一种液相色谱柱复合填料及其应用

技术领域

本发明涉及药物分析技术领域，具体涉及一种液相色谱柱复合填料及其制备方法。

背景技术

高效液相色谱法是目前发展最快、应用最广泛的分离分析技术之一，在药物分析、生命科学、环境监测等领域发挥着越来越重要的作用。色谱填料作为液相色谱分离的核心之一，其性能直接影响分离分析的最终结果。而面对复杂的样品，尤其是同时含有亲水性成分、非极性成分和酸性成分时，一种单一的色谱柱难以满足分离和色谱柱适用性的要求。

中药提取很大一部分采用水作为溶剂，其提取物含有大量的亲水性成分，其中不乏有部分酸性较强的成分，比如山楂提取液中含有大量的枸橼酸、苹果酸和黄酮类等酸性成分，金银花提取液中含有绿原酸、异绿原酸和咖啡酸等主要活性成分，当归提取液中含有丁二酸、阿魏酸和亚叶酸等酸性成分，与此同时，中药提取物中还含有萜类、甾体、油脂、挥发油和香豆素等弱极性成分，通常当一种组合物或中药提取物中含有几大类有效部位成分时，需要在不同色谱柱不同条件下进行，对有机试剂，色谱仪器、色谱柱均造成了一定的浪费。因此开发一种可以在同一色谱柱中分离亲水性、亲脂性、酸性和碱性等多种性质不同的成分的色谱填料，具有潜在的社会价值。

虽然多维色谱技术能够满足人们对分辨率的要求，但多维色谱系统存在着操作复杂、设备昂贵、流动相兼容性差等问题，无法满足中小企业分析检测的需求，难以推广。

中国发明专利CN101721980B公开了一种液相色谱柱混合填料及色谱柱，包括长链烷基二甲基硅烷键合硅胶和酰胺基硅烷键合硅胶，其重量比为10:1-1:10，平均粒径相差在±20％以内，比重相差在±20％以内，应用在含有乙腈和水溶液混合流动相条件下的色谱分离，分离应用是同时含有亲水性极强的化合物和亲脂性极强的化合物的样品的色谱分离和检测。但是该色谱填料对酸碱性成分的分离效果并不理想，且不能分离酸性较强的成分。

中国发明专利CN209416990U公开了一种复合色谱柱，包括柱体，所述柱体分为上段和下段，上段所用填料为微球表面键合了萘基的填料，下段所用填料为微球表面键合了苯磺酸基的填料。该复合色谱柱分析效果好。本实用新型还公开了一种二维液相色谱系统，以所述复合色谱柱作为分析柱，另外还包括萃取柱，所述萃取柱的填料为微球表面键合了羧酸基的填料。该复合液相色谱系统可实现对四种精神药物的同时分离。该色谱柱主要是对芳香类化合物的分离效果较好，对其他烷烃类非极性成分的分离效果较差。

发明内容

本发明的目的是克服现有技术的不足，提供一种液相色谱柱复合填料，该色谱填料制备简单，可同时分离亲水性、亲脂性、酸性和碱性等多种不同性质的成分，分离度好，柱效高，分离时间短，且耐酸碱性强。

