用于保存角膜内皮细胞的方法和容器

技术领域

本发明涉及用于保存角膜内皮细胞的技术。

背景技术

视觉信息是如下识别的：从眼球最前面的透明组织即角膜透射的光到达视网膜而使视网膜的神经细胞兴奋，所产生的电信号经由视神经到达大脑的视觉区，从而被识别。为了获得良好的视力，重要的是角膜是透明的。角膜的透明性是通过利用角膜内皮细胞的泵功能和屏障功能使含水率保持恒定、从而保持的。

人的角膜内皮细胞在出生时以每1平方毫米约3000个的密度存在，但再生的能力有限，因此在受到重度损伤时不能维持功能，从而角膜的透明性丧失。在由角膜内皮营养不良、各种原因引起的角膜内皮功能障碍导致的大泡性角膜病变中，角膜产生浮肿和浑浊，从而导致显著的视力下降。现状是，对于大泡性角膜病变，使用供体角膜进行异体角膜移植。然而，由于手术侵入、排斥反应、供体不足等，现在的角膜移植存在很多要解决的问题。

为了克服这些问题，近年作为针对角膜内皮疾病的治疗，开发出了侵入性低的细胞移植治疗(非专利文献1)。角膜内皮细胞的培养是困难的，存在使用常规方法时不增殖(非专利文献2和3)、成纤维细胞化(非专利文献4)、细胞老化(非专利文献5)等问题，角膜内皮细胞的培养方法正在火热研究中，实际的临床应用已成为可能(非专利文献1)。

现有技术文献

非专利文献1:Kinoshita S,Koizumi N,Ueno M,et al.Injection of culturedcells with a ROCK inhibitor for bullous keratopathy.N Engl J Med2018；378:995-1003.

非专利文献2:Okumura N,Ueno M,Koizumi N,et al.Enhancement on primatecorneal endothelial cell survival in vitro by a ROCK inhibitor.InvestOphthalmol Vis Sci 2009；50:3680-3687.

非专利文献3:Nakahara M,Okumura N,Kay EP,et al.Corneal endothelialexpansion promoted by human bone marrow mesenchymal stem cell-derivedconditioned medium.PLoS One 2013；8:e69009.

非专利文献4:Okumura N,Kay EP,Nakahara M,Hamuro J,Kinoshita S,KoizumiN.Inhibition of TGF-beta Signaling Enables Human Corneal Endothelial CellExpansion In Vitro for Use in Regenerative Medicine.PLoS One 2013；8:e58000.

非专利文献5:Hongo A,Okumura N,Nakahara M,Kay EP,Koizumi N.The Effectof a p38 Mitogen-Activated Protein Kinase Inhibitor on Cellular Senescence ofCultivated Human Corneal Endothelial Cells.Invest Ophthalmol Vis Sci 2017；58:3325-3334.

发明内容

本发明人等进行了深入研究，结果发现了以高的存活率保存角膜内皮细胞的方法，至此完成发明。具体而言，本发明人等发现，通过在具有特定底面积的容器中保存角膜内皮细胞，能够以高存活率维持角膜内皮细胞。这样保存的角膜内皮细胞具有正常的角膜内皮细胞的功能，因此，在本发明中，提供不需要进一步的实质性的操作而能够直接使用(Ready-to-use，即用)的细胞作为治疗用细胞。

因此，本发明提供以下内容。

(项目1)

一种保存角膜内皮细胞和/或角膜内皮样细胞的方法，其包含：在底面积为至少约0.7cm

(项目2)

根据项目1所述的方法，其中，用于保存所述细胞的液体的液面为约0.75mm以上。

(项目3)

根据项目1或2所述的方法，其中，所述容器的底面积为约0.7～约4cm

(项目4)

根据项目1～3中的任一项所述的方法，其中，所述容器的底面积为约1.5～约3cm

(项目5)

根据项目1～4中的任一项所述的方法，其中，所述容器的底面积为约1.8～约2cm

(项目6)

根据项目1～5中的任一项所述的方法，其中，所述容器没有进行用于粘附培养的表面处理。

(项目7)

根据项目1～6中的任一项所述的方法，其中，所述容器为低粘附表面容器或表面未处理容器。

(项目8)

根据项目1～7中的任一项所述的方法，其中，所述容器由聚苯乙烯、聚丙烯、或玻璃制成。

(项目9)

根据项目1～8中的任一项所述的方法，其中，所述容器选自由24孔板、管形瓶、注射器、培养皿组成的组。

(项目10)

根据项目1～9中的任一项所述的方法，其中，所述细胞的保存在约12℃～约42℃的温度下进行。

(项目11)

根据项目1～10中的任一项所述的方法，其中，所述细胞的保存在约17℃～约39℃的温度下进行。

(项目12)

根据项目1～11中的任一项所述的方法，其中，所述细胞的保存在约27℃～约37℃的温度下进行。

(项目13)

根据项目1～12中的任一项所述的方法，其中，所述细胞的保存在约37℃的温度下进行。

(项目14)

一种容器，其为用于保存角膜内皮细胞和/或角膜内皮样细胞的容器，底面积为至少约0.7cm

(项目15)

根据项目14所述的容器，其中，所述容器具有允许液面的高度为约0.75mm以上的结构。

(项目16)

根据项目14或15所述的容器，其为用于保存角膜内皮细胞和/或角膜内皮样细胞的容器，底面积为约0.7～约4cm

(项目17)

根据项目14～16中的任一项所述的容器，其中，所述容器的底面积为约1.5～约3cm

(项目18)

根据项目14～17中的任一项所述的容器，其中，所述容器的底面积为约1.8～约2cm

(项目19)

根据项目14～18中的任一项所述的容器，其中，所述容器没有进行粘附培养的表面处理。

(项目20)

根据项目14～19中的任一项所述的容器，其中，所述容器为低粘附表面容器或表面未处理容器。

(项目21)

根据项目14～20中的任一项所述的容器，其中，所述容器由聚苯乙烯、聚丙烯、或玻璃制成。

(项目22)

根据项目14～21中的任一项所述的容器，其中，所述容器选自由24孔板、管形瓶、注射器、或培养皿组成的组。

(项目23)

一种角膜内皮细胞或角膜内皮样细胞，其通过项目1～13中的任一项所述的方法进行了保存。

(项目24)

一种用于处置或预防角膜内皮的障碍、疾病或症状的组合物，其包含项目23所述的角膜内皮细胞和/或角膜内皮样细胞。

(项目25)

根据项目24所述的组合物，其还包含ROCK抑制剂。

(项目26)

根据项目25所述的组合物，其特征在于，所述组合物与ROCK抑制剂组合给予。

(项目27)

根据项目25或26所述的组合物，其中，所述ROCK抑制剂为Y-27632。

(项目28)

一种含有细胞的容器，其具备：(A)角膜内皮细胞和/或角膜内皮样细胞；以及(B)用于保存该角膜内皮细胞和/或角膜内皮样细胞的容器，所述含有细胞的容器的底面积为至少约0.7cm

(项目29)

根据项目28所述的含有细胞的容器，其还包含项目15～22中的任一项或多项中记载的特征。

(项目30)

根据项目28或29所述的含有细胞的容器，其还包含ROCK抑制剂。

本发明进一步还提供以下的项目。

(项目1A)

一种保存角膜内皮细胞和/或角膜内皮样细胞的方法，其包含：在底面积为至少约0.7cm

(项目2A)

