导航：首页> 一般的物理或化学的方法或装置>可降解丝素蛋白和随需释放功能因子的表达系统及其应用

可降解丝素蛋白和随需释放功能因子的表达系统及其应用

文献发布时间：2023-06-19 11:34:14

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及可降解丝素蛋白和随需释放功能因子的表达系统，还涉及该表达系统的应用。

背景技术

蚕丝(silk fibroin，SF)作为一种来源于家蚕(Bombyx mori)的天然高分子材料，以其优异的性能而闻名，并因其作为可应用于组织工程的生物材料而受到人们的关注。然而天然蚕丝材料尚不能满足组织工程生物材料某些特定的需求，例如天然丝材料缺乏相关生长因子，普通蚕丝支架具有在生物活性体内极难降解的特点等。迄今为止，不同的偶联方案已被用于赋予多孔3D海绵、膜、微粒和电纺丝垫等丝素创制材料新功能和能够释放出生长因子，但是丝素材料的偶联多采用非共价偶联的策略，这种结合方式在生物材料使用的最初几天易引起发生“突释”现象。因此，如何能够在赋予蚕丝生物材料新功能情况下并能够控制功能蛋白或因子的释放成为这类蚕丝材料应用研究的热点和难点。

虽然通过直接添食、化学改性、中尺度组装和大尺度混合等改性方法，能够实现赋予蚕丝材料新的所需功能，但是这些策略需要每次使用时对材料进行复杂的改性实验而且很难保证获得的每批材料的改性一致性。家蚕种系转化(germline transformation)作为一种可赋予丝素新功能的策略而受到了广泛的关注。家蚕种系转化方法通过将外源基因插入家蚕基因组可获得能吐出具有新功能蚕丝的转基因家蚕个体，而且这种经外源基因插入而获得的特性可以在转基因家蚕个体稳定维持并遗传给后代。因此，通过转基因家蚕特异在丝腺表达功能蛋白能够赋予蚕丝新功能并能稳定遗传给后代，这个方法有望能有效克服其他改性方法的缺点。

最近，人们特别重视智能药物传递系统，该系统响应组织环境信号并根据细胞需求释放生长因子，即所谓的“随需释放”。随需释放可以通过在传递系统中引入刺激响应组件来设计。最常用的触发机制涉及利用酶来裂解固定生长因子的连接物(linker)，从而导致封装生长因子的释放。基质金属蛋白酶2(Matrix metalloproteinases-2,MMP-2)是在再生过程中广泛存在的一种重要酶。如果在生长因子两端添加MMP-2可酶解的linkers，在再生微环境中广泛存在的MMP-2酶作用下，有望实现在细胞因子控制释放或随需释放。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的之一在于提供一种可降解丝素蛋白和随需释放功能因子的表达系统；本发明的目的之二在于提供MMP-2酶调控释放骨生长因子蚕丝材料的制备方法；本发明的目的之三在于提供由所述方法制得的MMP-2酶调控释放骨生长因子蚕丝材料；本发明的目的之四在于提供所述转基因蚕丝在制备MMP-2酶诱导释放功能因子的蚕丝支架中的应用。

为达到上述目的，本发明提供如下技术方案：

1、可降解丝素蛋白和随需释放功能因子的表达系统，所述表达系统由以下通式表示：linker-X-linker；

其中X表示功能因子编码区；linker表示MMP-2可酶解多肽的编码序列。

本发明优选的，所述MMP linker可酶解多肽的编码序列为VLGL、PLNL、PANL、PLGL、VANL和PAGL中的任一种。

本发明优选的，所述表达系统的两端分别与家蚕丝心蛋白重链启动子Fib-H P3和轻链结合位点LBS连接形成表达框。所述Fib-H P3由重链5’上游序列、外显子1、内含子和外显子2的5’端序列组成；所述轻链结合位点LBS由包含Cys-c20(C-端的倒数第20个氨基酸)的丝心蛋白重链基因的3’端和包含多聚腺嘌呤化信号序列的3’端下游序列组成。

