇、过夜、离心收集酶蛋白沉淀；将酶蛋白沉淀溶解于原酶液1/3～1/10体积的0.01～0.06M、pH 4～6的醋酸缓冲液或磷酸缓冲液或柠檬酸缓冲液中，离心除杂，得到耐有机溶剂淫羊藿黄酮苷酶液；

c. 将耐有机溶剂淫羊藿黄酮苷酶液与质量浓度为0.5%～14%的淫羊藿黄酮苷的甲醇或乙醇溶液混合，在温度30℃～60℃下反应6小时～36小时得反应液，所述淫羊藿黄酮苷为朝藿定A或朝藿定B或朝藿定C或淫羊藿苷中的至少一种，所述甲醇或乙醇的体积浓度为5%～40%；

d. 将反应液离心收集沉淀A，将所收集的沉淀A水洗后溶解于四氢呋喃，过滤；向滤液中加入体积浓度为20%～55%的甲醇或乙醇溶液，离心收集沉淀B；用冰冷的体积浓度为20～55%的甲醇或乙醇溶液洗涤沉淀B，干燥得淫羊藿苷元。

所述d步骤离心收集沉淀B的同时收集上清液，并将上清液减压浓缩、干燥，得到淫羊藿苷元。

所述d步骤将反应液离心后分别收集沉淀A及上清液，向所收集的上清液中加入3倍体积的甲醇或乙醇，过夜、离心收集酶蛋白沉淀；将所收集的酶蛋白沉淀溶解于步骤a所得原酶液70～90%体积的0.02M～0.04M的pH 4～6醋酸缓冲液或磷酸缓冲液或柠檬酸缓冲液，离心除杂得到回收酶液。

本发明首先制备耐有机溶剂淫羊藿黄酮苷酶，将耐有机溶剂淫羊藿黄酮苷酶与主要的淫羊藿黄酮苷（朝藿定A或朝藿定B或朝藿定C或淫羊藿苷）在含有有机溶剂的反应体系中进行酶反应，可有效减少中间产物，提高淫羊藿苷元转化得率至90%以上。耐有机溶剂淫羊藿黄酮苷酶可以回收利用，降低了淫羊藿苷元的制备成本，具有操作简单、成本低、适合大批量生产等特点。

具体实施方式

本发明实施例采用的分析方法如下：

一、高校液相色谱（HPLC）检测朝藿定A、B、C、淫羊藿苷：色谱仪，Waters 2695高效液相色谱分析仪，Waters 2996二极管阵列检测器及Empower色谱工作站进行检测。色谱柱，中汇达Kromasil C18色谱柱（5μm,Φ4.6mm×250mm）；流动相，乙腈（A）一水（B）：0～8 min，17～27 A；8～32 min，27 A 等梯度；32～60 min，27%～85％ A线性梯度；60～70 min，85 A等梯度；70～80 min，85％～90A；进样量，10L；柱温，35℃；流量，1.0mL／min；检测波长，273nm。参比标准品朝藿定A、B、C或淫羊藿苷、待测样品各2 mg，分别加10 mL 50%乙醇，制成0．2mg／mL的标准品溶液和待测样品。

二、高校液相色谱（HPLC）检测淫羊藿苷元：色谱仪，Waters 2695高效液相色谱分析仪，Waters 2996二极管阵列检测器及Empower色谱工作站进行检测。色谱柱：中汇达Kromasil C18色谱柱（5 μm, Φ4.6 mm ×250 mm）；流动相：甲醇-四氢呋喃-0.1%磷酸水（35：26：39），等度洗脱40 min。进样量，10 μL；柱温，35 ℃；体积流速，1.0 mL/min；检测波长，273 nm。1 mg标准品淫羊藿苷元，加入10 mL甲醇溶解,制成浓度为1 mg/mL的溶液；经0.45 μm滤膜过滤，待用。待测样品：精密称取1 mg淫羊藿苷元产物溶解于10 mL甲醇，制成0.1 mg/mL的溶液，从中取1 mL加入1.5 mL甲醇制备成浓度为0.04 mg/mL的样品溶液。经0.45 μm滤膜过滤，待用。

三、薄层层析（TLC）法测定淫羊藿黄酮苷酶反应物：酶反应物在硅胶板点样，展开剂为乙酸乙酯：丁酮：甲醇：水 = 8：7：1：1的体积比，展开后的TLC版在紫外线275 nm下显色、拍照；TLC版的各淫羊藿黄酮苷的比例，用Bandscan软件扫描测定。

实施例 1：

本发明的酶转化高效制备淫羊藿苷元的方法，依次按照如下步骤制备：

a．曲霉 [

b. 将原酶液经离心除杂收集上清液，在上清液中加入3倍体积的甲醇溶液、过夜、离心收集酶蛋白沉淀；将酶蛋白沉淀溶解于原酶液1/10体积、0.04M、pH5.0的柠檬酸缓冲液中，离心除杂，得到曲霉菌耐有机溶剂淫羊藿黄酮苷酶液；

c. 将70毫升耐有机溶剂淫羊藿黄酮苷酶液与70毫升质量浓度为8.57%的市售淫羊藿苷的甲醇溶液（体积浓度30%）混合，在温度50℃下反应28小时，得反应液；用TLC检测反应液中淫羊藿苷几乎全部转化为淫羊藿苷元；

d. 将反应液离心后分别收集沉淀A及上清液，向所收集的上清液中加入3倍体积的甲醇，过夜、离心收集酶蛋白沉淀；将所收集的酶蛋白沉淀溶解于步骤a所得原酶液70%体积的0.02M的pH5柠檬酸缓冲液中，离心除杂得到回收酶液，回收酶液的酶活力与a步骤所得原酶液相等，可以重复使用。