根据项目1A所述的方法，其中，所述角膜内皮细胞和角膜内皮样细胞为能够应用于临床的细胞。

(项目3A)

根据项目1A或2A所述的方法，其特征在于，所述经保存的角膜内皮细胞和角膜内皮样细胞不需要进一步的加工或培养而直接进行给予。

(项目4A)

根据项目1A～3A中的任一项所述的方法，其中，保存至少约6小时。

(项目5A)

根据项目1A～4A中的任一项所述的方法，其中，用于保存所述细胞的液体的液面高度为约0.75mm以上。

(项目6A)

根据项目1A～5A中的任一项所述的方法，其中，所述容器的底面积为约0.7～约4cm

(项目7A)

根据项目1A～6A中的任一项所述的方法，其中，所述容器的底面积为约1.5～约3cm

(项目8A)

根据项目1A～7A中的任一项所述的方法，其中，所述容器的底面积为约1.8～约2cm

(项目9A)

根据项目1A～8A中的任一项所述的方法，其中，所述容器没有进行用于粘附培养的表面处理。

(项目10A)

根据项目1A～9A中的任一项所述的方法，其中，所述容器为低粘附表面容器或表面未处理容器。

(项目11A)

根据项目1A～10A中的任一项所述的方法，其中，所述容器由聚苯乙烯、聚丙烯、或玻璃制成。

(项目12A)

根据项目1A～11A中的任一项所述的方法，其中，所述容器选自由24孔板、管形瓶、注射器、培养皿组成的组。

(项目13A)

根据项目1A～12A中的任一项所述的方法，其中，所述细胞的保存在约0℃～约42℃的温度下进行。

(项目14A)

根据项目1A～13A中的任一项所述的方法，其中，所述细胞的保存在约17℃～约39℃的温度下进行。

(项目15A)

根据项目1A～14A中的任一项所述的方法，其中，所述细胞的保存在约27℃～约37℃的温度下进行。

(项目16A)

根据项目1A～15A中的任一项所述的方法，其中，所述细胞的保存在约37℃的温度下进行。

(项目17A)

根据项目1A～16A中的任一项所述的方法，其中，所述角膜内皮细胞和/或角膜内皮样细胞以细胞悬浮液的状态保存。

(项目18A)

根据項目1A～17A中的任一项所述的方法，其中，所述悬浮液的体积为至少约50μL。

(项目19A)

根据项目1A～18A中的任一项所述的方法，其中，所述悬浮液的体积为约100μL～约2000μL。

(项目20A)

根据项目1A～19A中的任一项所述的方法，其中，进行了所述保存的前述角膜内皮细胞和/或角膜内皮样细胞能够用于细胞输注疗法。

(项目21A)

根据项目1A～20A中的任一项所述的方法，其中，在所述容器中保存的所述细胞的细胞密度为约2×10

(项目22A)

根据项目1A～21A中的任一项所述的方法，其中，在所述容器中保存的所述细胞的细胞密度为约2×10

(项目23A)

一种容器，其为用于保存角膜内皮细胞和/或角膜内皮样细胞的容器，底面积为至少约0.7cm

(项目24A)

根据项目23A所述的容器，其中，所述容器具有允许液面的高度为约0.75mm以上的结构。

(项目25A)

根据项目23A或24A所述的容器，其为用于保存角膜内皮细胞和/或角膜内皮样细胞的容器，底面积为约0.7～约4cm

(项目26A)

根据项目23A～25A中的任一项所述的容器，其中，所述容器的底面积为约1.5～约3cm

(项目27A)

根据项目23A～26A中的任一项所述的容器，其中，所述容器的底面积为约1.8～约2cm

(项目28A)

根据项目23A～27A中的任一项所述的容器，其中，所述容器没有进行粘附培养的表面处理。

(项目29A)

根据项目23A～28A中的任一项所述的容器，其中，所述容器为低粘附表面容器或表面未处理容器。

(项目30A)

根据项目23A～29A中的任一项所述的容器，其中，所述容器由聚苯乙烯、聚丙烯、或玻璃制成。

(项目31A)

根据项目23A～30A中的任一项所述的容器，其中，所述容器选自由24孔板、管形瓶、注射器、或培养皿组成的组。

(项目32A)

根据项目23A～31A中的任一项所述的容器，其中，所述容器用于以细胞悬浮液的状态保存所述角膜内皮细胞和/或角膜内皮样细胞。

(项目33A)

根据项目32A所述的容器，其中，所述角膜内皮细胞和/或角膜内皮样细胞能够用于细胞输注疗法。

(项目34A)

根据项目23A～33A中的任一项所述的容器，其中，所述角膜内皮细胞和/或角膜内皮样细胞被保存至少约6小时。

(项目35A)

一种角膜内皮细胞和/或角膜内皮样细胞，其通过项目1A～22A中的任一项所述的方法进行了保存。

(项目36A)

根据项目35A所述的角膜内皮细胞和/或角膜内皮样细胞，其中，所述角膜内皮细胞和/或角膜内皮样细胞被保存至少约6小时。

(项目37A)

一种用于处置或预防角膜内皮的障碍、疾病或症状的组合物，其包含项目35A或36A所述的角膜内皮细胞和/或角膜内皮样细胞。

(项目38A)

根据项目37A所述的组合物，其还包含ROCK抑制剂。

(项目39A)

根据项目38A所述的组合物，其特征在于，所述组合物与ROCK抑制剂组合给予。

(项目40A)

根据项目38A或39A所述的组合物，其中，所述ROCK抑制剂选自由Y-27632、利舒地尔(Ripasudil)、法舒地尔(fasudil)、或其药学上允许的盐。

(项目41A)

一种含有细胞的容器，其具备：(A)角膜内皮细胞和/或角膜内皮样细胞；以及(B)用于保存该角膜内皮细胞和/或角膜内皮样细胞的容器，所述含有细胞的容器的底面积为至少约0.7cm

(项目42A)

根据项目41A所述的含有细胞的容器，其还包含项目24A～34A中的任一项或多项中记载的特征。

(项目43A)

根据项目41A或42A所述的含有细胞的容器，其还包含ROCK抑制剂。

(项目44A)

根据项目41A～43A中的任一项所述的含有细胞的容器，其中，所述细胞的细胞密度为约2×10

(项目45A)

根据项目41A～44A中的任一项所述的含有细胞的容器，其中，所述细胞的细胞数为约2×10

(项目46A)

根据项目41A～45A中的任一项所述的含有细胞的容器，其中，所述角膜内皮细胞和/或角膜内皮样细胞的悬浮液的体积为至少约50μL。

(项目47A)

根据项目46A所述的方法，其中，所述悬浮液的体积为约300μl～约600μl。

(项目48A)

一种细胞制剂，其包含：角膜内皮细胞和/或角膜内皮样细胞、以及用于保存该角膜内皮细胞和/或角膜内皮样细胞的容器，该容器的底面积为至少约0.7cm

(项目49A)

根据项目48A所述的细胞制剂，其中，所述容器具有项目24A～34A中的任一项或多项中记载的特征。

(项目50A)

根据项目48A或49A所述的细胞制剂，其中，所述角膜内皮细胞和/或角膜内皮样细胞被保存至少约6小时。

(项目51A)

根据项目48A～50A中的任一项所述的细胞制剂，其中，所述角膜内皮细胞和/或角膜内皮样细胞以悬浮状态保存。

(项目52A)

