一种产生活性肽的枯草芽孢杆菌及其应用

技术领域

本发明涉及微生物技术领域，特别是一种产生活性肽的枯草芽孢杆菌及其应用。

背景技术

许多年来在动物饲料和饲养中广泛使用抗生素、化学合成药物、激素等促生长保健剂，导致了畜禽和水产产品中药物残留严重、畜禽产品品质下降、细菌耐药性增强、耐药菌株增多，给人类安全和生态环境带来很大威胁。由于抗生素的诸多副作用，特别是近年来消费者对食品安全问题的关注，世界各国都在纷纷禁用或限制抗生素的使用，并加速开发、推广新型安全高效的绿色饲料添加剂，以减少或替代抗生素等药物添加剂。

微生态制剂因其独特的理化特性和生物学功能而成为新型绿色饲料添加剂领域的研究热点。目前国内市场上可见到大豆肽，多为进口产品，价格昂贵，主要是通过酶法来生产的。酶法是应用蛋白酶如木瓜蛋白酶、菠萝蛋白酶等植物蛋白酶或用胰蛋白酶、胃蛋白酶等动物蛋白酶，将大豆蛋白降解为小肽，但这种方法生产的大豆肽容易产生令人难以接受的腥味或苦味，且生产成本高，不适于在畜牧业中应用；微生物发酵法与酶法相比可将微生物产酶和酶解合二为一，缩短工序，降低成本，且大豆肽产品有天然的芳香味，口感好。

枯草芽孢杆菌在代谢过程种可产生大量的蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶及其他有益因子，进入生物体内后能快速定殖，在肠道内形成良好的微生态环境，具有加强动物消化能力，降解抗营养因子，增加饲料利用率，增强动物免疫力等功效。我国农业部公布的可以直接饲喂动物的饲料级微生物添加剂菌种中就包括了枯草芽孢杆菌，其作为安全益生菌，现已在饲料领域得到广泛的应用。

发明内容

为此，需要提供一种产生活性肽的枯草芽孢杆菌及其应用，枯草芽孢杆菌发酵生产的活性肽能够提高动物对饲料中营养元素的吸收利用率，提高奶、肉、蛋产量和生产能力。

为实现上述目的，本发明提供了一种产生活性肽的枯草芽孢杆菌，保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏日期是2021年9月9日，保藏号为GDMCC No.61925。

上述的产生活性肽的枯草芽孢杆菌的应用，应用于发酵制备活性肽枯草芽孢杆菌饲料添加剂。

进一步，制备活性肽枯草芽孢杆菌饲料添加剂包括如下步骤：

(1)从营养琼脂斜面培养基上挑取一种环已活化的上述的枯草芽孢杆菌接种到种子培养基中，培养条件为25-35℃，100-300r/min

(2)以植物蛋白为发酵原料，加水配制成重量百分比浓度为5-20％，调整PH值为6.0-7.0，然后在121℃高温下进行灭菌处理，冷却至30-35℃，得到液体发酵培养基；

(3)将种子液按照接种量2-4％接种于液体发酵培养基，进行发酵罐发酵，发酵时保持温度在35℃±2℃，发酵周期为24-48小时；

(4)将步骤(3)的发酵液与载体进行混匀，经过喷雾干燥后，得到活性肽枯草芽孢杆菌饲料添加剂。发酵液中菌丝和活性肽一起进行喷雾干燥，使得制备的饲料添加剂包含有活性肽和枯草芽孢杆菌。

进一步，种子培养基的配方为：酵母提取物4-10g/L、氯化钠3-10g/L、蛋白胨5-10g/L、余量为蒸馏水，pH为7.0。

进一步，所述植物蛋白为大豆蛋白和/或谷蛋白。

进一步，所述大豆蛋白包括大豆分离蛋白、豆粕、豆饼、大豆，所述谷蛋白包括玉米蛋白、玉米蛋白粉和小麦蛋白。

进一步，所述载体为糊精和/或淀粉。

进一步，所述糊精为麦芽糊精、环糊精中的至少一种，所述淀粉为玉米淀粉、小麦粉、变性淀粉中的至少一种。

进一步，活性肽饲料添加剂在饲料中的添加量为100-500g/t。

上述技术方案具有以下有益效果：

本发明中，筛选的枯草芽孢杆菌菌株具有可通过发酵，高产活性肽，并且发酵液和菌丝一起进行喷雾干燥作为饲料添加剂进行应用，活性肽饲料添加剂能够有效的提高动物对营养素(如蛋白质、矿物质、维生素等)吸收利用率、提高奶、肉、蛋产量和生产能力，且改善奶、肉、蛋的品质和风味，刺激动物免疫器官发育，提高免疫力和减少发病率，能广泛用于禽、牛、羊、猪、水产等经济动物，可作为抗生素的替代品等优质的活性肽枯草芽孢杆菌饲料添加剂。

