两种多重耐药、形成生物膜的动物病原细菌及其应用

技术领域：

本发明属于微生物技术领域，具体涉及两种多重耐药、形成生物膜的动物病原细菌及其应用。

背景技术：

生猪腹泻是兽医临床上常见的一种多因素疾病，经常侵袭养猪场，无论是现代化规模养殖场还是散养户均有发生。其特征多表现为：呕吐、拉稀、脱水等。疏于治疗或治疗不及时会引起生猪死亡或预后不良，给养殖户造成很大经济损失，严重威胁养殖业健康可持续发展。故该病在生猪养殖过程中常作为疫病防控的重中之重。

生猪腹泻的发病机理较为复杂，致病因子多达十几种，目前，已知能导致生猪腹泻的病原微生物包括：大肠杆菌、产气荚膜杆菌、魏氏梭菌、巴氏杆菌、志贺氏菌、副溶血弧菌、金黄色葡萄球菌、蜡样芽孢杆菌、沙门氏菌、胞内劳森菌、痢疾蛇形螺旋体、猪传染性胃肠炎病毒、猪轮状病毒、猪疱疹病毒、猪流行性腹泻病毒、猪瘟病毒等。另一方面，目前仍然有一些尚未发现的生猪腹泻病原微生物。因此，生猪腹泻的诊断和防治比较困难，经常导致病原诊断错误、治疗不对症、治疗结果不理想、延误了最佳治疗时机等问题。因此，大力发掘、评估、鉴定生猪腹泻病原微生物，对于生猪腹泻的鉴别、诊断和治疗具有重要意义。

当前，对于细菌类病原引起的生猪腹泻，养殖实践中的防治难点在于抗生素耐药性。由于生猪养殖业中长期、过量使用抗生素，诱发病原细菌产生了耐药性乃至多重耐药性。从养殖环境中包括生猪肠道中分离得到耐药菌株的报道越来越多。另一方面，某些导致生猪腹泻的病原细菌具有形成生物膜的能力，大大降低了抗生素治疗的效果。

发明内容：

本发明的第一个目的是提供两株病原细菌新种-恶臭香味菌(Myroidesfetidus)WP-1和黄色香味菌(Myroidesflavus)NP-2。

所述的恶臭香味菌(Myroidesfetidus)WP-1，其保藏编号：GDMCC No：61556。

所述的黄色香味菌(Myroidesflavus)NP-2，其保藏编号：GDMCC No：61557。

本发明的第二个目的是提供上述恶臭香味菌WP-1或黄色香味菌NP-2在动物病害的检测、诊断、预防或治疗中的应用。

所述的动物病害可以是生猪腹泻病。

本发明的第三个目的是提供一种检测恶臭香味菌WP-1或黄色香味菌NP-2的制剂，其以恶臭香味菌WP-1或黄色香味菌NP-2作为检测目标菌进行检测。

本发明的第四个目的是提供恶臭香味菌WP-1或黄色香味菌NP-2制备引起动物腹泻制剂中的应用。

本发明的第五个目的是提供一种动物腹泻制剂，含有恶臭香味菌WP-1或黄色香味菌NP-2作为活性成分。

所述的动物可以是生猪或加州鲈鱼。

与现有技术相比，本发明具有以下效果：

(1)本发明公布的两株香味菌WP-1与NP-2是新物种，具有较强的形成生物膜的能力。

(2)菌株WP-1和NP-2为多重耐药菌。按照国家药品监督管理局组织制定的《抗菌药物折点研究技术指导原则》，WP-1耐受AK(Amikacin，30μg，丁胺卡那)，CFP(Cefobid，30μg，先锋必素/头孢吡酮)，CRO(Ceftriaxone，30μg，头孢曲松)，KZ(Cephazolin，30μg，头孢唑啉)，C(Chloromycetin，30μg，氯霉素)，CIP(Ciprofloxacin，5μg，环丙沙星)，DA/CC(Clindamycin，2μg，氯洁霉素)，SXT(Co-Trimoxazole，25μg，复方新诺明)，DX(Doxycycline，30μg，强力霉素)，ENX(Enoxacin，10μg，依诺沙星)，E(Erythromycin，15μg，红霉素)，FZ(Furazolidone，300μg，呋喃唑酮/痢特灵)，CN(Gentamicin，10μg，庆大霉素)，LVX(Levofloxacin，5μg，左氧氟沙星)，NA(Nalidixic acid，30ug，萘啶酸)，OX(Oxacillin，1μg，苯唑青霉素)，S(Streptomycin，10μg，链霉素)，TE(Tetracycline，30μg，四环素)，VA(Vancomycin，30μg，万古霉素)，AMB(Ampicillin，10μg，两性霉素B)。而NP-2耐受AK(Amikacin，30μg，丁胺卡那)，CFP(Cefobid，30μg，先锋必素/头孢吡酮)，CTX