根据项目48A～51A中的任一项所述的细胞制剂，其中，所述以悬浮状态保存的所述角膜内皮细胞和/或角膜内皮样细胞能够用于细胞输注疗法。

(项目53A)

一种处置或预防被检体的角膜内皮的障碍、疾病或症状的方法，其包含如下工序：对该被检体给予有效量的、通过项目1A～22A中的任一项所述的方法进行了保存的角膜内皮细胞和/或角膜内皮样细胞。

(项目54A)

根据项目53A所述的方法，其中，所述角膜内皮细胞和/或角膜内皮样细胞被保存至少约6小时。

(项目55A)

根据项目53A所述的方法，其中，所述角膜内皮细胞和/或角膜内皮样细胞以细胞悬浮液的状态保存。

(项目56A)

根据项目55A所述的方法，其中，给予约20μL～约500μL的所述细胞悬浮液。

(项目57A)

根据项目55A所述的方法，其中，给予约200μL～约300μL的所述细胞悬浮液。

(项目58A)

根据项目53A～57A中的任一项所述的方法，其中，所述角膜内皮细胞或角膜内皮样细胞与有效量的ROCK抑制剂组合给予。

(项目59A)

根据项目58A所述的方法，其中，所述ROCK抑制剂选自Y-27632、利舒地尔(Ripasudil)、法舒地尔、或其药学上允许的盐。

(项目60A)

根据项目53A～59A中的任一项所述的方法，其中，给予约4万个～约400万个细胞。

(项目61A)

根据项目53A～60A中的任一项所述的方法，其中，给予约40万个～约100万个细胞。

(项目62A)

一种通过项目1A～22A中的任一项所述的方法进行了保存的角膜内皮细胞或角膜内皮样细胞，其用于处置或预防被检体的角膜内皮的障碍、疾病或症状。

(项目63A)

一种通过项目1A～22A中的任一项所述的方法进行了保存的角膜内皮细胞或角膜内皮样细胞在制造用于处置或预防被检体的角膜内皮的障碍、疾病或症状的药物中的应用。

本发明中，上述一个或多个特征意图在明示的组合的基础之上，进一步组合而提供。本发明的进一步的实施方式和优点只要根据需要在阅读了以下详细的说明并理解，则能够本领域技术人员读懂。

通过本发明，能够以高的细胞存活率保存角膜内皮细胞。另外，进行了这样的保存的角膜内皮细胞具有正常的角膜内皮细胞的功能，另外，能够作为角膜内皮疾病等的治疗用细胞而使用。另外，通过本发明，提供能够以即用来提供的细胞制剂。

附图说明

图1：图1A表示保存角膜内皮细胞的例示步骤的概略。图1B表示在24孔板(细胞培养平板)、24孔板(超低粘附)、48孔板(悬浮培养)和96孔板(超低粘附)中保存角膜内皮细胞之后，用平缓的移液回收细胞后的各平板的相位差显微镜图像。

图2：图2A表示在24孔板(超低粘附)、48孔板(悬浮培养)、96孔板(超低粘附、平底)、96孔板(超低粘附、圆底)、15ml锥形管(ConicalTubes)(超低粘附)和2ml冷冻管(CryoVial)中保存的角膜内皮细胞的活细胞与死细胞的比例。图2B表示在24孔板(超低粘附)中37℃、24孔板(超低粘附)中4℃、24孔板(细胞培养平板)中37℃下保存的角膜内皮细胞的活细胞与死细胞的比例。图2C表示在24孔板(超低粘附)、24孔板(无处理)和10ml玻璃管形瓶管中保存的角膜内皮细胞的活细胞与死细胞的比例。图2D表示在24孔板(超低粘附)中在保存液量300μl、1000μl、1500μl和2500μl下保存的角膜内皮细胞的活细胞与死细胞的比例。棒的白色部分表示死细胞、黑色部分表示活细胞。图2E表示将在24孔板(超低粘附)中保存的角膜内皮细胞接种于培养平板3小时后和2周后的相位差显微镜图像。

图3：图3A表示在24孔板(超低粘附)中保存的角膜内皮细胞被注入至前房的兔子模型的裂隙灯图像。图3A中，从左侧起表示注入后第1天、第7天和第14天的图像，从上方起表示对照眼(没有注入细胞)、注入保存24小时的细胞的眼、注入保存48小时的细胞的眼和注入保存72小时的细胞的眼。图3B表示注入后第14天的沙姆图像(Scheimpflug images)。

图4：图4A表示在24孔板(超低粘附)中保存的角膜内皮细胞被注入至前房的兔子模型中，注入后第14天用Pentacam

图5表示将50万个在1ml注射器中培养的角膜内皮细胞悬浮于300μl的细胞保存液而进行保存的状态。

图6表示在1ml注射器中将角膜内皮细胞保存72小时后的相位差显微镜照片。细胞沉淀在注射器的侧面。

图7表示在1ml的注射器中将角膜内皮细胞保存72小时后、轻敲后的相位差显微镜照片。细胞从注射器的侧面浮起。

图8表示在1ml的注射器中将角膜内皮细胞保存72小时后、轻敲、将注射器用细胞保存液轻柔地清洗后的相位差显微镜照片。没有确认到细胞在注射器侧面的粘附。

图9表示在12℃、17℃、22℃、27℃、32℃、35℃、37℃、39℃、和42℃下保存的角膜内皮细胞的活细胞与死细胞的比例。棒的白色部分表示死细胞、黑色部分表示活细胞。

图10表示(1)管形瓶(Maruemu Corporation.大阪、0501-02)、(2)管形瓶(2ml、直径16mm、高度33mm、IRAS处理、Iwata Glass Industrial Co.,Ltd.、大阪、lot：181024)、和(3)管形瓶(2ml、直径16mm、高度33mm、IRAS处理和二氧化硅涂布加工(SiO

图11表示(1)管形瓶(Maruemu Corporation.、大阪、0501-02)、(2)管形瓶(2ml、直径16mm、高度33mm、IRAS处理、Iwata Glass Industrial Co.,Ltd.、大阪)、和(3)管形瓶(2ml、直径16mm、高度33mm、IRAS处理和二氧化硅涂布加工(SiO

具体实施方式

以下，对本发明进行说明。本说明书整体来看，单数形式的表达只要没有特别说明，则应该理解为也包含其复数形式的概念。因此，单数形式的冠词(例如，是英语的情况下，“a”、“an”、“the”等)只要没有特别说明则应该理解为也包含其复数形式的概念。另外，本说明书中所使用的术语只要没有特别说明，应该理解为用该领域通常使用的意思使用。因此，只要没有被定义为其他，则本说明书中所使用的全部专业术语和科学技术术语具有与本发明所属领域的本领域技术人员的通常理解相同的意思。在矛盾的情况下，以本说明书(包含定义)为准。本说明书中，“约”是指其后的值±10％。

(定义)

本说明书中，“角膜内皮细胞”以本领域中所使用的通常意思进行使用。角膜是指构成眼的层状组织之一，透明，位于最接近外界的部分。角膜在人体中从外侧(体表)起依次由5层构成，由外侧起由角膜上皮、鲍曼膜、固有层、德斯梅膜(角膜内皮基底膜)、和角膜内皮构成。只要没有特别的限定，上皮和内皮以外的部分有时总称为“角膜实质”，本说明书中也这样称呼。本说明书中，“HCEC”(human corneal endothelial cells)是人角膜内皮细胞的简称。

