一种血小板提取方法

技术领域

本发明涉及血小板提取技术领域，特别是一种血小板提取方法。

背景技术

近年，血小板转录组检测作为肿瘤液体活检技术之一，相对其他液体活检方式有确定的优势，其数量大，易提取，拥有大量RNA，并且血小板会接收外部信号特异性加工RNA。研究发现血小板在肿瘤生长相关的系统性以及局部反应中起到核心作用，由外部刺激导致的血小板表面受体和脂多糖激活，并可以诱导循环血小板内前体mRNA特异性拼接。并且血小板不仅是创伤的“第一反映者”，也是肿瘤发生和转移的第一反映者，并参与肿瘤血管生成以及转移过程。血小板在肿瘤细胞以及肿瘤微环境内基质或免疫细胞刺激下可能进行序列特异性的mRNA拼接。结合血小板的外部刺激下特异性拼接能力和血小板直接摄取循环mRNA的能力，可以推断含有大量动态mRNA的血小板可应用于肿瘤的诊断。Wurdinger教授团队对779人血小板RNA测序，发现TEPs转录组水平数据可区分正常人和肺癌，诊断能力不受年龄，肿瘤分期等因素影响。近年，其结果得到多个团队验证。血小板转录组检测不仅在肺癌的诊断，也在乳腺癌，卵巢癌等癌症的诊断中表现出较好的诊断作用。

但是，血小板转录组研究的关键技术是血小板的提取，Wurdinger教授团队的提取方法是主流的血小板提取方法，通过两次梯度离心实现，简单易行，但是，该方法虽然简单，但是血小板获得率低，并且大量幼稚的大血小板未被提取到，而肿瘤患者和正常人，血小板平均体积是最大的血小板特征，利用这种方法提取的血小板的研究，将有一定的先天不足，大量肿瘤相关分子信号未能获得。

发明内容

针对上述问题，本发明提供了一种血小板提取方法，具有操作简单、血小板获得率高、大血小板获得数高的优点。

本发明采用的技术方案如下：

一种血小板提取方法，该提取方法如下：对抗凝血处理后的全血样本进行至少两级离心处理，并从每次离心处理后得到的上层血浆层中提取血小板，将最后一次离心处理后分离得到的上层乏血小板血浆层与第一次离心处理后分离得到的下层血细胞层混合，重新制备全血样本，再对新制备的全血样本进行离心处理，从分离得到的上层富含血小板血浆层中再次提取血小板，将提取到的全部血小板混合。

上述技术方案的工作原理如下：

本发明在对全血样本进行至少两级离心处理后，将最后一次得到的上层清液与第一次得到的下层血细胞交叉混合，重新制备全血样本，对重新制备的全血样本再次离心，提取血小板，并将全部提取出的血小板混合收集。临床上全血中有些大的血小板，在第一次离心会被离心到下层液中，本发明通过重新制备全血样本，再次离心可以回收这些大血小板，可有效解决传统提取方法中，在第一次离心全血样本时，血小板下沉到血细胞层中无法被提取到，导致血小板回收率低的技术问题。

此外，对于血小板与肿瘤的研究，血小板与肿瘤反应后体积会变大，采用本发明的方法，有助于收集大体积的血小板，利于进行肿瘤与血小板方向的相关研究。

在进一步的技术方案中，对抗凝血处理后的血液样本进行至少两级离心处理的方法如下：

A1、将抗凝血处理后的全血样本置于血细胞分析仪中检测并记录全血中的血小板数，将检测完毕的全血样本置于离心机中，调节转速，离心20min，分离得到上层富含血小板血浆层和下层血细胞层；

A2、将上层富含血小板血浆层吸取至另一新的EP管中，再次上机检测并记录血小板数，并将下层血细胞层置于涡旋仪中进行涡旋混匀后上机检测并记录血小板数；

A3、将检测完毕的上层富含血小板血浆层置于离心机中，调节转速，离心20min，分离得到上层乏血小板血浆层和下层血小板层，将上层乏血小板血浆层吸取至另一新的EP管中，再次上机检测并记录血小板数，重复该步骤至完成全部离心次数。

在进一步的技术方案中，重新制备全血样本，再对新制备全血样本进行离心处理的方法如下：

B1、将检测完毕的上层乏血小板血浆层与第一次离心得到的下层血细胞层混合均匀，制得第二次全血样本，上机检测并记录第二次全血样本中的血小板数；

B2、将检测完毕的第二次全血样本置于离心机中，调节转速，离心20min，分离得到上层富含血小板血浆层和下层血小板层，将上层富含血小板血浆层吸取至另一新的软试管/EP管中，再次上机检测并记录血小板数。

在进一步的技术方案中，步骤A1中，离心转速为120rpm。

在进一步的技术方案中，步骤A3中，离心转速为360rpm。

在进一步的技术方案中，步骤B2中，离心转速为120rpm。

本发明的有益效果是：本发明通过重新制备全血样本，可有效解决传统提取方法中，在第一次离心全血样本时，大体积的血小板下沉到血细胞层中无法被提取到，导致血小板回收率低的技术问题，具有操作简单、血小板获得率高、大血小板获得数高的优点。

具体实施方式

下面对本发明的实施例进行详细说明。

实施例：

一种血小板提取方法，包括以下步骤：

S1、将抗凝血处理后的全血样本(P1)置于血细胞分析仪中检测并记录全血中的血小板数，将检测完毕的全血样本置于离心机中，调节离心转速为120rpm，离心20min，分离得到上层富含血小板血浆层(PRP1)和下层血细胞层(B1)；

S2、将上层富含血小板血浆层(PRP1)吸取至另一新的EP管中，再次上机检测并记录血小板数，并将下层血细胞层(B1)置于涡旋仪中进行涡旋混匀后上机检测并记录血小板数；

S3、将检测完毕的上层富含血小板血浆层(PRP1)置于离心机中，调节离心转速为360rpm，离心20min，分离得到上层乏血小板血浆层(PPP1)和下层血小板层(PLA1)，将上层乏血小板血浆层(PPP1)吸取至另一新的EP管中，再次上机检测并记录血小板数；

S4、将检测完毕的上层乏血小板血浆层(PPP1)与第一次离心得到的下层血细胞层(B1)混合均匀，制得第二次全血样本(P2)，上机检测并记录第二次全血样本(P2)中的血小板数；

S5、将检测完毕的第二次全血样本(P2)置于离心机中，调节离心转速为120rpm，离心20min，分离得到上层富含血小板血浆层(PRP2)和下层血细胞层(B2)，将上层富含血小板血浆层(PRP2)吸取至另一新的软试管/EP管中，再次上机检测并记录血小板数；

S6、将测试完毕的上层富含血小板血浆层(PRP2)置于离心机中，调节离心转速为360rpm，离心20min，得到上层乏血小板血浆层(PPP2)和下层血小板层(PLA2)，将上层乏血小板血浆层(PPP2)吸取至另一新的软试管/EP管中，再次上机检测血小板数。

采用上述提取方法提取6组全血样本中的血小板，每组采用的全血样本为4ml，6组数据如下：

计算上述6组测试的回收率，

上述6组测试的结果如下：

采用本发明的提取方法提取血小板的6组回收率分别为：65.32％、80.12％、73.45％、94.53％、62.16％、66.59％，血小板的平均回收率为73.70％；

采用传统的提取方法提取血小板的6组回收率分别为：43.55％、64.40％、60.12％、75.80％、49.84％、48.45％，血小板的平均回收率为57.03％；

可见，采用本发明的提取方法，血小板的回收率明显高于传统的提取方法。

以上所述实施例仅表达了本发明的具体实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。