将所收集的沉淀A用10毫升水洗2～3次后溶解于25毫升四氢呋喃，过滤；向滤液中加入50毫升体积浓度为40%的甲醇溶液，离心收集沉淀B；用6毫升冰冷的体积浓度为40%的甲醇洗涤沉淀B 2～3次，60℃干燥，得3.0克淫羊藿苷元。经HPLC检测，淫羊藿苷元产物纯度达98%，淫羊藿苷元理论得率为91.8%。

离心收集沉淀B的同时收集上清液，并将上清液减压浓缩，干燥，得到0.24克的91.4%淫羊藿苷元（其中含有1.94%淫羊藿次苷II和1.42%的淫羊藿次苷I）。

以实施例1的方法，将淫羊藿苷替换为质量浓度0.5～14%的市售朝藿定A或朝藿定B或朝藿定C中的至少一种，且将步骤c体积浓度为30%的甲醇替换为体积浓度为5%～40%的甲醇或乙醇，可制备得到理论得率90%以上的淫羊藿苷元产物。

实施例 2：

a．制备耐有机溶剂的淫羊藿黄酮苷酶：黑曲霉菌[

b. 将原酶液经离心除杂收集上清液，在上清液中加入3倍体积体积浓度95%的乙醇、过夜、离心收集酶蛋白沉淀；将酶蛋白沉淀溶解于原酶液体积1/5、 0.04M、pH5.0的磷酸缓冲液中，离心除杂，得到黑曲霉菌耐有机溶剂淫羊藿黄酮苷酶液；

c. 将100毫升耐有机溶剂淫羊藿黄酮苷酶液与100毫升质量浓度为6%的市售朝藿定A的乙醇溶液混合（乙醇的体积浓度为30%），在温度50℃下反应20小时，得反应液；用TLC检测朝藿定A全部转化为淫羊藿苷元；

d. 将反应液离心后分别收集沉淀A及上清液，向所收集的上清液中加入3倍体积的乙醇，过夜、离心收集酶蛋白沉淀；将所收集的酶蛋白沉淀溶解于步骤a所得原酶液80%体积、0.03M、pH5磷酸缓冲液中，离心除杂得到回收酶液，回收酶液的酶活力与a步骤所得原酶液相等，可以重复使用。

将所收集的沉淀A用10毫升水洗2～3次后溶解于25毫升四氢呋喃，过滤；向滤液中加入50毫升体积浓度为50%的乙醇溶液，离心收集沉淀B；用6毫升冰冷的体积浓度为30%的乙醇洗涤沉淀B2～3次，60℃干燥，得2.41克淫羊藿苷元。经HPLC检测，淫羊藿苷元产物纯度达98%，淫羊藿苷元理论得率为91.1%。

以实施例2的方法，将朝藿定A替换为质量浓度1～14%的市售淫羊藿苷或朝藿定B或朝藿定C中的至少一种，可制备得到理论得率90%以上的淫羊藿苷元产物。

实施例3：

a．制备耐有机溶剂的淫羊藿黄酮苷酶：假丝酵母菌接种于400克（干物质量）的含有15%槐花粉的麦麸固态培养基中，在30℃培养（偶尔搅拌）8天；然后用2000毫升0.02摩尔和pH=5.0醋酸缓冲液浸出固态培养基中的酶，分离上清，过滤得滤液，即原酶液；

b. 将原酶液经离心除杂收集上清液，在上清液中加入3倍体积甲醇、过夜、离心收集酶蛋白沉淀；将酶蛋白沉淀溶解于原酶液体积1/8、0.04M、pH5.0的醋酸缓冲液中，离心除杂，得到假丝酵母菌耐有机溶剂淫羊藿黄酮苷酶液；

c. 将100毫升耐有机溶剂淫羊藿黄酮苷酶液与100毫升质量浓度为6%的市售朝藿定C的乙醇溶液混合（乙醇的体积浓度为25%），在温度50℃下反应24小时，得反应液；用TLC检测朝藿定C全部转化为淫羊藿苷元；

d. 将反应液离心后分别收集沉淀A及上清液，向所收集的上清液中加入3倍体积的乙醇，过夜、离心收集酶蛋白沉淀；将所收集的酶蛋白沉淀溶解于步骤a所得原酶液70%体积的0.04M的pH5醋酸缓冲液中，离心除杂得到回收酶液，回收酶液的酶活力与a步骤所得原酶液相等，可以重复使用。

将所收集的沉淀淫羊藿苷元A用10毫升水洗2～3次后溶解于25毫升四氢呋喃，过滤；向滤液中加入50毫升体积浓度为50%的乙醇溶液，离心收集沉淀淫羊藿苷元B；用6毫升冰冷的体积浓度为30%的乙醇洗涤沉淀B 2次，60℃干燥，得2.41克淫羊藿苷元。经HPLC检测，淫羊藿苷元产物纯度达98%，淫羊藿苷元理论得率为91.3%。

以实施例3的方法，将朝藿定C替换为质量浓度0.5～14%的市售淫羊藿苷或朝藿定A或朝藿定B中的至少一种，且步骤c所用乙醇的体积浓度为10%～40%，可制备得到理论得率90%以上的淫羊藿苷元产物。