本说明书中，“角膜内皮样细胞”是指：由干细胞分化、例如由iPS细胞等分化且具有与角膜内皮细胞实质相同的功能的细胞。使干细胞例如ES细胞、iPS细胞等分化成角膜内皮样细胞的方法在本领域中是公知的(McCabe et al.，PLoS One.2015Dec 21；10(12)：e0145266；Ali et al.，Invest Ophthalmol Vis Sci.2018May 1；59(6)：2437-2444)。典型的例子中，简单而言，使用细胞解离缓冲液(LifeTechnologies)在第0天以1：12进行稀释而将iPS细胞接种于35mm基质胶涂覆平板(Corning)(将80％铺满的平板分成12个平板)。使iPS细胞在培养基(mTeSR1；STEMCELL Technologies Inc.)中增殖4天。在第4天将mTeSR1培养基更换为Smad抑制剂培养基，所述Smad抑制剂培养基是在80％DMEM-F12(LifeTechnologies)、20％KSR(Life Technologies)、1％非必需氨基酸(Life Technologies)、1mM L-谷氨酰胺(STEMCELL Technologies，inc.)、0.1mMβ-巯基乙醇(MilliporeSigma)、和8ng/mLβFGF(MilliporeSigma)的基本培养基中包含500ng/mL人重组头蛋白(R&DSystems、Minneapolis、MN、USA)和10μM的SB431542(MilliporeSigma)而得到的。在第6天，将Smad抑制剂培养基更换为角膜培养基，所述角膜培养基是在80％DMEM-F12(Life Technologies)、20％KSR(Life Technologies)、1％非必需氨基酸(Life Technologies)、1mML-谷氨酰胺(STEMCELL Technologies，inc.)、0.1mMβ-巯基乙醇(Millipore Sigma)、和8ng/mLβFGF(MilliporeSigma)的基本培养基中包含0.1×B27营养剂(Life Technologies)、10ng/mL重组人血小板源生长因子-BB(PDGF-BB；PeproTech，Rocky Hill，NJ，USA)和10ng/mL重组人Dickkopf相关蛋白-2(DKK-2；R&D Systems)而得到的。在第7天，将分化中的CEC转移至新的基质胶涂覆平板(35mm)，进而在角膜培养基中使之增殖13天。在第20天回收分化的CEC。上述例子是典型的例子，本领域技术人员也可以使用该领域公知的其他方法(Fukutaetal.，PLoS One.2014Dec 2；9(12)：e112291；Hayashi et al.，Nature.2016Mar 17；531(7594)：376-80)。另外，只要是本领域技术人员，可以适宜调节本领域公知的方法的条件而制作角膜内皮样细胞。

“角膜内皮细胞”和“角膜内皮样细胞”也可以包含磁性材料(例如、铁)。例如在前房内注入了包含磁性物质的角膜内皮细胞的情况下，能够利用磁力促进与角膜的内侧(例如德斯梅膜)接近、粘附(Patel et al.,Invest Ophthal mol Vis Sci.2009May；50(5):2123-31；Mimura et al.,Exp Eye Res.2003Jun；76(6):745-51；和Mimura et al.,ExpEye Res.2005Feb；80(2):149-57)。“磁性材料”是指可被磁场磁化的物质，可列举出例如铁、钴、镍、铁素体等。

本说明书中，“粘附培养”是指：使细胞粘附于容器而进行培养。作为粘附培养用的容器，可列举出例如进行了细胞培养(TC：tissue culture，组织培养)处理的容器。

本说明书中，“低粘附”是指：在细胞的培养或保存时，细胞几乎不会粘附于容器。低粘附表面容器例如表面用水凝胶涂覆(例如通过共价键)、和/或涂覆了二氧化硅(SiO

本说明书中，“表面未处理”是指没有进行表面处理；“表面未处理容器”是指与低粘附表面容器同样地能够在细胞不粘附于容器的情况下对细胞进行培养或保存的容器。表面未处理容器有时也会以悬浮(漂浮)培养用容器的形式市售；悬浮(漂浮)培养用的容器只要不经过表面处理也能够在细胞不粘附于容器的情况下对细胞进行培养或保存，则也可视为表面未处理容器。

本说明书中，细胞的“保存”是指以任意目的(例如、细胞输注疗法、或为该目的的运输)而在容器中保管一定期间(典型而言至少6小时，但不限定于此)，是指不使细胞增殖而维持细胞功能且在容器中维持。保存与以使细胞增殖为目的的“培养”不同。另外，保存并不意味着在临近给予前将细胞转移至注射器等容器；也不意思着为了在给予前进行用时制备而在容器内暂时保持。

本说明书中，“含有细胞的容器”是指含有细胞(代表地角膜内皮细胞或角膜内皮样细胞)的容器，代表性地具有本说明书中所公开的特征。

(优选的实施方式)

以下记载了优选实施方式的说明，但这些实施方式是本发明的例示，应该理解为本发明的范围不限定于这些优选的实施方式。本领域技术人员还应该理解，可以将以下这样优选的实施例作为参考而在本发明的范围内容易地进行改变、变更等。对于这些实施方式，本领域技术人员可以适宜地组合任意的实施方式。

(保存方法)

一个局面中，本发明提供保存角膜内皮细胞和/或角膜内皮样细胞的方法以及该保存方法所需要的各种技术(例如包含容器等)；所述方法包含：在具有特定底面积的容器中保存该角膜内皮细胞和/或角膜内皮样细胞的工序。

一个实施方式中，本发明的方法所使用的容器的底面积可以是至少约0.7cm

用本发明的方法进行了保存的角膜内皮细胞和角膜内皮样细胞是能够应用于细胞输注疗法等临床中的细胞。本发明的保存方法能够维持高的存活率和细胞功能，另外角膜内皮细胞和角膜内皮样细胞能够以细胞悬浮状态(包括细胞不粘附于容器的底面而能够通过轻柔的移液容易地分散的状态)、所谓的“即用”(Ready-to-use)的状态维持。因此，通过本发明的方法进行了保存的角膜内皮细胞和角膜内皮样细胞还可以不需要进一步的加工(利用药剂处理将细胞从保存容器剥离/悬浮化、利用仪器由细胞团分离特定细胞等)或培养而能够直接进行给予。因此，本发明提供不需要进一步的加工或仅需要最基本的操作就能够给予的、能够作为细胞制剂利用的细胞、容器以及收纳于容器的细胞制剂。

在特定的实施方式中，通过本发明的方法进行了保存的细胞可以不必进行以增殖和/或再分化为目的的24小时以上、18小时以上、12小时以上、优选为6小时以上(除此以外也可以是任意的时间单位)的细胞培养或静置，而直接对被检体进行给予。

因此，该局面中，本发明提供保存包含角膜内皮细胞和/或角膜内皮样细胞的细胞制剂的方法，所述方法包括：在具有特定底面积的容器中保存该包含角膜内皮细胞和/或角膜内皮样细胞的细胞制剂的工序；还提供通过该保存方法进行了保存的或者能够进行保存的细胞制剂、以及使用进行了保存的细胞制剂进行处置或预防的方法。

