多肽制剂

技术领域

本发明涉及生物制品，尤其涉及多肽制品。

背景技术

活化的T淋巴细胞在抗肿瘤、抗感染、以及自身免疫性疾病方面起着重要作用。而T细胞的活化需要两个不同的信号。第一信号来自TCR(Tcell receptor, T细胞受体)与抗原肽-MHC(major histocompatibility complex,主要组织相容性复合体)复合物相互作用,引发系列抗原特异性的T细胞反应，包括细胞内钙调磷酸酶、MAPK和NF-κB二条信号通路的活化，导致的下游分子事件启动多种基因表达，包括IL-2、IL-2L受体(CD25)、CD69和CD154等。第二信号来自 APC(抗原呈递细胞)上的B7家族分子与其在T细胞上的配体CD28家族分子相结合产生的协同刺激信号,如B7-1、B7-2与CD28、CTLA-4结合,该途径被称为经典的B7途径。缺乏第二信号可使T细胞无能,适宜的共刺激信号可以降低T 细胞活化时对第一信号的需求,抑制性的共刺激信号可以减弱免疫反应或导致免疫耐受。

多肽疫苗是用化学合成法或基因工程手段合成病原微生物的保护性多肽或表位并将其连接到大分子载体上，再加入佐剂制成的疫苗。相对于常规疫苗和基因重组疫苗，多肽/表位疫苗不含有对动物构成潜在威胁的病毒基因组信息，不存在发生病毒基因与宿主细胞基因的整合或重组，不会对动物或人类构成潜在的威胁，是一种安全的疫苗。多肽疫苗具有特异性强、安全性高和容易保存等优点，并可利用多抗原表位的线性串联、MAP空间模式、脂肽模式和表位基因重组方式进行优化，增强疫苗的免疫效果。猫来源的过敏原多肽免疫机体，成功诱导调节性T细胞的产生，形成免疫耐受，并已进入临床Ⅱ期试验。利用髓磷脂来源的表位诱导调节性CD8+T细胞，可抑制小鼠自身免疫性脑脊髓炎。动物实验中，靶向血管紧张素Ⅱ的多肽疫苗应用于高血压和心力衰竭的预防和治疗已取得一定疗效，利用载脂蛋白B100来源的多肽诱导特异性CTL应答可减轻动脉粥样硬化的形成。

单体MHC/抗原肽复合物和TCR亲和力低，不能直接用于表位特异性CTL (细胞毒性T淋巴细胞)的检测。利用半胱氨酸的巯基与生物素的结合，将1个荧光标记的链亲和素与4个生物素标记的MHC/抗原肽复合物偶联，形成 MHC/抗原肽-tetramer(四聚体)。Tetramer极大提高MHC/抗原肽稳定性及其与 TCR的亲合力，在与TCR结合后，可通过流式细胞仪进行检测。有研究表明利用四聚体染色技术流式细胞分析检测鉴定得到了多条具有HLA限制的HTNV (汉滩病毒)-GP(糖蛋白)CTL表位。

CoViD-19是RNA-Virus，整个遗传体的碱基排序长度为29,903个，据推断CoViD-19制造出的推定蛋白质(CDS,Coding Sequence)共10种。

CoViD-19所创造的蛋白质是构成病毒粒子的物质(主要是蛋白质或糖蛋白质等)，因此，从理论上讲，可以被健康人体的免疫系统检测出来，自然治愈的概率较高。只是，由于CoViD-19是一种比较新奇的变种，所以我们的免疫系统对CoViD-19的认知和应对还需要很长时间，如果免疫系统在启动前发展成严重的感染或疾病状态，就会导致致命性的结果。正如我们人类已经多次经历过的那样，如果能够迅速或轻松地生产出CoViD-19的“疫苗”，就很有可能提前预防目前全世界因CoViD-19的传染性/致死性/恐惧而面临的危机。

虽然目前对人类的免疫系统还不是全都理解的状态，但从一些众所周知的事实中可以看出，在“外来感染源(病菌或病毒)”制造的蛋白质中，有些部分由于我们的免疫系统已经能够明确识别，所以可以制造“免疫防御机制”。

