一种基于抗原有色化的食源性致病菌的荧光免疫层析联检方法

技术领域

本发明涉及生物检测领域，尤其涉及一种基于抗原有色化的食源性致病菌的荧光免疫层析联检方法。

背景技术

食源性疾病是因摄入被污染的食品而引发的疾病，是当今世界上最广泛的卫生问题之一。据报告，食源性疾病的发病率居各类疾病总发病率的第二位。然而，食源性致病菌是导致食源性疾病暴发的主要因素之一，主要存在于牛肉、牛奶、鸡肉、蔬菜、水果及其制品中，被人体摄入后严重感染可导致死亡。因此，对食品中食源性致病菌的及时检测尤为重要。

免疫层析试纸条是一种廉价、便携、适合现场快速检测的技术，可在几分钟内实现准确的检测，广泛用于食品监管、农业生产、环境保护以及临床诊断等领域。免疫层析试纸条大多采用双抗体夹心的模式进行检测，以胶体金等纳米材料实现标记抗体和结果报告双重功能，同时这也导致了试纸条检测性能的优劣严重依赖纳米材料、配对抗体和材料标记抗体的稳定性。然而，性质稳定、分散性良好、粒径均一的标记材料制备要求较高，不易获取，并且可用于双抗体夹心的单克隆抗体获取周期长，对于性能稳定的抗体获取难度则更大，这些因素成为了免疫层析试纸条进一步发展和应用的瓶颈。并且，检测食源性致病菌的免疫层析试纸条大多是单样本的单靶标检测，即一根试纸条只能检测一个样品中的一种致病菌，面对多种待检致病菌，则需分别研发各自对应的试纸条，这无疑增大了建立检测方法的复杂程度。

发明内容

本发明的目的是为了提供一种基于抗原有色化的食源性致病菌的荧光免疫层析联检方法，是为了摆脱免疫层析试纸条对抗体标记材料以及配对抗体的严重依赖，建立无需纳米标记材料和仅需一株特异性抗体就可以实现对食品中多种食源性致病菌(大肠杆菌O157:H7、沙门氏菌和鲍氏志贺氏菌)的快速联合检测方法。

为了实现上述目的，本发明提出一种基于抗原有色化的食源性致病菌的荧光免疫层析联检方法，包括染色剂和试纸条，样品经所述染色剂有色化培养后通过所述试纸条进行检测；所述染色剂为四[4-(4’-羧基苯基)苯基]乙烯，所述试纸条包括样品垫(1)、检测反应区、吸水垫(4)和底板(7)，所述底板(7)上沿层析方向依次设置所述样品垫(1)、检测反应区和吸水垫(4)，所述检测反应区包括至少三条检测线和NC膜(6)，所述检测线平行且间隔排设在所述NC膜(6)上。

进一步地，所述NC膜(6)上沿层析方向依次设置的所述检测线分别为鲍氏志贺氏菌检测线(2)、沙门氏菌检测线(3)和大肠杆菌O157:H7检测线(4)。

进一步地，所述鲍氏志贺氏菌检测线(2)包括鲍氏志贺氏菌单抗，所述沙门氏菌检测线(3)包括沙门氏菌单抗，所述大肠杆菌O157:H7检测线(4)包括大肠杆菌O157:H7单抗。

进一步地，所述样品垫(1)和吸水垫(4)分别交叠粘贴在所述NC膜(6)两端的上方。

进一步地，所述检测线均通过点样仪以1μL/cm喷涂于所述NC膜(6)上。

进一步地，所述试纸条的宽度为3mm，所述样品垫(1)和吸水垫(4)的长度均为2cm，所述底板(7)的长度为6cm，所述NC膜(6)的长度为2.5cm，相邻所述检测线之间的间距为0.5cm。

进一步地，所述试纸条在4℃避光条件下干燥保存。

进一步地，所述底板(7)为PVC粘性底板，所述NC膜(6)为硝酸纤维素膜。

与现有技术相比，本发明的有益效果主要体现在：利用染色剂将鲍氏志贺氏菌、沙门氏菌和大肠杆菌O157:H7进行染色化培养，并通过试纸条高灵敏的联合检测，检测线用于捕获被染色剂染色的三种致病菌并显示检测结果，三条检测线能同时联合检测三种食源性致病菌，且不会出现交叉反应情况。