(Cefotaxime，30μg，头孢噻肟)，CRO(Ceftriaxone，30μg，头孢曲松)，KZ(Cephazolin，30μg，头孢唑啉)，C(Chloromycetin，30μg，氯霉素)，CIP(Ciprofloxacin，5μg，环丙沙星)，DA/CC(Clindamycin，2μg，氯洁霉素)，SXT(Co-Trimoxazole，25μg，复方新诺明)，DX(Doxycycline，30μg，强力霉素)，ENX(Enoxacin，10μg，依诺沙星)，E(Erythromycin，15μg，红霉素)，FZ(Furazolidone，300μg，呋喃唑酮/痢特灵)，CN(Gentamicin，10μg，庆大霉素)，LVX(Levofloxacin，5μg，左氧氟沙星)，NA(Nalidixic acid，30ug，萘啶酸)，OX(Oxacillin，1μg，苯唑青霉素)，S(Streptomycin，10μg，链霉素)，TE(Tetracycline，30μg，四环素)，AMB(Ampicillin，10μg，两性霉素B)。

(3)菌株WP-1和NP-2为动物病原菌，能导致动物病害。

因此，本发明从腹泻生猪粪便中分离得到两株病原细菌新种，并分析了其对23种抗生素的耐药性，评估了其形成生物膜的能力，测试了其对实验动物的致病性，相关发明结果对于生猪腹泻病的检测、诊断和治疗具有重要意义。

Myroidesfetidus WP-1，其于2021年3月15日保藏于广东省微生物菌种保藏中心(GDMCC)，地址：广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，保藏编号：GDMCC No：61556。

Myroidesflavus NP-2，其于2021年3月15日保藏于广东省微生物菌种保藏中心(GDMCC)，地址：广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，保藏编号：GDMCC No：61557。

附图说明：

图1为菌株WP-1在BHI平板上培养48h后的菌落形态图；

图2为菌株NP-2在BHI平板上培养48h后的菌落形态图；

图3为菌株WP-1细胞形态图(透射电镜)；

图4为菌株NP-2细胞形态图(透射电镜)；

图5为菌株WP-1与NP-2形成生物膜的能力；

图6为菌株WP-1与NP-2耐药性分析；

图7为菌株WP-1与NP-2致病性分析。

具体实施方式：

以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。

实施例1：菌株WP-1和NP-2的分离纯化及保存

采集断奶仔猪和保育猪新鲜粪便，立刻装入无氧采样罐中密封，并尽快带回实验室。取1g粪便样品，加入到30mL PBS中，然后梯度稀释至10

使用BHI液体培养基培养WP-1和NP-2。收集处于对数增长期的菌体，重悬于20％(v/v)甘油溶液中，冻存于-80℃冰箱中。同时，广东省微生物菌种保藏中心制备了WP-1和NP-2的冻干管，并保藏于4℃。

实施例2：菌株WP-1和NP-2形态描述

在BHI平板(青岛海博)上，培养48h后，菌株WP-1菌落颜色为白色，直径大约0.5mm，圆形，光滑，不透明，质地均匀，中央凸起，边缘整齐(图1)。

在BHI平板(青岛海博)上，培养48h后，菌株NP-2菌落颜色为黄色，直径大约0.5mm，圆形，光滑，不透明，质地均匀，中央凸起，边缘整齐(图2)。

使用无菌水分别重悬处于对数生长期的WP-1和NP-2单克隆。使用透射电子显微镜观察WP-1和NP-2的细胞形态并拍照。

WP-1和NP-2的细胞形态分别如图3和图4所示。

实施例3：菌株WP-1和NP-2的分类鉴定

使用通用引物27F和1492R扩增WP-1和NP-2的16S rRNA基因，并送至上海美吉生物医药科技有限公司测序，菌株WP-1的16S rRNA基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，菌株NP-2的16S rRNA基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