本发明优选的，所述表达系统由linker-X-linker替换pBac[3xP3-DsRed]-R3中EGFP片段而得。

本发明优选的，所述X为人骨形态发生蛋白BMP-2基因序列或经密码子优化的人骨形态发生蛋白BMP-2基因序列。

2、利用所述的表达系统制备的转基因蚕丝。

3、所述转基因蚕丝的制备方法，包括如下步骤：利用胚胎显微注射方式将含有所述表达系统的转基因载体导入蚕卵，筛选转基因家蚕，转基因家蚕结茧获得转基因蚕丝。

4、所述转基因蚕丝在制备MMP-2酶诱导释放功能因子的蚕丝支架中的应用。

5、所述转基因蚕丝在制备MMP-2酶诱导丝素蛋白降解的蚕丝支架中的应用。

6、MMP-2酶调控释放骨生长因子蚕丝材料的制备方法，将经密码子优化的人骨形态发生蛋白BMP-2基因序列两端连接编码MMP-2可酶解多肽的编码序列，然后由家蚕丝心蛋白重链启动子Fib-H P3调控在家蚕中表达，作为丝纤维的外源成分随丝蛋白一起分泌至蚕茧，得到蚕丝材料；所述密码子优化的人骨形态发生蛋白BMP-2基因序列如SEQ ID NO.1所示；所述MMP linker可酶解多肽的编码序列为VLGL、PLGL和PAGL中的任一种。

本发明的有益效果在于：本发明公开了可降解丝素蛋白和随需释放功能因子的表达系统，该系统通过响应MMP-2酶释放功能因子，同时降解丝素蛋白。该系统用于制备新型丝素材料，制得的丝素材料能够在巨噬细胞分泌的基质金属蛋白酶作用下发生降解，而且可以持续释放功能因子，如：BMP-2生长因子，同时也为控制蚕丝支架在再生工程中的降解提供了一种新的策略。

附图说明

为了使本发明的目的、技术方案和有益效果更加清楚，本发明提供如下附图进行说明：

图1为B1、B2和B3结构示意图。

图2为3个融合基因结构图(A：丝素蛋白重链表达系统R3的结构图；B：转基因载体结构图)。

图3为转基因载体结构图。

图4为转基因家蚕的制备过程图(A：胚胎显微注射；B：荧光显微镜筛选转基因后代个体；C：PCR分析转基因家蚕基因组整合情况)。

图5为野生型和G1转基因蚕茧总蛋白分析(A：SDS-PAGE检测；B：hBMP-2抗体免疫印迹法进行检测)。

图6为丝素材料加工过程对外源BMP-2蛋白含量的影响(A：丝素材料；B：丝素加工材料；C：Western blot检测外源BMP-2蛋白；D：外源BMP-2蛋白统计结果)。

图7为丝素切片植入家兔皮下结果(A：丝素切片；B:H&E染色结果；C：明胶酶谱法检测炎症细胞中MMP-2酶的存在；D：MMP-2酶含量及活性结果)

图8为灭菌丝素切片分别置于不含或含有炎症性巨噬细胞M1的培养基中共培养4周监测丝素在培养基中的降解情况(A：含有炎症性巨噬细胞M1中丝素降解率；B：不含炎症性巨噬细胞M1中丝素降解率；C：丝素切片结果)。

图9为MMP-2linker的裂解原理图。

图10为巨噬细胞分泌的MMP-2酶能够识别并裂解linkers(A：丝素溶液制备过程；B:MMP-2裂解释放BMP-2结果)。

图11为BMP-2的释放速率与插入的MMP-2linker肽的催化活性(A：BMP-2的释放速率；B：Western blot检测结果)。

图12为茧片共培养MSC(间充质干细胞)中的DNA含量结果。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明，以使本领域的技术人员可以更好的理解本发明并能予以实施，但所举实施例不作为对本发明的限定。