一些实施方式中，角膜内皮细胞和/或角膜内皮样细胞可以保存至少约1小时、至少约2小时、至少3小时、至少约4小时、至少约5小时、至少约6小时、至少约12小时、至少约18小时、至少约24小时。虽然并非意图进行限定，但本发明的保存方法意图在于，用于向不具备细胞培养中心(CPC)的医疗机构输送细胞制剂的保存；因此，保存时间可以考虑输送所花费的时间、至给予为止的等待时间等，将角膜内皮细胞和/或角膜内皮样细胞保存例如至少约3小时、至少约6小时、或根据输送距离保存其以上的时间。在特定的实施方式中，本发明的保存方法中可以保存最大约72小时、最大约96小时、最大约120小时。希望不被理论束缚，但通过本发明的保存方法保存约72小时的情况下确认到了约80％的存活率；保存约96小时的情况下确认到了约57％的存活率(数据未示出)；即便保存约120小时，也可以预测会得到至少约30％以上的存活。一些实施方式中，角膜内皮细胞和/或角膜内皮样细胞的保存可以以上述时间以细胞悬浮液的状态保存。令人惊奇的是，如实施例所示那样，能够将角膜内皮细胞和/或角膜内皮样细胞并非以粘附状态、而是以悬浮状态保存一定时间(例如约6小时)。希望不被理论束缚，但在以悬浮状态保存细胞的情况下，所保存的细胞与经粘附培养的细胞、一边形成凝集体一边培养/保存的细胞相比较，紧密连接降低了。紧密连接可以以ZO-1等为指标进行测定。在一些实施方式中，本发明的保存方法不包含使用支架(促进细胞粘附或凝集体的形成的基材等)。

一些实施方式中，保存也可以伴随着运输。本发明的保存方法能够耐受运输时的振动。运输可以为陆上运输、航空运输、其他任意的运输。

本发明的方法中所保存的细胞的细胞密度通常为约2×10

本发明的方法能够从保存开始时刻起在维持高的细胞数和高的细胞存活率的情况下保存角膜内皮细胞。例如，将保存开始时刻的全部细胞设为100％时，本发明的方法能够实现至少保存后的总细胞数为约30％以上且活细胞比(活细胞/活细胞+死细胞)为约70％以上、优选保存后的总细胞数为约50％以上且活细胞比为约80％以上、最优选保存后的总细胞数为70％以上且活细胞比为约90％以上的角膜内皮细胞。在特定的实施方式中，本发明的方法的细胞存活率(与保存开始时刻的总细胞进行比较时的活细胞数的比例)优选为约30％以上，更优选为约60％以上，进一步优选为约80％以上，最优选为约90％以上。在进一步特定的实施方式中，在上述细胞存活率的基础上，活细胞比(活细胞/活细胞+死细胞)优选为约70％以上，更优选为约80％以上，最优选为约90％以上。

底面积是指被称为容器底面的面的面积。本发明的方法也企图将注射器以横向放倒的状态进行保存，但在这样的情况下，容器的底面积是指细胞悬浮液所接触的圆筒曲面中的承受重力的面的面积。另外，除了将注射器以横向放倒的状态之外，底面的至少一部分弯曲或倾斜的情况下也是同样地，将细胞悬浮液所接触面中的承受重力的面的面积作为底面积。希望不被理论束缚，但本发明中发现，重要的是，考虑在承受重力的局部表面放置细胞所带来的影响，并且发现通过基于此限定底面积而能够改善细胞的保存。

本发明中，保存时的温度只要是细胞不冻结且不变性的温度范围，则可以为任意的温度范围，可以是例如约0℃～约50℃的范围内。这是因为无论过高还是过低，细胞存活率都会降低。只要是本领域技术人员，则能够适宜地决定保存时优选的温度。在一些实施方式中，保存时的温度可以为约0℃、约1℃、约2℃、约3℃、约4℃、约5℃、约6℃、约7℃、约8℃、约9℃、约10℃、约11℃、约12℃、约13℃、约14℃、约15℃、约16℃、约17℃、约18℃、约19℃、约20℃、约21℃、约22℃、约23℃、约24℃、约25℃、约26℃、约27℃、约28℃、约29℃、约30℃、约31℃、约32℃、约33℃、约34℃、约35℃、约36℃、约37℃、约38℃、约39℃、约40℃、约41℃、约42℃、约43℃、约44℃、约45℃、约46℃、约47℃、约48℃、约49℃或者约50℃。优选的保存时的温度范围优选为约12℃～约42℃，更优选为约17℃～约39℃，进一步优选为约27℃～约37℃。在优选的实施方式中，保存时的温度可以为室温或约37℃。最优选的实施方式中，保存时的温度可以为约37℃，但不限定于此，本领域技术人员也能够理解，在保存/运输时允许数℃左右的温度波动(例如±约1℃、±约2℃、±约3℃、±约4℃、±约5℃等)。优选的是，温度变动优选以37℃为基准且±约3℃。

角膜内皮细胞可以是来自于哺乳动物(人、小鼠、大鼠、仓鼠、兔子、猫、狗、牛、马、绵羊、猴子等)的细胞，优选来自于灵长类，特别优选来自于人。

在一些实施方式中，容器没有进行用于粘附培养的表面处理。在一些实施方式中，容器为低粘附表面容器或表面未处理容器。一些实施方式中，容器由聚苯乙烯、聚丙烯、或玻璃制成。在具体的实施方式中，作为容器，可列举出例如24孔板、管形瓶、注射器、和培养皿，但不限定于此。

本发明中提供的容器可以不产生细胞粘附的情况下进行保存，或者即便产生细胞粘附但只要不影响作为细胞制剂的标准即可，既可以是透氧性的材料，也可以不是透氧性的材料。作为透氧性的材料，可列举出例如聚乙烯以及其他透氧的任意材料。另外，也可以通过该领域中周知的方法对不透氧的材料进行加工而可透氧。

本发明中，角膜内皮细胞或角膜内皮样细胞的保存溶液可以使用该领域中可使用的公知的保存溶液，只要是适合于保存的组成则也可以是新提供的组成。作为可以使用的保存液，可列举出例如OptiMEM-I(注册商标)(Thermo Fisher Scientific)、MEM、DMEM、M199、角膜内皮细胞保存液(本说明书中所使用的保存液、Generation and FeasibilityAssessment of a New Vehicle for Cell-Based Therapy for Treating CornealEndothelial Dysfunction.Okumura N，Kakutani K，Inoue R，Matsumoto D，Shimada T，Nakahara M，Kiyanagi Y，Itoh T，Koizumi N.PLoS One.2016Jun 29；11(6)：e0158427.doi：10.1371/journal.pone.0158427.eCollection2016.PMID：27355373)等，但不限定于此。

一些实施方式中，保存时的液量为约100μl～约2000μl，优选为约100μl～约1000μl，更优选为约200μl～约800μl，最优选为约300μl～约600μl，可以根据目的而适宜变更。作为制品规格，可以是例如基准量(例如300μl)的±约5％、±约10％、±约15％、±约20％、±约25％、±约50％等。例如保存时的液量可以为至少约50μl，例如约100μl、约200μl、约300μl、约400μl、约500μl、约600μl、约700μl、约800μl、约900μl、约1ml、约2ml、约3ml、约4ml、约5ml、约6ml、约7ml、约8ml、约9ml、或约10ml。一些实施方式中，在细胞输注疗法中，在意图注入两眼的情况下，作为制品规格，可以是给予量的2倍量、3倍量、或4倍量。即使在不希望注入两眼的情况下，为了防备给予失败，作为制品规格，也可以是给予量的2倍量、3倍量、或4倍量。液量的范围可以适宜组合上述数值。一些实施方式中，角膜内皮细胞和/或角膜内皮样细胞可以以细胞悬浮液的状态保存。上述液量可为细胞悬浮液的液量。