将所得到的两端测序结果拼接。在EZBioCloud数据库中比对。菌株WP-1与模式菌Myroides odoratus DSM 2801

提取WP-1与NP-2的基因组DNA。送至上海派森诺生物科技有限公司，使用IlluminaNovaSeq平台测序。对于WP-1，共得6739392条双端原始序列reads，总碱基数为1017648192bp；对于NP-2，共得7940596条双端原始序列reads，总碱基数为1199029996bp。使用SPAdes v3.11.1，采用--careful模式，设置k-mer值为127，组装基因组，得到基因组组装文件。去除长度小于500bp和覆盖度小于10的contig。使用QUAST在线工具分析基因组，WP-1得到基因组总长度3735394bp，共107个contigs，N50为154206bp，覆盖度为272，G+C含量为35.7％。NP-2基因组总长度为3492980bp，共66个contigs，N50为188653bp，覆盖度为343，G+C含量为37.6％。

从NCBI数据库中收集参比菌株Myroides odoratus DSM 2801

结果表明，WP-1与Myroides odoratus DSM 2801

综上可见，WP-1和NP-2皆为香味菌属新物种。

将菌株WP-1命名为：恶臭香味菌(Myroidesfetidus)WP-1，其于2021年3月15日保藏于广东省微生物菌种保藏中心(GDMCC)，地址：广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，保藏编号：GDMCC No：61556。

将菌株NP-2命名为：黄色香味菌(Myroidesflavus)NP-2，其于2021年3月15日保藏于广东省微生物菌种保藏中心(GDMCC)，地址：广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，保藏编号：GDMCC No：61557。

实施例4：WP-1和NP-2形成生物膜能力分析

使用TSB培养基接种细菌，37℃振荡培养至对数生长期。

将种子液涡旋至少1min，消除或减轻细菌聚集现象。可显微观察确认。

按照体积比1:100的比例将种子液稀释至新鲜的TSB+葡萄糖培养液中，终浓度约1-5×10

将稀释液接种至96孔聚苯乙烯微孔滴定板，每孔200μL。阴性对照为添加空白培养基。每个稀释液至少添加3孔作为平行。盖上盖子，37℃静止培养24h±30min。观察平板中细菌有无生长增殖。将培养液轻轻吸出。

每孔加入200μL无菌PBS缓冲液(预热到37℃)。倒置平板，甩动平板，去除PBS。观察孔内液体残余情况，可用移液器轻轻吸走残余PBS。如上清洗3次。

每孔添加200μL甲醇，固定15min。倒置，轻轻甩动，倒掉甲醇，置于60℃烘干1h。每孔添加150μL 2％的结晶紫溶液(Hucker’s crystal violet)，室温染色15min。