本发明的目的是通过以下技术方案实现的：

一种液相色谱柱复合填料，所述复合填料包括十八烷基硅烷键合硅胶填料和纳洛酮键合硅胶填料。

优选地，所述十八烷基硅烷键合硅胶填料和纳洛酮键合硅胶填料的质量比为1:2-3。

优选地，所述十八烷基硅烷键合硅胶填料和纳洛酮键合硅胶填料的粒径为3-5μm。

优选地，所述纳洛酮键合硅胶填料的制备方法包括如下步骤：

(1)将硅球活化处理得活化硅球；

(2)再将三乙氧基硅烷反应至活化硅球表面形成硅氢键，得改性硅胶；

(3)在改性硅胶中加入纳洛酮，并加入有机溶剂和氯铂酸的异丙醇溶液，搅拌，加热回流8-10h，洗涤，烘干即得。

更优选地，步骤(1)操作包括：步骤(1)操作包括：将硅球加入盐酸中，反应2-3h，烘干得活化硅球备用。

优选地，步骤(2)所述反应为将活化硅球中依次加入二氧六环、2mol/L盐酸和1mol/L三乙氧基硅烷，加热回流12-15h，用30％丙酮水溶液、二氧六环洗涤，烘干即得；优选地，所述反应中活化硅球和三乙氧基硅烷的质量摩尔比为1：0.005-0.006g/mol；所述活化硅胶与反应加入的二氧六环的质量体积比为1：23-25g/ml；所述烘干温度为110-130℃。

优选地，步骤(3)中所述改性硅胶和纳洛酮的质量摩尔比为1：5-8g/mol，所述有机溶剂为三氯甲烷，所述氯铂酸与纳洛酮的摩尔比为10-6-10-5：1；所述改性硅胶与三氯甲烷的质量体积比为1：25-45g/mL。

优选地，步骤(3)中所述洗涤为依次用丙酮和二氯甲烷洗涤，再依次用二氯甲烷、丙酮洗涤。

其中纳洛酮的结构式为：

步骤(3)中改性硅胶的硅氢键在上述条件下与纳洛酮的烯烃键发生加成反应，将纳洛酮分子键合到改性硅胶上；本发明经过大量研究，从众多化合物中发现纳洛酮键合硅胶对非极性和极性成分的分离均良好，且填料耐酸性好。

本发明的另一目的是提供上述复合填料制成的色谱柱，所述色谱柱制备方法包括将所述十八烷基硅烷键合硅胶和纳洛酮键合硅胶置于有机溶剂中混合，超声，装入液相色谱柱中；

优选地，所述有机溶剂为丙酮、四氢呋喃、聚乙二醇和四氯化碳中的一种或几种；所述超声功率为200-500W，所述超声时间为20-40min。

本发明还有一个目的是提供上述色谱填料色谱柱复合填料在分析检测同时含有亲水、亲脂以及酸性和碱性成分的组合物中的应用。

本发明的有益效果：

本发明制得的色谱柱可以同时分离检测亲水性、酸性以及弱极性成分，分离度好，柱效高，检测时间短。相比采用传统的多只色谱柱检测分析，方法简单、高效，且可节约大量的有机试剂及分析时间。

本发明经大量研究发现制备得到的纳洛酮键合硅胶耐酸碱性优良，纳洛酮中含有酚羟基、醇羟基和醚基等亲水性较好的基团，通过与自身其他非极性基团及十八烷基键合硅胶填料有机配伍，最终使得其在pH1-10均可以有很好的分离。将其与十八烷基键合硅胶以特定比例混合，得到的色谱柱不仅可以使极性和非极性成分均得以很好的分离，而且分析酸性和碱性成分峰形好，不拖尾，柱效高，很好的解决了复方组合物中多种性质药效成分需多种色谱柱多次分析检测的问题，且耗时短，耐酸碱性强，分析灵敏。