免疫体系系统中，MHC-I/MHC-II信号路径是比较详细的免疫体系，最近受到瞩目的人工智能(AI)使人体接触到的积累数据也比较丰富。我们的研究人员一直在AI-Deep-Learning技术研究，这一技术能够学习和预测利用MHC-I激活免疫系统，最终通过免疫调节，调节各种疾病的重要“肽免疫抗原-Peptide ImmunoAntigen”基于这样的理解和研究，我们的研究人员通过AI-Deep-Learning 技术手段研究MHC-I激活免疫系统，针对CoViD-19病毒的蛋白结构，预测可以被我们免疫系统识别的多肽，用于病毒的诊断和治疗具有重要意义。

发明内容

CoViD-19共可制出10种蛋白质，我们的研究人员通过AI-Deep-Learning技术手段以激活MHC-I免疫系统为目标，针对CoViD-19病毒的蛋白结构，预测的可能性最高的肽序列的长度大部分由9～14个氨基酸构成，共37个(见表1)。

据此：

本发明第一方面提供一种具有免疫激活作用的多肽，所述多肽的氨基酸序列编码为SEQ ID NO:1-37(见表1)或与其氨基酸序列具有至少95％序列一致性的衍生多肽中的一种或多种。

进一步，其中所述多肽的氨基酸序列编码为SEQ ID NO：8、SEQ ID NO： 11、SEQ IDNO：17、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：23、SEQ ID NO：30、SEQ ID NO：32、SEQ ID NO：33或与其氨基酸序列具有至少95％序列一致性的衍生多肽中的一种或多种。

本发明第二方面提供一种病毒治疗组合物，所述组合物包含氨基酸序列编码为SEQ ID NO:1-37(见表1)或与其氨基酸序列具有至少95％序列一致性的衍生多肽的一种或多种。所述衍生多肽能够与SEQ ID NO:1-37中相应多肽具有相同或相似的免疫激活作用，优选衍生多肽氨基酸序列的一致性达到98％以致99％。

进一步，所述病毒治疗组合物优选包含SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：23、SEQ ID NO：30、SEQ ID NO：32、SEQ ID NO：33或与其氨基酸序列具有至少95％序列一致性的衍生多肽的一种或多种。所述衍生多肽能够与相应的SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：23、SEQ ID NO：30、SEQ ID NO：32、SEQ ID NO：33的多肽具有相同或相似的免疫激活作用，优选衍生多肽氨基酸序列的一致性达到98％以致99％。

本发明第二方面提供一种病毒检测组合物，所述组合物包含氨基酸序列编码为SEQ ID NO:1-37(见表1)的多肽序列或与其氨基酸序列具有至少95％序列一致性的衍生多肽的一种或多种。所述衍生多肽能够与SEQ ID NO:1-37中相应多肽具有相同或相似的免疫激活作用，优选衍生多肽氨基酸序列的一致性达到98％以致99％。

进一步，所述病毒检测组合物优选包含SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：23、SEQ ID NO：30、SEQ ID NO：32、SEQ ID NO：33或与其氨基酸序列具有至少95％序列一致性的衍生多肽的一种或多种。所述衍生多肽能够与相应的SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：23、SEQ ID NO：30、SEQ ID NO：32、SEQ ID NO：33的多肽具有相同或相似的免疫激活作用，优选衍生多肽氨基酸序列的一致性达到98％以致99％。

本发明第三方面提供一种载体(例如质粒和重组病毒载体)以及包含载体的宿主细胞，他们表达氨基酸序列编码为SEQ ID NO:1-37(见表1)个的多肽或其衍生多肽的一种或多种，优选表达SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：23、SEQ ID NO：30、SEQ ID NO：32、SEQ ID NO：33或与其氨基酸序列具有至少95％序列一致性的衍生多肽的一种或多种。所述衍生多肽能够与相应的序列SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：23、SEQ ID NO：30、SEQ ID NO：32、SEQ IDNO：33的多肽具有相同或相似的免疫激活作用，优选衍生多肽氨基酸序列的一致性达到98％以致99％。