倒掉结晶紫溶液。打开自来水调节水流至很小，轻轻洗涤孔内的染色液，直至洗过的自来水没有颜色。

把培养板倒置在滤纸上除去残余的水，置于37℃ 30min烘干。

完全干燥后，每孔加入100μL 33％的冰醋酸溶液，置于37℃ 30min溶解孔内的结晶紫。

测定孔内溶液的OD570。

3孔重复取平均值，记为ODa。

确定阈值ODc：将阴性对照的ODa值加上3倍标准差(SD值)，即为阈值ODc：ODc＝ODa

判断分析：若ODa≤ODc，不形成生物膜。ODc4×ODc，生物膜形成能力强。

结果如附图5所示，菌株WP-1和NP-2具有较强的形成生物膜的能力。

实施例5：WP-1和NP-2的耐药性分析

本实验所用方法为Oxoid抗微生物药敏实验纸片测试法。Oxoid抗微生物药敏实验纸片为6mm的滤纸片，其上含有抗生素。

实验菌株包括WP-1、NP-2、Myroides odoratus DSM 2801

所用滤纸片共有24种抗生素：AK(Amikacin，30μg，丁胺卡那)，AMP(Ampicillin，10μg，氨苄青霉素)，CFP(Cefobid，30μg，先锋必素/头孢吡酮)，CTX(Cefotaxime，30μg，头孢噻肟)，CRO(Ceftriaxone，30μg，头孢曲松)，KZ(Cephazolin，30μg，头孢唑啉)，C(Chloromycetin，30μg，氯霉素)，CIP(Ciprofloxacin，5μg，环丙沙星)，DA/CC(Clindamycin，2μg，氯洁霉素)，SXT(Co-Trimoxazole，25μg，复方新诺明)，DX(Doxycycline，30μg，强力霉素)，ENX(Enoxacin，10μg，依诺沙星)，E(Erythromycin，15μg，红霉素)，FOX(Foxitin，30μg，头孢西丁)，FZ(Furazolidone，300μg，呋喃唑酮/痢特灵)，CN(Gentamicin，10μg，庆大霉素)，LVX(Levofloxacin，5μg，左氧氟沙星)，NA(Nalidixicacid，30ug，萘啶酸)，OX(Oxacillin，1μg，苯唑青霉素)，P(Penicillin G，10μg，青霉素G)，S(Streptomycin，10μg，链霉素)，TE(Tetracycline，30μg，四环素)，VA(Vancomycin，30μg，万古霉素)，AMB(Ampicillin，10μg，两性霉素B)。

取待试细菌接种于100mL营养肉汤培养基中。37℃培养24h，制成细菌培养液。用灭菌棉拭子将待检细菌培养液涂布于NA平皿培养基表面。

接种后15min内将药敏试纸片置于平板上(使用前先将药敏纸片恢复室温)。用镊子夹起药敏片，贴到平皿培养基表面。为了使药敏片与固体培养基紧密相贴，可用镊子轻按几下药敏片。为了能得到准确的观察结果，要求将药敏片有规律地分布于平皿培养基表面：在平皿中央贴一片，外周等距离贴7片。标记每种药敏片的名称。在贴上药敏片试纸的15min内翻转平板。

将平板置于37℃培养箱中培养24小时后，观察效果。

结果判读：培养后，测量完全抑菌区域的直径，精确到毫米。抑菌环的边缘应为肉眼所见无明显微生物生长的区域。结果判读依照CLSI(Clinical and LaboratoryStandards Institute)M100《Performance Standards for AntimicrobialSusceptibility Testing》标准进行判读。

敏感性分析：国家药品监督管理局组织制定了《抗菌药物折点研究技术指导原则》。按纸片扩散法标准操作规程，对不同种类目标细菌测定抑菌圈直径，按照以下标准进行判断。

A.对于敏感菌株，抑菌圈直径应>15mm，<45mm；

B.对于耐药菌株，抑菌圈直径很小或没有抑菌圈；

C.纸片敏感折点应落在15-25mm之间。

如图6所示，菌株WP-1仅在抗生素AMP(氨苄青霉素)、CTX(头孢噻肟)、FOX(头孢西丁)、P(青霉素G)抑菌区域直径高于15mm。菌株NP-2在抗生素AMP(氨苄青霉素)、FOX(头孢西丁)、P(青霉素G)、VA(万古霉素)抑菌区域直径高于15mm。其余均低于15mm。菌株WP-1、NP-2和DSM 2801

综上，菌株WP-1和NP-2为多重耐药菌。

实施例7：菌株WP-1和NP-2致病性分析

以加州鲈鱼为实验动物模型，测试菌株WP-1和NP-2的急性腹腔注射毒性。购买加州鲈鱼鱼苗，体长范围6.5±0.4cm，体重范围4.2±0.8g。每20条鱼苗放置于1口35L流水养殖缸中。每3缸共60条鱼苗作为一个实验组，共4组，分别通过腹腔注射的方式接种WP-1、NP-2、阳性对照Myroides odoratus DSM 2801

在室温(24-28℃)下，养殖23天。使用Abbott公式计算累积死亡率。

如图7所示，菌株WP-1、NP-2和阳性对照DSM 2801

序列表

<110> 广东博沃特生物科技有限公司

广东省科学院微生物研究所（广东省微生物分析检测中心）

广州王道生物科技有限公司

<120> 两种多重耐药、形成生物膜的动物病原细菌及其应用

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1435

<212> DNA

<213> 恶臭香味菌WP-1(Myroides fetidus)