实施例1、优化人骨形态发生蛋白BMP-2基因

根据家蚕基因组表达基因密码子偏好性对人骨形态发生蛋白BMP-2基因序列进行优化获得hBMP-2，并在上游涉及XbaⅠ酶切位点，下游设计BamHⅠ酶切位点，共有1132bp，设计的具体序列如SEQ ID NO.1所示：

ctctagactggtgccagaactgggtagaagaaagttcgctgctgcttcatcaggtagaccttcatcacaaccttcagacgaagtgctgagcgaattcgaactgagactgttgagcatgttcggactgaaacagagaccgacaccttcaagagacgctgttgttcctccttacatgctggacctgtacagaagacactcaggtcaaccaggttcaccagctccagatcatagactggaaagagcagctagcagagctaacacagtgagaagcttccaccacgaagagtcactggaagaactgccagaaaccagcggtaaaaccacaagacgcttcttcttcaacctgagcagcatccctaccgaagaattcatcacctcagccgaactgcaagtgttcagagaacagatgcaggacgctttgggtaacaacagctcattccaccaccgcatcaacatctacgagatcatcaagccggctacagctaactcaaagttcccagtgacaagactgctggacacaagactggtgaaccaaaacgctagccgttgggaatcattcgacgtgacaccagcagttatgcgttggacagctcaaggtcacgctaatcacggtttcgttgtggaagtggctcacttagaagaaaagcagggagtgagcaagagacacgtgagaatcagcagaagcttgcaccaagacgaacactcttggagccaaatcagacctctgctggttacattcggtcacgacggtaaaggtcaccctctgcacaaaagagaaaagcgccaagctaagcacaagcagagaaaacgcctgaagagctcttgcaaaagacaccctctgtacgtggatttctcagacgtgggttggaacgattggattgttgctcctccaggttaccacgctttctattgtcacggcgagtgtcctttcccattggctgatcacttgaacagcacaaaccacgctatcgtgcaaacactggtgaacagcgtgaacagcaagatccctaaagcttgttgcgtgcctaccgaactgtcagctatcagcatgctgtacctggacgaaaacgaaaaggtggtgctgaagaactaccaggacatggtcgttgaaggttgcggttgtagaggatcc

合成hBMP-2序列，备用。

实施例2、基质金属蛋白酶-2酶切linkers的选择和载体构建

选择MMP-2酶解活性高(-PAGL-，100％)、中(-PLGL-，54.9％)、低(-VLGL-，13％)三种不同的linkers.在hBMP-2基因的两端均成功连接了编码MMP-2linker的核苷酸序列，共获得产生3种不同linker-hBMP-2-linker的靶基因序列，分别命名为B1、B2和B3(核苷酸序列分别如SEQ ID NO.2第10～1176位所示、SEQ ID NO.3第10～1176位所示和SEQ ID NO.4第10～1176位所示)，结构如图1所示。本发明实施例中也可以根据目的蛋白所需要释放的量选择其他linkers，如-PLNL-，15.7％；-PANL-，43.1％和-VANL-，64.6％。

为了保证融合蛋白高量表达，选择了Fib-H的完整的N端和C端作为3种不同linker-hBMP-2-linker结构的两端。具体是使用丝素蛋白重链表达系统R3(Zhao A,ZhaoT,Zhang Y,Xia Q,Lu C,Zhou Z,Xiang Z,Nakagaki M.New and highly efficientexpression systems for expressing selectively foreign protein in the silkglands of transgenic silkworm.Transgenic Research,2010,19(1):29-44.)，分别用B1、B2和B3基因替换R3系统中的EGFP片段，成功构建了3个融合基因heavy-chain-B1、heavy-chain-B2和heavy-chain-B3(图2)，这3个融合基因包含2304-bp的Fib-H P3序列(含有重链5’上游序列、外显子1、内含子和外显子2的5’端序列)、1206-bp的B1、B2或B3序列以及333-bp的LBS序列(含有重链外显子2的3’端序列和poly-A序列)。随后将上述融合基因分别克隆至piggyBac转座载体中，得到pBac[3xP3-DsRed]-B1、pBac[3xP3-DsRed]-B2和pBac[3xP3-DsRed]-B3转基因载体(图3)。DNA测序结果显示3个转基因载体构建正确。