附图说明

图1-1为采用实施例1制备的色谱柱分析得到的色谱图，1为柠檬酸，2为氧化苦参碱，3为苦参碱，4为戊苯；

图1-2为采用实施例1制备的色谱柱分析得到的色谱局部放大图，1为柠檬酸，2为氧化苦参碱，3为苦参碱，4为戊苯；

图2-1为采用实施例2制备的色谱柱分析得到的色谱图，1为柠檬酸，2为氧化苦参碱，3为苦参碱，4为戊苯；

图2-2为采用实施例2制备的色谱柱分析得到的色谱局部放大图，1为柠檬酸，2为氧化苦参碱，3为苦参碱，4为戊苯；

图3-1为采用实施例3制备的色谱柱分析得到的色谱图，1为柠檬酸，2为苦参碱，3为氧化苦参碱，4为戊苯；

图3-2为采用实施例3制备的色谱柱分析得到的色谱局部放大图，1为柠檬酸，2为苦参碱，3为氧化苦参碱，4为戊苯；

图4-1为采用对比例1制备的色谱柱分析得到的色谱图，1为柠檬酸，2为戊苯，3为苦参碱，4为氧化苦参碱；

图4-2为采用对比例1制备的色谱柱分析得到的色谱局部放大图，1为柠檬酸，2为戊苯，3为苦参碱，4为氧化苦参碱；

图5为采用对比例2制备的色谱柱分析得到的色谱图，1为柠檬酸，2为氧化苦参碱，3为苦参碱，4为戊苯；

图6为采用对比例3制备的色谱柱分析得到的色谱图，1为柠檬酸，2为氧化苦参碱，3为苦参碱，4为戊苯。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明技术方案作进一步说明。

实施例1

(1)将1份硅球(平均粒径为5μm，日本Fuji公司)中加入25份1mol/L盐酸，90℃搅拌反应2h，过滤，用超纯水洗涤至中性，120℃真空干燥，得活化硅球；

(2)将上述活化硅球中加入二氧六环(活化硅胶与加入的二氧六环的质量体积比为1：23g/ml)，之后缓慢滴加2mol/L HC l，加热至80℃，然后缓慢滴加1mol/L三乙氧基硅烷的二氧六环溶液，加热回流12h，体系抽干后，用30％丙酮水溶液、二氧六环洗涤，120℃下烘干得改性硅胶，其中活化硅球和三乙氧基硅烷的质量摩尔比为1：0.006g/mol。

(3)在改性硅胶中依次加入三氯甲烷，纳洛酮和2％氯铂酸的异丙醇溶液，磁力搅拌，加热回流8h，过滤，滤饼依次用丙酮和二氯甲烷洗涤，再依次用二氯甲烷、丙酮洗涤，110℃烘干即得纳洛酮键合硅胶。其中，改性硅胶和纳洛酮的质量摩尔比为1：5g/mol，氯铂酸与反应底物纳洛酮的摩尔比为10

(4)将1份十八烷基键合硅胶和2.5份步骤(2)制得的纳洛酮键合硅胶在150份四氯化碳溶剂中200W超声40min，制得混合液，将混合液装入4.6mm×150mm色谱柱中。

其中十八烷基键合硅胶购自日照科谱诺新材料有限公司，品牌为FujiChromatorex填料，货号为112926-00-8，粒径为3μm。

实施例2

(1)将1份硅球(平均粒径为5μm，日本Fuji公司)中加入25份1mol/L盐酸，90℃搅拌反应2h，过滤，用超纯水洗涤至中性，120℃真空干燥，得活化硅球；

(2)将上述活化硅球中加入二氧六环(活化硅胶与加入的二氧六环的质量体积比为1：25g/ml)，之后缓慢滴加2mol/L HC l，加热至80℃，然后缓慢滴加1mol/L三乙氧基硅烷的二氧六环溶液，加热回流15h，过滤，滤饼用30％丙酮水溶液、二氧六环洗涤，130℃下烘干得改性硅胶，其中活化硅球和三乙氧基硅烷的质量摩尔比为1：0.005g/mol。

(3)在改性硅胶中依次加入三氯甲烷，纳洛酮和2％氯铂酸的异丙醇溶液，磁力搅拌，加热回流10h，过滤，滤饼依次用水、丙酮和二氯甲烷洗涤，再依次用二氯甲烷、丙酮洗涤，110℃烘干即得纳洛酮二甲基硅烷键合硅胶。其中，改性硅胶和纳洛酮的质量摩尔比为1：5g/mol，氯铂酸与反应底物纳洛酮的摩尔比为10

(4)将1份十八烷基键合硅胶和3份步骤(2)制得的纳洛酮键合硅胶在150份四氯化碳溶剂中200W超声40min，制得混合液，将混合液装入4.6mm×150mm色谱柱中。