本发明第四方面提供一种在受试者上进行以下的一种或多种的方法：

a:上调细胞因子；

b:诱导T细胞的增殖；

c：促进抗原特异性T细胞免疫；

d：促进CD4+和/或CD8+T细胞活化；

该方法包括向该受试者给予任何一种本发明所述的病毒治疗组合物，优选病毒治疗组合物包含SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：23、SEQ ID NO：30、SEQ ID NO：32、SEQ ID NO：33或与其氨基酸序列具有至少95％序列一致性的衍生多肽的一种或多种。所述衍生多肽能够与相应的SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：11、SEQID NO：17、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：23、SEQ ID NO：30、SEQ ID NO：32、SEQ ID NO：33的多肽具有相同或相似的免疫激活作用，优选衍生多肽氨基酸序列的一致性达到98％以致99％。

进一步，本发明提供一种用于治疗或预防免疫系统相关病症的方法，该方法包括向一个对其有需要的受试者给予一个有效量的任何一种本发明的病毒治疗组合物，所述免疫相关病症包括病毒感染，所述病毒感染包括冠状病毒感染、流感病毒感染、肝炎病毒感染等。

进一步，这种治疗与另一个用于治疗所述病毒感染的方法联合使用，所述另一个治疗病毒感染的方法包括现有已知的其他已经验证的有效方法，如侵入/融合抑制剂：阿帕韦洛、马拉韦罗等；整合酶抑制剂：雷特格韦；成熟抑制剂: Bevirimat；神经氨酸酶抑制剂：奥司他韦，扎那米韦，帕拉米韦等。

本发明所述的病毒进一步包括任何能够引发免疫应答的病毒肽、多肽蛋白以及任何能够引发免疫反应的病毒微生物，如甲型肝炎本年度、乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、单纯疱疹病毒、HIV(人类免疫缺陷病毒)、HPV、流行性感冒病毒、呼吸道合胞病毒等。

本发明所述的给予受试者的药物组合物进一步包括以任何方式向受试者转移、递送、引入或运输药物或其药剂，这些方式方式包括口服、局部接触、静脉给药、肌肉内给药、鼻内、皮下给药等方式。本发明还考虑使用装置或期限来施用药剂。进一步，所述药剂包含药学可接受的赋形剂，如任何载体、稀释剂、佐剂或其他。

附图说明

图1：检测肽-HLA-I复合体的形成

图2：四聚体与CD8+T细胞在2小时的结合百分比

图3：四聚体与CD8+T细胞在4小时的结合百分比

图4：四聚体在2小时激活CD8+T细胞情况

图5：四聚体在4小时激活CD8+T细胞情况

具体实施方式

本发明用下面的实施例进一步说明本发明。

实施例1：肽-HLA-I复合体形成

所述实验按照immunaware厂家的easYmer HLA-A*02:01 MHC Tetramers Kit 试剂盒的Monomer/Tetramer production protocol实验操作流程进行。

1.称取适量待测样品肽(见表1)，二甲基亚砜溶解至1mM。

2.阳性对照肽(阳性对照肽由试剂盒immunaware easYmer HLA-A*02:01 MHCTetramers Kit提供)，待测样品肽用双蒸水稀释至25μM。