实施例3、转基因家蚕的制备

利用胚胎显微注射的家蚕种系转化技术平台，将3个重组piggyBac转基因载体导入蚕卵(图4，A)，并利用带有DsRed滤光片的荧光体视显微镜筛选在眼睛中表达DsRed荧光的转基因后代个体(表1)。筛选结果显示，注射pBac[3xP3-DsRed]-B1、pBac[3xP3-DsRed]-B2和pBac[3xP3-DsRed]-B3的G1代蛾区中含有DsRed荧光表达的蛾区阳性率分别为13.4％、19％和6.3％(图4，B)。提取DsRed阳性蚕蛾的基因组DNA，经PCR分析结果证实了转基因在家蚕基因组中的整合(图4，C)。随后分别提取野生型和G1转基因蚕茧总蛋白，经SDS-PAGE和hBMP-2抗体免疫印迹法进行检测，结果在3种不同转基因蚕茧总蛋白中均分别检测到了单一的杂交信号，而野生型蚕茧总蛋白中检测到任何杂交信号条带，从而证实BMP-2在3种转基因蚕茧中均有表达。

表1、转基因注射筛选结果

分别提取野生型和G1转基因蚕茧总蛋白，经SDS-PAGE和hBMP-2抗体免疫印迹法进行检测，结果如图5所示。结果显示，在3种不同转基因蚕茧总蛋白中均分别检测到了单一的杂交信号，而野生型蚕茧总蛋白中没有检测到任何杂交信号条带，从而证实BMP-2在3种转基因蚕茧中均有表达。

对不同转基因蚕丝的BMP-2含量进行分析，分析结果如表2所示。结果显示转基因蚕茧中表达的3种不同类型BMP-2蛋白B1、B2和B3的含量分别为7.2％、10.05％和5.87％。上述研究结果表明，heavy-chain-B1、heavy-chain-B2和heavy-chain-B3融合蛋白与丝素一起成功分泌至后部丝腺腔，并作为丝纤维的外源成分随丝蛋白一起分泌至蚕茧。

表2、不同转基因品系蚕丝的BMP-2含量

实施例4、丝素材料的制备与降解

将经蚕茧脱胶处理后制成的丝素切片和利用丝素溶液经再生制备的水凝胶、膜和冻干粉不同形态的材料用LISCN溶液再溶解并经Western blotting分析，结果如图6所示。结果表明利用丝素溶液制作水凝胶、膜和冻干粉的再生过程中，材料中的hBMP-2含量与初始含量相比分别降低了40％、52％和60％；而丝素切片中BMP-2的剩余含量(80％)仍足以用于后续实验。因此，后续采用丝素切片进行后续实验。

将丝素切片植入家兔皮下，H&E染色结果显示植入后4周内出现细胞浸润现象，并判断观察到的细胞可能是炎症细胞。因此，使用明胶酶谱法检测了炎症细胞(包括单核细胞、未极化和极化的巨噬细胞M1)中MMP-2酶的存在和活性，结果如图7所示。结果表明，单核细胞和巨噬细胞分泌的MMP-2酶均呈时间依赖性。测定获得了表观分子量分别为62-kDa和72-kDa的2种条带，其中72-kDa条带为前体形式的MMP-2酶，62-kDa条带为活性形式的MMP-2酶。单核细胞THP1和未极化的巨噬细胞仅分泌前体MMP-2酶。巨噬细胞极化后第5天检测到少量的活性MMP-2酶，而第7天在巨噬细胞M1的条件培养基中检测到大量的活性MMP-2酶。调控骨愈合不同阶段的不同类型细胞主要包括巨噬细胞、成骨细胞和破骨细胞。研究结果表明，巨噬细胞M1是丝材料植入后的第一个应答者，可以作为MMP-2酶的廉价来源和MMP介导降解研究的体外模型。

将无菌丝素切片分别置于不含或含有炎症性巨噬细胞M1的培养基中共培养4周。通过测量丝素切片的质量变化来监测丝素在培养基中的降解情况，并利用扫描电镜观察丝素切片的形态变化，结果如图8所示。结果显示，将丝素切片与巨噬细胞M1共培养至M1开始分泌MMP-2后的前3天，各组丝素切片降解率无明显差异，推测可能原因是MMP-2酶仍处于前体状态。而将丝素切片与M1共培养7天后，培养基中MMP-2酶的数量和活性已经能够导致不同处理组丝素切片的降解速率发生差异。共培养28天后，与具有中等催化活性(B2，23.40％)和低催化活性(B3，11.93％)的丝素切片相比，具有高催化活性的丝素切片质量损失较大(B1，38.07％)。而在无细胞培养基中，丝素切片的干重降低幅度极小甚至为0，从而证实了丝素切片的降解可能是由巨噬细胞分泌的MMP-2酶所介导。扫描电镜形态分析表明，MMP-2linker的加入在一定程度上促进了丝素重链的降解。野生型丝素切片仍保持原有结构，而转基因TSL-B1、TSL-B2、TSL-B3切片表面均出现颗粒碎片。