(容器)

在另一局面中，本发明提供用于保存角膜内皮细胞或角膜内皮样细胞、具有特定底面积的容器。容器的具体特征可以采用上述、特别是(保存方法)具体记载的任意实施方式。希望不被理论束缚，但提供通过进行适合于保存角膜内皮细胞或角膜内皮样细胞的加工且具有特定底面积的容器，由此能够在本发明中提供实现了即用的细胞制剂。

(含有细胞的容器)

在另一局面中，本发明为含有细胞的容器，其包含：角膜内皮细胞或角膜内皮样细胞；和用于保存角膜内皮细胞或角膜内皮样细胞的容器；此处所使用的容器是具有特定底面积的容器。容器的具体的特征可以采用上述、特别是(保存方法)具体记载的任意实施方式。

一些实施方式中，本发明的容器内可以含有Rho激酶(ROCK)抑制剂。此处所使用的ROCK抑制剂可以是本说明书中记载的任意的实施方式。

(角膜内皮细胞)

在另一方式中，本发明提供通过上述方法保存的角膜内皮细胞或角膜内皮样细胞。一些实施方式中，本发明的角膜内皮细胞或角膜内皮样细胞可用于处置或预防被检体的角膜内皮的障碍、疾病或症状。

在进一步的方式中，本发明提供用于处置或预防角膜内皮的障碍、疾病或症状的组合物，其包含通过上述方法进行了保存的角膜内皮细胞或角膜内皮样细胞。

一些实施方式中，角膜内皮的障碍、疾病或症状选自由福氏角膜内皮营养不良、角膜移植后障碍、角膜内皮炎、外伤、眼科手术、眼科激光手术后的障碍、老化、后部多形性营养不良(PPD)、先天性遗传性角膜内皮营养不良(CHED)、特发性角膜内皮障碍、和巨细胞病毒角膜内皮炎组成的组。

在一些实施方式中，本发明的组合物可以包含Rho激酶(ROCK)抑制剂，也可以与ROCK抑制剂组合给予。本发明的角膜内皮细胞或角膜内皮样细胞还可以与ROCK抑制剂组合给予。作为ROCK抑制剂，可列举出下述文献：美国专利4678783号、日本专利第3421217号、国际公开第95/28387、国际公开99/20620、国际公开99/61403、国际公开02/076976、国际公开02/076977、国际公开第2002/083175、国际公开02/100833、国际公开03/059913、国际公开03/062227、国际公开2004/009555、国际公开2004/022541、国际公开2004/108724、国际公开2005/003101、国际公开2005/039564、国际公开2005/034866、国际公开2005/037197、国际公开2005/037198、国际公开2005/035501、国际公开2005/035503、国际公开2005/035506、国际公开2005/080394、国际公开2005/103050、国际公开2006/057270、国际公开2007/026664等中公开的化合物。所述化合物可以通过各发明的文献所述的方法来制造。作为具体例，可列举出1-(5-异喹啉基磺酰基)高哌嗪或其盐(例如，法舒地尔(1-(5-异喹啉基磺酰基)高哌嗪))、(+)-顺式-4-(1-氨基乙基)-1-(4-吡啶基氨基甲酰基)环己烷((R)-(+)-顺式-(4-吡啶基)-4-(1-氨基乙基)-环己烷羧酰胺)或其盐(例如，Y-27632((R)-(+)-顺式-(4-吡啶基)-4-(1-氨基乙基)-环己烷羧酰胺二盐酸盐一水合物)等)等，这些化合物也可优选使用市售品(Wako Pure Chemical Industries,Ltd.、Asahi Kasei PharmaCorporation等)。

在一些实施方式中，作为可以使用的ROCK抑制剂，可列举出Y-27632((+)-反式-4-(1-氨基乙基)-1-(4-吡啶基氨基甲酰基)环己烷)、利舒地尔(Ripasudil)(4-氟-5-{[(2S)-2-甲基-1，4-地西泮-1-基]磺酰基}异喹啉)、法舒地尔(1-(5-异喹啉基磺酰基)高哌嗪)、和其药学上允许的盐，但不限定于此，也可以使用例如US4678783、日本专利3421217、WO99/20620、WO99/61403、WO02/076976、WO02/076977、WO02/100833、WO03/059913、WO03/062227、WO2004/009555、WO2004/022541、WO2004/108724、WO2005/003101、WO2005/039564、WO2005/034866、WO2005/037197、WO2005/037198、WO2005/035501、WO2005/035503、WO2005/035506、WO2005/080394、WO2005/103050、WO2006/057270、WO2007/026664等中公开的化合物(不限定于此)等其他ROCK抑制剂。

(细胞制剂)

在进一步的局面中，本发明提供包含角膜内皮细胞和/或角膜内皮样细胞、以及容器的细胞制剂。提供一种细胞制剂，该细胞制剂所使用的容器适合于保存该角膜内皮细胞和/或角膜内皮样细胞，该容器的底面积为至少约0.7cm

(治疗方法)

在进一步的方式中，本发明提供处置或预防被检体的角膜内皮的障碍、疾病或症状的方法，其包含如下工序：对该被检体给予通过本发明的方法进行了保存的角膜内皮细胞或角膜内皮样细胞。

所给予的细胞数过少时治疗效果降低，因此可以为至少约4万个。角膜内皮的障碍、疾病或症状为局部性的情况下，也可以为比通常少的个数，例如至少4万个、至少约10万个、优选为至少约20万个。一些实施方式中，所给予的细胞数可以为约4万个～约400万个，优选为约10万个～约200万个，更优选为约20万个～约140万个，最优选为约40万个～约100万个。

所给予的液量可以考虑合适的粘度、对所给予部位(例如、前房内)能给予的允许量等而适宜设定。在一些实施方式中，可以给予约20μL～约500μL、优选为约30μL～约400μL、更优选为约50μL～约400μL、最优选为约200μL～约300μL的液量(细胞悬浮液)。

(应用)

在进一步的方式中，本发明提供通过本发明的方法进行了保存的角膜内皮细胞或角膜内皮样细胞在制造用于处置或预防被检体的角膜内皮的障碍、疾病或症状的药物中的应用。

以上，示出用于容易理解而优选的实施方式来对本发明进行说明。以下基于实施例来对本发明进行说明，上述的说明及以下的实施例仅以例示的目的而提供，并非以限定本发明的目的而提供。因此，本发明的范围并非限定于本说明书中具体记载的实施方式、实施例，而仅限定于权利要求书的范围。

实施例

以下基于实施例对本发明进行更具体的说明。可以理解，本实施例中所使用的各种试剂除了具体例示的试剂之外，还可以使用从Sigma-Aldrich,BASF Japan Ltd.等买到的试剂。基于赫尔辛基宣言的伦理规范对人体组织进行处理。人供体角膜由SightLife

(实施例1：细胞保存中的容器的材质和尺寸的筛选)

(材料和方法)

(角膜内皮细胞的培养)