3.按如下表格(见表2)在冰上配制各反应管，用移液枪反复吹打充分混匀，避免产生气泡。

4.密封带密封后18度孵育48小时待用。

表1：多肽序列

表2：肽-HLA-I复合体制备条件

实施例2：基于流式细胞术检测肽-HLA-I复合体的形成

1、取4μl肽-HLA-I复合体溶液加到46μl的稀释缓冲液中并混匀。

2、取25μl肽-HLA-I复合体稀释液加到50μl的稀释缓冲液中并混匀。

3、取40μl步骤2稀释液至新的EP管。

4、链霉亲和素包被磁珠(6-8μm)，用稀释缓冲液稀释45倍，每管加20μl，充分混匀。

5、37度摇床孵育1小时。

6、每管加入160μl FACS溶液。

7、700g离心3min后弃上清。

8、200μl FACS溶液重悬，700g离心3min后弃上清，重复此步骤，再洗两次。

9、用FACS溶液200倍稀释PE标记的抗人单克隆抗体BBM.1。

10、每管加入50μl抗体稀释液重悬，4度避光孵育30min。

11、加入150μl FACS溶液，700g离心3min后弃上清。

12、200μl FACS溶液重悬，700g离心3min后弃上清，重复此步骤，再洗两次。

13、200μl FACS溶液重悬，用流式细胞仪检测分析。

结果显示(见图1)：18#、23#、30#多肽的荧光强度与阳性对照肽的荧光强度相似，表明18#、23#、30#多肽可以与HLA-I成功结合。

实施例3：四聚物相关：

本实验按照按照immunaware厂家的easYmer HLA-A*02:01 MHC Tetramers Kit试剂盒的Monomer/Tetramer production protocol实验操作流程进行。

四聚体的制备。

1、取6μL已制备好的500nM多肽18#、23#、30#和HLA-I单体复合物于 0.2mL离心管中，加入0.48μL Streptavidin-BV421(BD；Cat#563259；0.1mg/ml)。

2、混合均匀后，4℃避光孵育1个小时。

分离人外周血单个核细胞(PBMC)

1、取人的静脉抗凝全血(EDTA)，用等体积生理盐水稀释。

2、在15mL离心管中加入适量淋巴细胞分离液，将稀释后的血液平铺到分离液液面上方，保持两液面界面清晰。

3、室温，水平离心600g，35min。

4、离心后可看见管内分为三层，上层为血浆和生理盐水，下层主要为红细胞和粒细胞，中层为淋巴细胞分离液。在上、中层界面处有一以单个核细胞为主的白色云雾狭窄带，单个核细胞包括淋巴细胞和单核细胞，此外，还有血小板。

5、用移液器插到云雾层，吸取单个核细胞。置入另一15mL离心管中，加入5倍以上体积的生理盐水，离心250g，10min，洗涤细胞1次。

6、加入10ml PBS或细胞洗涤液，取10μL计数，离心250g，10min，洗涤细胞1次。

四聚体与PBMC共孵育

1、取新的1.5mL离心管，每管加入2*10^6的PBMC，加入200μL FACS 缓冲液，离心700g，3min，去掉上清。

2、用FACS缓冲液将四聚物稀释到300nmol，每管用40μL稀释后的四聚物重悬PBMC，37℃避光孵育2-4小时。

3、预冷的FACS缓冲液洗涤细胞一次。

4、加入流式抗体(CD3-percp-cy5.5，CD8-APC，CD4-PE-cy7，CD69-PE，购自BioLegend公司)4℃染色30min。

5、FACS缓冲液洗涤细胞一次，上机检测。

结果显示四聚体与PBMC共孵育2小时后，流式结果检测到阳性对照肽四聚体与CD8+双阳性的T细胞，但未检测到18#、23#、30#多肽四聚体与CD8+ 双阳性的T细胞，表明四聚体与PBMC共孵育2小时后阳性对照肽四聚体与 CD8+T细胞结合，18#、23#、30#多肽四聚体未与CD8+T细胞结合(见图2)；

四聚体与PBMC共孵育4小时后，流式结果检测到阳性对照肽、23#多肽四聚体与CD8+双阳性的T细胞，但未检测到18#、30#四聚体与CD8+双阳性的T 细胞，表明四聚体与PBMC共孵育4小时后18#、30#多肽四聚体未与CD8+T 细胞结合，阳性对照肽四聚体、23#多肽四聚体与CD8+T细胞结合(见图3)。

结果显示四聚体与PBMC共孵育2小时后，流式结果检测到阳性对照肽四聚体与CD8+T细胞结合的细胞中有CD69+阳性的T细胞，但未检测到18#、23#、 30#多肽四聚体与CD8+T细胞结合的T细胞中有CD69+阳性的T细胞，表明四聚体与PBMC共孵育2小时后阳性对照肽四聚体能够显著激活CD8+T细胞，18#、 23#、30#多肽四聚体不能激活CD8+T细胞。(见图4)

结果显示四聚体与PBMC共孵育4小时后，流式结果检测到23#多肽四聚体与CD8+T细胞结合的T细胞中有CD69+阳性的T细胞，但未检测到18#、30# 多肽四聚体与CD8+T细胞结合的T细胞中有CD69+阳性的T细胞，表明四聚体与PBMC共孵育4小时后阳性对照肽、18#、30#多肽四聚体不能激活CD8+T 细胞，23#多肽四聚体能够显著激活CD8+T细胞。(见图5)。