实施例5、BMP-2的释放速率与插入的MMP-2linker肽的催化活性具有相似趋势

对靶蛋白B1、B2和B3的设计可知，嵌入的BMP-2生长因子需要MMP-2linker的裂解才能获得释放(图9)。建立了由巨噬细胞作为MMP-2酶来源的MMP-2酶触发的体外释放系统。本实施例优先使用可溶性水溶液来验证分别含有PAGL、PLGL和VLGL的linker在MMP-2酶作用后的裂解以BMP-2蛋白的释放情况。巨噬细胞条件培养基MMP-2酶来源，将其与丝素溶液混合以发生反应。反应结束后，将反应后各组分用12％聚丙烯酰胺凝胶分离并回收。通过Western blotting以BMP-2抗体验证各组分蛋白的分子量变化，结果表明在酶反应之后，外源蛋白对应条带分子量与反应前相比降低。该实验结果证实活性MMP-2酶能够识别并裂解linker，而BMP-2蛋白也在linker断裂后从剩余的丝素序列中分离出来。而在无细胞培养基中，BMP-2融合蛋白的分子量并没有下降，这说明活性MMP-2酶的存在是触发BMP-2生长因子释放的必要条件(图10)。

巨噬细胞介导的释放被用来验证MMP敏感位点催化活性的变化是否会影响hBMP-2的释放动力学。将具有相同BMP-2含量的SF-B1、SF-B2和SF-B3丝素切片，在M1巨噬细胞存在下进行释放分析。利用ELISA试剂盒测定各时间点采集的释放介质中BMP-2的含量，Westernblotting测定残留不溶性纤维中的BMP-2含量，结果如图11所示。结果表明在含有巨噬细胞的培养基中共培养4周后，3个不同处理组释放BMP-2蛋白的动力学差异显著，其中SF-B1组释放BMP-2的速度最快(52.92％)，其次是SF-B2组(32.24％)和SF-B3组(11.74％)，说明药物(BMP-2蛋白)的释放动力学与催化活性(MMP酶)具有相似的趋势。催化活性的降低与BMP-2释放量减少有关，而随着动力学活性的增加，BMP-2的释放速率也随之增加。而与只相对的是即使经过长时间的共培养，在未添加细胞的培养基中的样品均没有检测到BMP-2蛋白的释放。表明本发明成功地获得了可在MMP-2酶存在条件下以不同速度释放骨生长因子的新型蚕丝材料。

通过DNA定量分析评价释放的BMP-2对间充质干细胞(MSC)增殖的影响。1周后，体外实验结果显示，WT茧片共培养MSC中的DNA含量增加，明显低于TSL-B1、TSL-B2或TSL-B3共培养MSC中的DNA含量，暗示转基因茧片中释放的BMP-2蛋白显示出促进骨再生过程第一步的骨祖细胞增殖的活性(图12)。

综上所述，本发明创造了响应MMP-2酶切割MMP linker调控丝素降解，同时释放功能因子，如释放骨生长因子BMP-2，释放的BMP-2蛋白具有促进骨再生过程第一步的骨祖细胞增殖的活性。

以上所述实施例仅是为充分说明本发明而所举的较佳的实施例，本发明的保护范围不限于此。本技术领域的技术人员在本发明基础上所作的等同替代或变换，均在本发明的保护范围之内。本发明的保护范围以权利要求书为准。