附图说明

图1为本发明中试纸条的结构示意图；

图2为本发明实施例中进行联检试纸条的检测结果的判定示意图；

图3a为本发明实施例中大肠杆菌O157:H7经TCBPE染色的荧光显微镜观察结果示意图；

图3b为本发明实施例中沙门氏菌经TCBPE染色的荧光显微镜观察结果示意图；

图3c为本发明实施例中鲍氏志贺氏菌经TCBPE染色的荧光显微镜观察结果示意图；

图4为本发明实施例中进行联检试纸条的检测灵敏度测定的示意图；

图5为本发明实施例中进行联检试纸条各种食源性致病菌的特异性结果示意图；

图6为本发明实施例中进行联检试纸条对食品样品模拟带大肠杆菌O157:H7时的测定结果示意图；

图7为本发明实施例中进行联检试纸条对食品样品模拟带沙门氏菌时的测定结果示意图；

图8为本发明实施例中进行联检试纸条对食品样品模拟带鲍氏志贺氏菌时的测定结果示意图；

图9为本发明实施例中进行联检试纸条对食品样品模拟同时带大肠杆菌O157:H7、沙门氏菌和鲍氏志贺氏菌时的测定结果示意图。

具体实施方式

下面将结合示意图对本发明的基于抗原有色化的食源性致病菌的荧光免疫层析联检方法进行更详细的描述，其中表示了本发明的优选实施例，应该理解本领域技术人员可以修改在此描述的本发明，而仍然实现本发明的有利效果。因此，下列描述应当被理解为对于本领域技术人员的广泛知道，而并不作为对本发明的限制。

在本发明的描述中，需要说明的是，对于方位词，如有术语“中心”，“横向”、“纵向”、“长度”、“宽度”、“厚度”、“上”、“下”、“前”、“后”、“左”、“右”、“竖直”、“水平”、“顶”、“底”、“内”、“外”、“顺时针”、“逆时针”等指示方位和位置关系为基于附图所示的方位或位置关系，仅是为了便于叙述本发明和简化描述，而不是指示或暗示所指的装置或元件必须具有特定的方位、以特定方位构造和操作，不能理解为限制本发明的具体保护范围。

在发明中，除非另有规定和限定，第一特征在第二特征之“上”或之“下”可以包括第一和第二特征直接接触，也可以包括第一特征和第二特征不是直接接触而是通过它们之间的另外特征接触。而且，第一特征在第二特征“之上”、“之下”和“上面”包括第一特征在第二特征正上方和斜上方，或仅仅是表示第一特征水平高度高于第二特征的高度。第一特征在第二特征“之上”、“之下”和“下面”包括第一特征在第二特征正下方或斜下方，或仅仅表示第一特征水平高度低于第二特征。

在下列段落中参照附图以举例方式更具体地描述本发明。根据下面说明，本发明的优点和特征将更清楚。需说明的是，附图均采用非常简化的形式且均使用非精准的比例，仅用以方便、明晰地辅助说明本发明实施例的目的。

如图1所示，本发明提出一种基于抗原有色化的食源性致病菌的荧光免疫层析联检方法，包括染色剂和试纸条，样品经染色剂有色化培养后通过试纸条进行检测；染色剂为四[4-(4’-羧基苯基)苯基]乙烯(1,1,2,2-Tetra(4-carboxylbiphenyl)ethylene)，简称TCBPE。试纸条包括样品垫1、检测反应区、吸水垫4和底板7，底板7上沿层析方向依次设置样品垫1、检测反应区和吸水垫4，检测反应区包括至少三条检测线和NC膜6，检测线平行且间隔排设在NC膜6上。为了增加需要检测的食源性致病菌，仅需要在试纸条上增加致病菌抗体的检测线，就可以在一根试纸条上实现多靶标的联合检测，这大大降低了检测成本，使快速检测食源性致病菌免疫层析试纸条的研发和商业化应用迈出了一大步。