附图说明

图1为副溶血弧菌拮抗菌株筛选的菌株的生长曲线。

图2为筛选的菌株活性肽进行拮抗副溶血弧菌的抑菌圈图。

具体实施方式

为详细说明技术方案的技术内容、构造特征、所实现目的及效果，以下结合具体实施例并配合附图详予说明。

实施例1，

产生活性肽的枯草芽孢杆菌的诱变和筛选方法包括如下步骤：

1.菌株筛选用采集到的土壤制备菌悬液，于无菌环境中，将200ul菌悬液均匀涂布于LB固体培养基平板上，于37℃恒温培养箱中培育24h。

LB固体培养基：5g酵母提取物，10g胰蛋白胨，10g氯化钠，15g琼脂粉，1L蒸馏水，调节pH为7.3±0.2，121℃高压灭菌20min。

2.菌株纯化鉴定培养基表面长满单菌落后，根据菌株外观性状，挑取疑似枯草芽孢杆菌单菌落，分别接种于LB液体培养基中，摇床37℃，200r/min培养18h。

取培育后的菌液稀释成10

LB液体培养基：5g酵母提取物，10g胰蛋白胨，10g氯化钠，1L蒸馏水，调节pH为7.3±0.2，121℃高压灭菌20min。

3.副溶血弧菌拮抗菌株筛选挑取枯草芽孢杆菌单菌落，分别接种于LB液体培养基中，摇床37℃，200r/min培养18h。取枯草芽孢杆菌菌体和发酵上清液接种于涂有副溶血弧菌的LB固体培养基上，于37℃恒温培养箱中培育24h。根据菌株生长状况及抑菌圈的形成情况，选取与副溶血弧菌有拮抗作用的菌株。

4.菌株生长曲线测定分别取与副溶血弧菌有拮抗作用的菌株，接种于100ml LB液体培养基中，37℃、230r/min摇床培养。采用吸光光度法绘制各个枯草芽孢杆菌菌株的生长曲线，每隔2h用移液器取样，测定波长600nm的OD值，并作记录，连续测定24h，绘制菌株生长曲线(如图1所示)。

5.诱变菌株悬液制备根据菌株的生长曲线，在菌株的对数生长期，取2ml菌液，4000r/min，离心5min，无菌水冲洗2次弃上清，再次加入无菌水制成菌悬液，用血球计数板测定细菌个数，后用无菌水梯度稀释，制成菌种个数在10

6.EMS诱变及乙硫氨酸抗性平板筛选在第5步骤中10

乙硫氨酸抗性平板：将过滤除菌的乙硫氨酸溶液加入灭菌后的LB固体培养基中。

7.副溶血弧菌拮抗筛选挑取乙硫氨酸平板上长出的菌落，进行液体培养后，将菌体及发酵上清液接种于涂有副溶血弧菌的固体培养基上，于37℃恒温培养箱中培育24h。

8.UV诱变和乙硫氨酸抗性平板筛选将步骤(7)下与副溶血弧菌有拮抗作用的菌株平板，置于8wUV光源20cm处诱变90s。将诱变后平板继续培养，挑取菌株，接种于LB液体培养基中摇床培养。

9.副溶血弧菌拮抗筛选将步骤(8)下培养的菌液，离心后，将菌体及发酵上清液接种于涂有副溶血弧菌的固体培养基上，于37℃恒温培养箱中培育24h。挑选拮抗作用大的菌株，用LB液体培养基扩大培养，于-20℃保藏。

10.枯草芽孢杆菌传代稳定性筛选将选取的枯草芽孢杆菌摇床培育，菌体及发酵上清液接种于涂有副溶血弧菌的固体培养基上，连续数代，检测其拮抗副溶血弧菌的稳定性，选择具有抑菌圈的菌株，如图2所示。

选择的枯草芽孢杆菌菌株，保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏日期是2021年9月9日，保藏号为GDMCC No.61925。

实施例2

利用枯草芽孢杆菌保藏号为GDMCC No.61925发酵生产富含活性肽枯草芽孢杆菌饲料的方法：

制备活性肽枯草芽孢杆菌饲料添加剂包括如下步骤：

(1)从营养琼脂斜面培养基上挑取一种环已活化的上述的枯草芽孢杆菌接种到种子培养基中，培养条件为25-35℃，100-300r/min

(2)以植物蛋白为发酵原料，加水配制成重量百分比浓度为5-20％，调整PH值为6.0-7.0，然后在121℃高温下进行灭菌处理，冷却至30-35℃，得到液体发酵培养基；