序列表

<110> 青岛海洋生物医药研究院

<120> 多肽制剂

<160>37

<170> Patent In Version 2.1

<210> 1

<211>12

<212> PRT

<213>“人工序列”

<400> GVAPGTAVLRQW

<210> 2

<211>11

<212>PRT

<213>“人工序列”

<400> VAPGTAVLRQW

<210> 3

<211>10

<212>PRT

<213>“人工序列”

<400> VAIKITEHSW

<210> 4

<211>10

<212>PRT

<213>“人工序列”

<400> GRVDGQVDLF

<210> 5

<211>11

<212>PRT

<213>“人工序列”

<400> GRVDGQVDLFR

<210>6

<211>10

<212>PRT

<213>“人工序列”

<400> KRFKESPFEL

<210>7

<211>9

<212>PRT

<213>“人工序列”

<400> KRVDWTIEY

<210>8

<211>14

<212>PRT

<213>“人工序列”

<400> VTDVTQLYLGGMSY

<210>9

<211>9

<212>PRT

<213>“人工序列”

<400> IYNDKVAGF

<210>10

<211>10

<212>PRT

<213>“人工序列”

<400> VENPDILRVY

<210>11

<211>9

<212>PRT

<213>“人工序列”

<400> KLFDRYFKY

<210>12

<211>10

<212>PRT

<213>“人工序列”

<400> KSAGFPFNKW

<210>13

<211>9

<212>PRT

<213>“人工序列”

<400> VENPHLMGM

<210>14

<211>10

<212>PRT

<213>“人工序列”

<400> QEYADVFHLY

<210>15

<211>10

<212>PRT

<213>“人工序列”

<400> LTNDNTSRYW

<210>16

<211>13

<212>PRT

<213>“人工序列”

<400> ARFPKSDGTGTIY

<210>17

<211>11

<212>PRT

<213>“人工序列”

<400> ISMDNSPNLAW

<210>18

<211>9

<212>PRT

<213>“人工序列”

<400> FLLPSLATV

<210>19

<211>12

<212>PRT

<213>“人工序列”

<400> RTVYDDGARRVW

<210>20

<211>11

<212>PRT

<213>“人工序列”

<400> TVYDDGARRVW

<210>21

<211>9

<212>PRT

<213>“人工序列”

<400> VSFLAHIQW

<210>22

<211>10

<212>PRT

<213>“人工序列”

<400> RRVVFNGVSF

<210>23

<211>11

<212>PRT

<213>“人工序列”

<400> YLFDESGEFKL

<210>24

<211>9

<212>PRT

<213>“人工序列”

<400> LYDKLVSSF

<210>25

<211>10

<212>PRT

<213>“人工序列”

<400> TTDPSFLGRY

<210>26

<211>10

<212>PRT

<213>“人工序列”

<400> TEIDPKLDNY

<210>27

<211>11

<212>PRT

<213>“人工序列”

<400> TEIDPKLDNYY

<210>28

<211>11

<212>PRT

<213>“人工序列”

<400> AEAELAKNVSL

<210>29

<211>12

<212>PRT

<213>“人工序列”

<400> IALKGGKIVNNW

<210>30

<211>9

<212>PRT

<213>“人工序列”

<400> LLLDRLNQL

<210>31

<211>13

<212>PRT

<213>“人工序列”

<400> ITVEELKKLLEQW

<210>32

<211>10

<212>PRT

<213>“人工序列”

<400> EELKKLLEQW

<210>33

<211>9

<212>PRT

<213>“人工序列”

<400> NRFLYIIKL

<210>34

<211>10

<212>PRT

<213>“人工序列”

<400> KRFDNPVLPF

<210>35

<211>10

<212>PRT

<213>“人工序列”

<400> TEKSNIIRGW

<210>36

<211>13

<212>PRT

<213>“人工序列”

<400> RSYLTPGDSSSGW

<210>37

<211>13

<212>PRT

<213>“人工序列”

<400> YRFNGIGVTQNVL