具体地，在本实施例中，NC膜6上沿层析方向依次设置的检测线分别为鲍氏志贺氏菌检测线2、沙门氏菌检测线3和大肠杆菌O157:H7检测线4。鲍氏志贺氏菌检测线2包括鲍氏志贺氏菌单抗，沙门氏菌检测线3包括沙门氏菌单抗，大肠杆菌O157:H7检测线4包括大肠杆菌O157:H7单抗。

进一步地，在本实施例中，试纸条的宽度为3mm，。

进一步地，检测线均通过点样仪以1μL/cm喷涂于NC膜6上。底板7为PVC粘性底板，NC膜6为硝酸纤维素膜。

试纸条的制备如下，分别将1mg/mL的鲍氏志贺氏菌单抗、沙门氏菌单抗和大肠杆菌O157:H7单抗用点样仪以1μL/cm平行喷涂于NC膜上，形成三条检测线，相邻检测线之间的间距为0.5cm，喷涂后将NC膜放置在4℃避光条件下干燥保存。样品垫1和吸水垫4的长度均为2cm，底板7的长度为6cm，NC膜6的长度为2.5cm，样品垫1和吸水垫4分别交叠粘贴在NC膜6两端的上方。将处理后的NC膜、样品垫和吸收垫在试纸条贴板机上重叠后依次粘贴于PVC底板上，通过试纸条斩切机切割成3mm宽，并将试纸条在4℃避光条件下干燥保存。

具体地，进行联检试纸条的检测及结果的判定，如图2所示，当样品滴加在试纸条样品垫上时溶液随毛细管作用向NC膜层析，如果样品溶液中不含被染色的靶标鲍氏志贺氏菌、沙门氏菌和大肠杆菌O157:H7，则检测线处均不会显色；如果样品溶液中仅含有一种被染色的靶标细菌，则该染色的细菌会被检测线上对应的单抗捕获聚集，使试纸条其中一条对应的检测线显色；同理，如果样品中含有两种靶标细菌，则试纸条上对应的两条检测线显色；若样品同时含有鲍氏志贺氏菌、沙门氏菌和大肠杆菌O157:H7时，则联检试纸条的三条检测线均显色。

同时，如图3所示，通过荧光显微镜能观察到TCBPE染色后的细菌，实验如下，吸取新鲜培养5h的鲍氏志贺氏菌、沙门氏菌和大肠杆菌O157:H7的菌液，5000rpm离心3min，弃去培养液，用等体积超纯水重悬，滴加至载玻片；待细菌干燥固定后滴加TCBPE溶液，静置1min后，超纯水冲洗染料溶液，干燥后置于荧光显微镜下观察。由图3a至图3c可知，TCBPE对大肠杆菌O157:H7、沙门氏菌和鲍氏志贺氏菌均能够有效地进行染色，使其呈现绿色的荧光信号。

具体地，进行联检试纸条的检测灵敏度测定，如图4所示，将鲍氏志贺氏菌、沙门氏菌和大肠杆菌O157:H7分别有色化培养至109CFU/mL以上，并将3种菌分别按相同终浓度混合，使用超纯水10倍梯度稀释，取各梯度菌液100μL分别滴加至联检免疫层析试纸条样品垫上，染色的培养基作为阴性对照。其中，9～4表示细菌浓度109～104CFU/mL，N表示阴性对照。

观察检测结果图4中a部可知，当鲍氏志贺氏菌浓度为105～109CFU/mL时，联检试纸条T1测线处有绿色荧光条带，浓度为104CFU/mL时，T1未出现条带，说明鲍氏志贺氏菌单独存在时联检试纸条对鲍氏志贺氏菌检测灵敏度为105CFU/mL；如图4中b部所示，当沙门氏菌为105～109CFU/mL时，试纸条T2显色，浓度为104CFU/mL时，T2未显色，说明沙门氏菌单独存在时联检试纸条对沙门氏菌检测灵敏度也为105CFU/mL；如图4中c部所示，仅大肠杆菌O157:H7存在时，联检试纸条对其检测灵敏度依然为105CFU/mL；如图4中d部所示，对浓度均为105～109CFU/mL的3种菌混合液检测时，联检试纸条的T1、T2和T3均出现绿色荧光条带，且低于105CFU/mL时，联检试纸条的三条检测线均未显色，说明联检试纸条可以同时检测鲍氏志贺氏菌、沙门氏菌和大肠杆菌O157:H7的检测灵敏度为105CFU/mL，与单独检测每种致病菌灵敏度一致，也说明了TCBPE染色的鲍氏志贺氏菌、沙门氏菌和大肠杆菌O157:H7这3种菌被联检试纸条检测时互不影响检测结果。