<400> 1

ttttggtact ggctcaggat gaacgctagc ggcaggccta acacatgcaa gtcgaggggt 60

atagagagct tgctttctag agaccggcgg atgggtgagt aacgcgtatg caacctacct 120

tttacagggg aatagcccgg agaaattcgg attaatgctc catggtttat aagagtggca 180

tcacttttat aataaagatt tatcggtaaa agatgggcat gcgtatcatt agctagttgg 240

tgtggtaacg gcataccaag gcgacgatga ttaggggtcc tgagagggag atcccccaca 300

ctggtactga gacacggacc agactcctac gggaggcagc agtgaggaat attggtcaat 360

ggaggcaact ctgaaccagc catgccgcgt gcaggatgac ggtcctatgg attgtaaact 420

gcttttgtac gggaagaaat gtaattacgt gtaattattt gacggtaccg taagaataag 480

gatcggctaa ctccgtgcca gcagccgcgg taatacggag gatccgagcg ttatccggaa 540

ttattgggtt taaagggttc gtaggcggtt tagtaagtca gtggtgaaat cttgcagctt 600

aactgtaaaa ttgccgttga tactgctaaa cttgaatagt atggaagtaa ttagaatatg 660

tagtgtagcg gtgaaatgct tagatattac atggaatacc aattgcgaag gcagattact 720

acgtacttat tgacgctgat gaacgaaagc gtgggtagcg aacaggatta gataccctgg 780

tagtccacgc cgtaaacgat ggatactagc tgttcggtct tcggattgag tggctaagcg 840

aaagtgataa gtatcccacc tggggagtac gttcgcaaga atgaaactca aaggaattga 900

cgggggcccg cacaagcggt ggagcatgtg gtttaattcg atgatacgcg aggaacctta 960

ccaaggctta aatgtagatt gacaggttta gagatagact tttcttcgga caatttacaa 1020

ggtgctgcat ggttgtcgtc agctcgtgcc gtgaggtgtc aggttaagtc ctataacgag 1080

cgcaacccct attgttagtt gccaacgagt aatgtcggga actctagcaa gactgccggt 1140

gcaaaccgtg aggaaggtgg ggatgacgtc aaatcatcac ggcccttacg tcttgggcta 1200

cacacgtgct acaatggcca gtacagaaag cagctaccag gcaactggat gcgaatctca 1260

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tcaagccatg gaagctgggg gtacctgaag tcggtcgccg caaggagctg cctag 1435

<210> 2

<211> 1441

<212> DNA

<213> 黄色香味菌NP-2(Myroides flavus)

<400> 2

ttaccctagg cagctccttg cggcgaccga cttcaggtac ccccagcttc catggcttga 60

cgggcggtgt gtacaaggcc cgggaacgta ttcaccggat catggctgat atccgattac 120

tagcgattcc agcttcatgg agtcgagttg cagactccaa tccgaactga gaccagcttt 180

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tagcccaaga cgtaagggcc gtgatgattt gacgtcatcc ccaccttcct cacggtttgc 300

accggcagtc ttgttagagt tcccggcttg acccgctggc aactaacaat aggggttgcg 360

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taaggttcct cgcgtatcat cgaattaaac cacatgctcc accgcttgtg cgggcccccg 540

tcaattcctt tgagtttcat tcttgcgaac gtactcccca ggtgggatac ttatcacttt 600

cgcttagcca ctcaatccga agaccgaaca gctagtatcc atcgtttacg gcgtggacta 660

ccagggtatc taatcctgtt cgctacccac gctttcgttc atcagcgtca ataagtacgt 720

agtaatctgc cttcgcaatt ggtattccat gtaatatcta agcatttcac cgctacacta 780

catattctaa ttacttccat actattcaag tttagcagta tcaacggcaa ttttacagtt 840

aagctgcaag atttcaccac tgacttacta aaccgcctac gaacccttta aacccaataa 900

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cttattctta cggtaccgtc aaataattac acgtaattac atttcttccc gtacaaaagc 1020

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acccctcgac ttgcatgtgt taggcctgcc gctagcgttc atcctgagcc agatccaaac 1440

t 1441