由罹患疾病的40岁以上的供体得到5个人供体角膜。所有的角膜在使用前在4℃下在Optisol(ChironVision、Irvine、CA)中保存14天以内的时间。人角膜内皮细胞(HCEC)如以下来进行培养。简而言之，将包含角膜内皮的德斯梅膜由供体角膜机械地剥离，在37℃下在1mg/mL的胶原酶A(Roche Applied Science、Penzberg、Germany)中孵育12小时，从而进行消化。将HCEC用OptiMEM-I(Life Technologies Corp.、Carlsbad、CA)进行清洗之后，接种于用层粘连蛋白E8片段(iMatrix-511；Nippi,Incorporated、东京)涂覆的48孔板的一个孔中。

培养基如下进行制备。简而言之，将补充了8％肽牛血清(FBS)、5ng/mL上皮生长因子(EGF；Thermo Fisher Scientific)、20μg/mL抗坏血酸(Sigma-Aldrich、St.Louis、MO)、200mg/L氯化钙、0.08％硫酸软骨素(Sigma-Aldrich)、和50μg/mL庆大霉素(Thermo FisherScientific)的OptiMEM-I与NIH-3T3一起进行24小时驯化。之后回收驯化的培养基，通过0.22μm的过滤单元(EMD Millipore Corporation、Billerica、MA)进行过滤，作为HCEC的培养基而使用。

在包含5％CO

用不包含Ca

[表1]

对HCEC进行72小时保存后，从细胞培养平板、试管、或管形瓶中缓慢地通过移液进行回收，在280G下进行3分钟离心分离，以1.0×10

(结果)

(细胞悬浮形态保存条件对于细胞存活率的影响)

将HCEC在CTV中以细胞悬浮形态、以1.0×10

对于在24孔板(超低粘附)中以细胞悬浮的形态保存的HCECK，在于37℃保存72小时后，接种于培养平板上。代表的相位差图像表明，经过保存的HCEC与对照同样地在接种3小时后，没有伴随着明显的细胞死亡而附着于培养平板上。2周后，经过保存的HCEC形成了与对照同样的多边形状的单层片样结构(图2E)。

(实施例2：对兔子角膜内皮代偿失调模型注入RCEC)

(材料和方法)

(兔子CEC培养)

本实施例中，使用由Funakoshi Co.,Ltd.(东京)购入的兔子眼10个。对兔子CEC(RCEC)如上所述进行培养。简而言之，将包含RCEC的剥离德斯梅膜在37℃下在0.6U/mLAccutase(NACALAI TESQUE,INC.、京都)中孵育15分钟，将回收的RCEC接种于用FNCCoating Mix(注册商标)(Athena Environmental Sciences，Inc.、Baltimore、MD)进行了涂覆的培养平板。将RCEC在补充了10％肽牛血清(FBS)、50U/mL青霉素、50μg/mL链霉素、和2ng/mL成纤维细胞生长因子2(Life Technologies Corp.)的杜尔贝科改良伊格尔培养基(Dulbecco’smodifiedEagle’smedium)(Life Technologies Corp.、Carlsbad，CA)中进行培养。使用了从1代起进行了3次传代培养的培养RCEC。

(对兔子角膜内皮代偿失调模型注入RCEC)

将12只日本白色种兔(JapaneseWhiteRabit)的右眼应用于试验，左眼为了避免失明而没有使用。兔子角膜内皮代偿失调模型如上所述而制作。简而言之，为了使前房深度加深而在一周前去除晶状体，使用20G硅胶针(Soft Tapered Needle、Inami&Co.,Ltd.、东京)机械地去除角膜内皮。用0.1％台盼蓝染色液将德斯梅膜染色来确认角膜内皮完全地从德斯梅膜剥离。

将培养RCEC用PBS进行清洗，在37℃下用0.05％Trypsin-EDTA(LifeTechnologies)进行5分钟胰蛋白酶消化，之后用培养基进行中和。对RCEC进行三次清洗，在24孔板(超低粘附)中以1.0×10

利用裂隙灯试验对于眼的前房部进行14天的评价。用Pentacam(注册商标)(OCULUS Optikgerate GmbH，Wetzlar，德国)取得沙姆图像，角膜的7mm直径的体积也使用沙姆图像进行测定。使用超声波测厚仪(SP-2000；Tomey、名古屋)測定角膜的中央厚度。角膜厚度由于重度的浮肿而不能测定，因此视为仪器的最大读取值1200μm。

(免疫荧光和肌动蛋白染色)

采集兔子角膜，在室温下用4％甲醛固定化10分钟。将待检体在37℃下、与1％牛血清白蛋白一起孵育45分钟，与针对Na

(统计分析)

多个样品组的比较中的、统计学上的显著性(p值)通过克鲁斯卡尔-沃利斯检验(Kruskal-Wallistest)进行计算。结果用平均值±标准偏差的形式表示。将小于0.05的p值作为统计学的显著值。

(结果)

(保存RCEC用于兔子模型的细胞疗法的实施可能性)

采集培养RCEC，在37℃下在24孔板(超低粘附)中以细胞培养形态保存24小时、48小时、或72小时。在向兔子模型注入前，向RCEC中追加Y-27632，注入兔子角膜内皮代偿失调模型的前房。在裂隙灯试验中，在保存24小时、48小时或72小时后注入RCEC的眼中，角膜均在7天以内呈现出透明性(图3A)。对照眼中，由于角膜内皮代偿失调，角膜全部为不透明的。在沙姆图像中，通过注入保存了24小时、48小时和72小时的RCEC，显示出解剖学上正常的角膜成功地在里面再生，对照眼中呈现重度的角膜浮肿(图3B)。

以Pentacam(商标)取得的角膜厚度的彩色图像显示，保存了24小时和48小时的RCEC在其注入的14天后，由角膜的中心至外周部再生出正常的角膜厚度。另一方面，注入了保存了72小时的RCEC的眼在裂隙灯试验的观察中，角膜是透明的但厚度增加了(图3A和4A)。超声波测厚仪显示，在注入了保存24小时和48小时的RCEC的眼中，10天后中心的角膜厚度为约400μm(正常范围)。但是，注入了保存72小时的RCEC的眼中，与注入了保存24小时或48小时的RCEC的眼相比中心角膜厚度的减少变少、且整个14天中显著地高(p＜0.01)(图4B)。与中心的角膜厚度同样地，相比于注入了保存72小时的RCEC的眼，注入了保存24小时或48小时的RCEC的眼中，通过沙姆(Scheimpflug)图像确定的角膜体积小(图4C)。关于利用肌动蛋白和DAPI评价的再生角膜内皮的细胞密度，在注入了保存24小时的RCEC的眼中是2465个/mm

免疫荧光染色证实了，在注入了保存24小时、48小时和72小时的RCEC的眼中的、所有再生CEC的侧膜中，均表达功能相关标记物Na

(实施例3：使用了1ml注射器的角膜内皮细胞的保存)

(材料和方法)

将HCEC在CTV中以细胞悬浮形态、以1.0×10

(底面积的计算)

在各实验中，液量恒定为300μl，通过调节活塞的位置来调节底面积。使用的1ml注射器的内径为6mm。在从注射器的前端起10mm的位置配置活塞的前端(橡胶的部分)且将注射器横向放倒的情况下，按照本说明书的定义，底面积为(6×3.14÷2)×10＝94.2mm