(3)将种植液按照接种量2-4％接种于液体发酵培养基，进行搅拌发酵，发酵时保持温度在35℃±2℃，发酵周期为24-48小时；

(4)将步骤(3)的发酵液与载体进行混匀，经过喷雾干燥后，得到活性肽枯草芽孢杆菌饲料添加剂成品。

本实施例的载体为麦芽糊精和玉米淀粉的混合物。

本实施例中，选用大豆分离蛋白和玉米蛋白作为发酵原料。

实施例3

与实施例2的不同点是，选用豆粕、豆饼和玉米蛋白粉作为发酵原料。

实施例4

与实施例2的不同点是，选用大豆和小麦蛋白作为发酵原料。

实施例5

与实施例2的不同点是，选用环糊精小麦粉、变性淀粉作为载体。

实施例6

160头21日龄断奶仔猪随机分成4组，每组4个重复，每个重复10头，试验时间为4周。各组试验处理如下：

试验组1：市售饲料+100g/t的实施例2的活性肽枯草芽孢杆菌饲料添加剂；

试验组2：市售饲料+300g/t的实施例2的活性肽枯草芽孢杆菌饲料添加剂；

试验组3：市售饲料+500g/t的实施例2的活性肽枯草芽孢杆菌饲料添加剂；

对照组：市售饲料；

试验初始和结束时称取早晨空腹的每组仔猪的体重，试验过程中，统计各重复组猪采食量，严格记录各处理组腹泻猪头数，对仔猪生长性能的影响如表1所示。

腹泻率(％)＝∑(腹泻仔猪数×腹泻天数)/(仔猪总头数×总试验天数)×100％。

表1活性肽枯草芽孢杆菌饲料添加剂对断奶仔猪生长性能的影响

由表1中可以看出，活性肽枯草芽孢杆菌添加到饲料中时，平均日增重较对照组有明显增加，其中试验组2，即添加300g/t活性肽枯草芽孢杆菌到基础饲料的试验组其平均日增重效果最显著，且料肉比小于其他三个试验组。添加活性肽枯草芽孢杆菌试验组的腹泻率明显低于对照组，且试验组2的腹泻率最低。因此，本发明的活性肽枯草芽孢杆菌饲料添加剂不仅能够有效提高动物对饲料中营养成分的代谢吸收，还能够提高动物的免疫力，减少腹泻的发生。

实施例7

600只37周龄产蛋率相近蛋鸡随机分成3组，每组200只，试验时间为2个月，各组试验处理如下：

试验组1：市售鸡饲料+100g/t的实施例2的活性肽枯草芽孢杆菌饲料添加剂；

试验组2：市售鸡饲料+300g/t的实施例2的活性肽枯草芽孢杆菌饲料添加剂；

试验组3：市售鸡饲料+500g/t的实施例2的活性肽枯草芽孢杆菌饲料添加剂；

对照组：市售鸡饲料；

试验过程中，每日饲喂3次，观察鸡群健康，记录试验期内日产蛋量、蛋重、采食量，计算产蛋率、料蛋比、平均蛋重。使用效果如表2所示。

表2，活性肽枯草芽孢杆菌饲料添加剂在蛋鸡饲养中的效果

由表2可知，本发明制备的活性肽枯草芽孢杆菌饲料添加剂，能够提高蛋鸡对饲料的转化利用率，同时显著提高蛋鸡的产蛋率。其中试验组2，添加活性肽枯草芽孢杆菌300g/t的效果最显著。

需要说明的是，在本文中，诸如第一和第二等之类的关系术语仅仅用来将一个实体或者操作与另一个实体或操作区分开来，而不一定要求或者暗示这些实体或操作之间存在任何这种实际的关系或者顺序。而且，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者终端设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者终端设备所固有的要素。在没有更多限制的情况下，由语句“包括……”或“包含……”限定的要素，并不排除在包括所述要素的过程、方法、物品或者终端设备中还存在另外的要素。此外，在本文中，“大于”、“小于”、“超过”等理解为不包括本数；“以上”、“以下”、“以内”等理解为包括本数。

尽管已经对上述各实施例进行了描述，但本领域内的技术人员一旦得知了基本创造性概念，则可对这些实施例做出另外的变更和修改，所以以上所述仅为本发明的实施例，并非因此限制本发明的专利保护范围，凡是利用本发明说明书及附图内容所作的等效结构或等效流程变换，或直接或间接运用在其他相关的技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围之内。