序列表

<110> 西南大学

<120> 可降解丝素蛋白和随需释放功能因子的表达系统及其应用

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1132

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

ctctagactg gtgccagaac tgggtagaag aaagttcgct gctgcttcat caggtagacc 60

ttcatcacaa ccttcagacg aagtgctgag cgaattcgaa ctgagactgt tgagcatgtt 120

cggactgaaa cagagaccga caccttcaag agacgctgtt gttcctcctt acatgctgga 180

cctgtacaga agacactcag gtcaaccagg ttcaccagct ccagatcata gactggaaag 240

agcagctagc agagctaaca cagtgagaag cttccaccac gaagagtcac tggaagaact 300

gccagaaacc agcggtaaaa ccacaagacg cttcttcttc aacctgagca gcatccctac 360

cgaagaattc atcacctcag ccgaactgca agtgttcaga gaacagatgc aggacgcttt 420

gggtaacaac agctcattcc accaccgcat caacatctac gagatcatca agccggctac 480

agctaactca aagttcccag tgacaagact gctggacaca agactggtga accaaaacgc 540

tagccgttgg gaatcattcg acgtgacacc agcagttatg cgttggacag ctcaaggtca 600

cgctaatcac ggtttcgttg tggaagtggc tcacttagaa gaaaagcagg gagtgagcaa 660

gagacacgtg agaatcagca gaagcttgca ccaagacgaa cactcttgga gccaaatcag 720

acctctgctg gttacattcg gtcacgacgg taaaggtcac cctctgcaca aaagagaaaa 780

gcgccaagct aagcacaagc agagaaaacg cctgaagagc tcttgcaaaa gacaccctct 840

gtacgtggat ttctcagacg tgggttggaa cgattggatt gttgctcctc caggttacca 900

cgctttctat tgtcacggcg agtgtccttt cccattggct gatcacttga acagcacaaa 960

ccacgctatc gtgcaaacac tggtgaacag cgtgaacagc aagatcccta aagcttgttg 1020

cgtgcctacc gaactgtcag ctatcagcat gctgtacctg gacgaaaacg aaaaggtggt 1080

gctgaagaac taccaggaca tggtcgttga aggttgcggt tgtagaggat cc 1132

<210> 2

<211> 1233

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

tgctctagag gtggtggtgg ttcccctgct ggtctgtggg ctggtggtgg tggttccctg 60

gtgccagaac tgggtagaag aaagttcgct gctgcttcat caggtagacc ttcatcacaa 120

ccttcagacg aagtgctgag cgaattcgaa ctgagactgt tgagcatgtt cggactgaaa 180

cagagaccga caccttcaag agacgctgtt gttcctcctt acatgctgga cctgtacaga 240

agacactcag gtcaaccagg ttcaccagct ccagatcata gactggaaag agcagctagc 300

agagctaaca cagtgagaag cttccaccac gaagagtcac tggaagaact gccagaaacc 360

agcggtaaaa ccacaagacg cttcttcttc aacctgagca gcatccctac cgaagaattc 420

atcacctcag ccgaactgca agtgttcaga gaacagatgc aggacgcttt gggtaacaac 480

agctcattcc accaccgcat caacatctac gagatcatca agccggctac agctaactca 540

aagttcccag tgacaagact gctggacaca agactggtga accaaaacgc tagccgttgg 600

gaatcattcg acgtgacacc agcagttatg cgttggacag ctcaaggtca cgctaatcac 660

ggtttcgttg tggaagtggc tcacttagaa gaaaagcagg gagtgagcaa gagacacgtg 720

agaatcagca gaagcttgca ccaagacgaa cactcttgga gccaaatcag acctctgctg 780

gttacattcg gtcacgacgg taaaggtcac cctctgcaca aaagagaaaa gcgccaagct 840

aagcacaagc agagaaaacg cctgaagagc tcttgcaaaa gacaccctct gtacgtggat 900

ttctcagacg tgggttggaa cgattggatt gttgctcctc caggttacca cgctttctat 960

tgtcacggcg agtgtccttt cccattggct gatcacttga acagcacaaa ccacgctatc 1020

gtgcaaacac tggtgaacag cgtgaacagc aagatcccta aagcttgttg cgtgcctacc 1080

gaactgtcag ctatcagcat gctgtacctg gacgaaaacg aaaaggtggt gctgaagaac 1140

taccaggaca tggtcgttga aggttgcggt tgtagaggtg gtggtggttc ccctgctggt 1200

ctgtgggctg gtggtggtgg ttccggatcc gcg 1233

<210> 3

<211> 1233

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

tgctctagag gtggtggtgg ttcccctctg ggtctgtggg ctggtggtgg tggttccctg 60