此外，采用本发明的联检试纸条对26株食源性致病菌进行交叉反应测定，将如下的表1中所有菌株进行TCBPE有色化培养至108CFU/mL以上，并使用本发明的试纸条对各菌液进行检测，评估本发明检测的特异性。如图5所示，该联检试纸条仅对3～5号大肠杆菌O157:H7、15～21号沙门氏菌和25号鲍氏志贺氏菌能特异性检出阳性结果，且阴性对照无假阳性。其中，1～30为表1对应菌株编号，31～37为3种菌同时存在和两两分别存在以及单独存在的阳性对照，N为阴性对照；表明本发明联检免疫层析试纸条仅对TCBPE染色的鲍氏志贺氏菌、沙门氏菌和大肠杆菌O157:H7有特异性检测，对其它食源性致病菌没有交叉反应，本发明具有良好的检测特异性。

表1本发明交叉反应测定所用菌株

进一步地，进行联检试纸条对食品样品模拟带菌测定，通过联检免疫层析试纸条检测模拟带菌的食品，验证该联检试纸条基于TCBPE染色方法在食品样品检测中的可行性。从本地市场购买牛肉、牛奶、白菜和鸡肉样品，分别称量25g或25mL添加到225mL营养肉汤液体培养基中，均质2min后转移至锥形瓶中121℃灭菌15min，待降至室温后在无菌环境中分别加入约250CFU鲍氏志贺氏菌、250CFU沙门氏菌和250CFU大肠杆菌O157:H7，并以相同接菌量将3种细菌混合后加至食品样品的培养基中，置于37℃培养箱培养12h，同时对每小时收集的培养液进行联检免疫层析试纸条检测。如图6至图9所示，本发明的联检试纸条对鲍氏志贺氏菌、沙门氏菌和大肠杆菌O157:H7依次进行的单独存在和全部存在的测定结果示意，其中，a～d依次为白菜、鸡肉、牛奶、牛肉样品，1～10为前增菌时间h，N为阴性对照，P为阳性对照。

具体地，如图6所示，本发明的联检试纸条对大肠杆菌O157:H7污染的牛肉、牛奶、白菜和鸡肉样品前增菌6～7小时就可以检出阳性结果；如图7所示，本发明的联检试纸条对沙门氏菌污染的食品样品前增菌5～6小时就可以检出阳性结果；如图8所示，本发明对鲍氏志贺氏菌污染的食品样品前增菌5～6小时可检出阳性结果；如图9所示，本发明试纸条对鲍氏志贺氏菌、沙门氏菌和大肠杆菌O157:H7同时污染牛肉、牛奶、白菜和鸡肉样品前增菌5～6小时就可以同时检出这3种致病菌的阳性结果。综上，基于TCBPE抗原有色化的联检免疫层析试纸条可以用于白菜、鸡肉、牛奶、牛肉中鲍氏志贺氏菌、沙门氏菌、大肠杆菌O157:H7的联合检测。

综上，在本实施例中，提出的基于抗原有色化的食源性致病菌的荧光免疫层析联检方法，利用染色剂将鲍氏志贺氏菌、沙门氏菌和大肠杆菌O157:H7进行染色化培养，并通过试纸条进行联合检测，试纸条对上述三种致病菌的检测灵敏度均为105CFU/mL。检测线用于捕获被染色剂染色的三种致病菌并显示检测结果，三条检测线既能单独检测，又能同时联合检测上述的三种食源性致病菌，并且对其它食源性致病菌无交叉反应，特异性良好。

上述仅为本发明的优选实施例而已，并不对本发明起到任何限制作用。任何所属技术领域的技术人员，在不脱离本发明的技术方案的范围内，对本发明揭露的技术方案和技术内容做任何形式的等同替换或修改等变动，均属未脱离本发明的技术方案的内容，仍属于本发明的保护范围之内。