在从注射器的前端起20mm的位置配置活塞的前端(橡胶的部分)且将注射器横向放倒的情况下，按照本说明书的定义，底面积为(6×3.14÷2)×20＝188.4mm

在从注射器的前端起20mm的位置配置活塞的前端(橡胶的部分)且将注射器纵向放置的情况下，底面积为6×6×3.14≒28mm

(结果)

将在1ml注射器中培养的角膜内皮细胞50万个悬浮于300μl的细胞保存液，进行保存(图5)。在注射器中将角膜内皮细胞保存72小时之后，观察到了细胞沉淀在注射器的侧面(图5下左)。轻敲之后，细胞从注射器的侧面浮起，表示细胞在保存中没有粘附在注射器内面(图5下中)。在保存72小时后，进行轻敲，将注射器用细胞保存液轻柔地清洗之后，没有确认到细胞粘附在注射器的侧面(图5下右)。

相对于在将保存开始时刻的全部细胞设为100％时(活细胞率：90.3％、死细胞率：9.7％)，在注射器内保存72小时后的存活细胞率变为活细胞率：70.9％、死细胞率：8.2％，约90％的细胞存活，与保存开始时刻是同等的(图6)。另一方面，在注射器内保存细胞时，加入空气而将注射器横向设置时，将注射器内的底面积设为约2cm

(实施例4：细胞保存中的最适温度的详细的研究)

(材料和方法)

(角膜内皮细胞的培养)

由罹患疾病的40岁以上的供体得到5个人供体角膜。所有的角膜在使用前在4℃下在Optisol(Chiron Vision、Irvine、CA)中保存14天以内的时间。人角膜内皮细胞(HCEC)如以下来进行培养。简而言之，将包含角膜内皮的德斯梅膜由供体角膜机械地剥离，在37℃下、1mg/mL的胶原蛋白酶A(Roche AppliedS cience、Penzberg、Germany)中孵育12小时，从而进行消化。将HCEC用OptiMEM-I(Life Technologies Corp.、Carlsbad、CA)进行清洗之后，接种于用层粘连蛋白E8片段(iMatrix-511；Nippi,Incorporated、东京)涂覆的48孔板的一个孔中。

培养基如下进行制备。简而言之，将补充了8％肽牛血清(FBS)、5ng/mL上皮生长因子(EGF；Thermo Fisher Scientific)、20μg/mL抗坏血酸(Sigma-Aldrich、St.Louis、MO)、200mg/L氯化钙、0.08％硫酸软骨素(Sigma-Aldrich)、和50μg/mL庆大霉素(Thermo FisherScientific)的OptiMEM-I与NIH-3T3一起进行24小时驯化。之后回收驯化的培养基，通过0.22μm的过滤单元(EMD Millipore Corporation、Billerica、MA)进行过滤，作为HCEC的培养基而使用。

在包含5％CO

对HCEC用不包含Ca

对HCEC进行72小时保存后，从细胞培养平板缓慢地通过移液进行回收，在280G下进行3分钟离心分离，以1.0×10

(结果)

(细胞悬浮形态保存中的温度条件对于细胞存活率的影响)

将HCEC在CTV中以细胞悬浮形态、1.0×10

在9个温度条件下，37℃下保存时活细胞率最高，相对于在将保存开始时刻的全部细胞设为100％时，活细胞率：92.4％、死细胞率：7.6％，保存72小时后的存活细胞率变为活细胞率：95.4％、死细胞率：4.9％，显示出与保存开始时刻同等的细胞存活率。另外，在低于37℃的温度条件下，与温度降低成比例地，活细胞率也降低，在12℃、17℃、22℃的保存中，与保存开始时刻的活细胞率相比较，显示出显著低的活细胞率，但维持了30％以上的存活率。在39℃、42℃的条件下也是，与温度上升成比例地活细胞率降低，与保存开始时刻的活细胞率相比较，显示出显著低的活细胞率，但维持了30％以上的存活率。这样，优选在能够维持30％以上存活率的12℃～42℃的范围进行保存，更优选在能够维持60％以上存活率的17℃～39℃下进行保存，进而优选在能够维持80％以上存活率的27℃～37℃下进行保存；最优选在能够维持与对照同等的90％以上存活率的37℃下进行保存。

(实施例5：使用了玻璃制管形瓶的细胞保存的研究)

(材料和方法)

将HCEC在CTV中以细胞悬浮形态、以1.0×10

保存72小时后，从管形瓶中缓慢地通过移液进行回收，在280G下进行3分钟离心分离，以1.0×10

(结果)

将HCEC在CTV中以细胞悬浮形态、1.0×10

在管形瓶(Maruemu Corporation.、大阪、0501-02)中，可见细胞对管形瓶的粘附。另一方面，在管形瓶(Iwata Glass Industrial Co.,Ltd.、大阪、181024)、管形瓶(IwataGlass Industrial Co.,Ltd.、大阪、181102)中，细胞不会粘附在管形瓶而能够通过平缓移液进行回收。在将保存开始时刻的全部细胞设为100％时，对照中活细胞率：92.4％、死细胞率：7.6％，与此相对，保存在管形瓶(Maruemu Corporation.、大阪、0501-02)中的细胞变为活细胞率：38.9％、死细胞率：7.4％，与保存开始时刻的活细胞数相比显示出显著低的活细胞数。保存在管形瓶(Iwata Glass Industrial Co.,Ltd.、大阪、181024)的细胞为活细胞率：90.7％、死细胞率：7.8％；保存在管形瓶(Iwata Glass Industrial Co.,Ltd.、大阪、181102)的细胞为活细胞率：84.6％、死细胞率：8.4％，显示出与保存开始时刻同等的细胞存活率。这样，所有的玻璃制管形瓶均显示出30％的细胞存活率，但进行了低粘附的表面处理者显示出更高的细胞存活率。

(实施例6：含有细胞的制品的制造例和运输例)

对于由供体角膜培养的角膜内皮细胞、或者由iPS细胞、ES细胞、神经嵴细胞等分化的角膜内皮细胞、或者具有与角膜内皮细胞同样功能的细胞，通过酶处理而从培养皿进行回收。将回收的细胞以相对于300μl的细胞注入用溶液为例如约50万个～约100万个的比例进行悬浮，将约500μl～约800μl的细胞悬浮液保存在管形瓶(Iwata Glass IndustrialCo.,Ltd.、大阪、lot：181024)或管形瓶(Iwata Glass Industrial Co.,Ltd.、大阪、lot：181102)。管形瓶用橡胶栓和铝进行密闭(一次容器)。管形瓶进一步被收纳于可确保密封性、防漏性的二次容器中。二次容器用维持在37℃的孵育器进行保存。将二次容器收纳于吸收外部冲击的外装容器，以维持在37℃的状态下运输至医疗机构。

如以上，通过使用本发明优选的实施方式例示了本发明，但可以理解的是应仅通过权利要求书的范围来解释本发明的范围。本说明书中所引用的专利、专利申请和文献其内容自身与具体地记载于本说明书的同样地，应该理解为该内容作为参考援引至本说明书中。本申请要求了在2018年10月2日申请的日本国专利申请第2018-187754号和2018年12月28日申请的2018-247970号的优先权的利益，其内容根据参照而组入本说明书中。

提供角膜内皮细胞的保存方法。通过本发明，能够以高的细胞存活率保存角膜内皮细胞。如此进行了保存的角膜内皮细胞具有正常的角膜内皮细胞的功能，另外，能够作为角膜内皮疾病等的治疗用细胞而使用，因此能够用于制药等领域。