其中十八烷基键合硅胶购自日照科谱诺新材料有限公司，品牌为FujiChromatorex填料，货号为112926-00-8，粒径为3μm。

实施例3

(1)将1份硅球(平均粒径为5μm，日本Fuji公司)中加入25份1mol/L盐酸，90℃搅拌反应3h，过滤，用超纯水洗涤至中性，120℃真空干燥，得活化硅球；

(2)将上述活化硅球中加入二氧六环(活化硅胶与加入的二氧六环的质量体积比为1：25g/ml)，之后缓慢滴加2mol/L HC l，加热至80℃，然后缓慢滴加1mol/L三乙氧基硅烷的二氧六环溶液，加热回流12h，过滤，滤饼用30％丙酮水溶液、二氧六环洗涤，130℃下烘干得改性硅胶，其中活化硅球和三乙氧基硅烷的质量摩尔比为1：0.006g/mol。

(3)在改性硅胶中依次加入三氯甲烷，纳洛酮和2％氯铂酸的异丙醇溶液，磁力搅拌，加热回流10h，过滤，滤饼依次用丙酮和二氯甲烷洗涤，再依次用二氯甲烷、丙酮洗涤，130℃烘干即得纳洛酮二甲基硅烷键合硅胶。其中，改性硅胶和纳洛酮的质量摩尔比为1：8g/mol，氯铂酸与反应底物纳洛酮的摩尔比为10

(4)将1份十八烷基键合硅胶和2份步骤(2)制得的纳洛酮键合硅胶在150份四氯化碳溶剂中200W超声40min，制得混合液，将混合液装入4.6mm×150mm色谱柱中。

其中十八烷基键合硅胶购自日照科谱诺新材料有限公司，品牌为FujiChromatorex填料，货号为112926-00-8，粒径为5μm。

对比例1

本对比例与实施例3的区别是加入纳洛酮键合硅胶的质量为1份，其余与实施例3保持一致。

对比例2

本对比例与实施例3的区别是将步骤(3)中的有机溶剂采用甲苯，加热回流时间11h其余与实施例3保持一致。

对比例3

本对比例与实施例3的区别是步骤(3)中改性硅胶和纳洛酮的质量摩尔比为1：3g/mo L，其余与实施例3保持一致。

效果例1

取实施例1-3和对比例1-3得的色谱柱，测试样品为含柠檬酸、苦参碱、氧化苦参碱和戊苯的70％乙腈水溶液，流动相乙腈-水(70:30)，流速1ml/min，柱温为25℃，在waterse2690-UV高效液相色谱仪上进行分析检测，检测波长为210nm，其中实施例3色谱柱在进样之前，用2％的三氟乙酸溶液过柱子一周，然后依次用水、乙腈-水(70:30)冲洗柱子。

上述实验所得谱图见图1-1至图6，其积分结果如下表1-6。

表1实施例1色谱积分结果表

表2实施例2色谱积分结果表

表3实施例3色谱积分结果表

表4对比例1色谱积分结果表

表5对比例2色谱积分结果表

表6对比例3色谱积分结果表

结果表明，十八烷基键合硅胶和纳洛酮键合硅胶的混合比例在1:2-3时，分离酸性、碱性和非极性成分时分离度好，柱效高，检测时间短，色谱填料耐酸性强。在纳洛酮键合硅胶在复合填料中的比例减小时，四种不同极性及酸碱性成分的分离效果较差，分离度不符合含测要求；本发明在纳洛酮与改性硅胶反应研究中发现，有机溶剂的选择和反应时间对其最终分离的效果，在柱子中的产物的回收产生一定的影响，初步判断为甲苯与三氯甲烷的沸点存在一定的差异，反应温度的不同对产率产生了一定的影响；本发明在反应摸索中还发现了反应底物氢化硅胶和纳洛酮的质量摩尔比在1：5-8g/moL时，色谱柱分离效果佳。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围内。