多肽的抗成瘾及其复发的用途、复合体及多肽

技术领域

本发明涉及物质成瘾领域，具体涉及多肽在预防和治疗成瘾或成瘾复发中的用途。

背景技术

世界卫生组织(World Health Organization,WHO)对物质成瘾定义为：尽管了解并经历了物质的有害作用，但仍反复地使用该物质。物质成瘾是一种慢性、复发性疾病，特征在于物质使用失控、对物质的强迫性寻觅和渴求、不顾不良后果坚持使用以及对物质的身体和/或心理上的依赖。一般来说，物质成瘾遵循忍耐、戒断、强迫性用药行为、觅药行为、成瘾行为实施和复发的过程。

物质成瘾已成为全球关心的医学和社会问题，其对成瘾者和社会都具有重大社会和经济影响。例如，物质成瘾常与暴力犯罪和传染性疾病传播联系紧密。又例如，物质成瘾会使成瘾者的劳动力部分或全部丧失，从而给个体、家庭和社会带来负面影响。具体地，作为全球最常见的滥用物质之一，酒精中毒导致严重的肝和心血管疾病并易产生重度精神障碍、社会问题和不良后果，包括家庭解体、悲惨事故和工作效能降低。

在对成瘾对象进行戒毒或戒断治疗时，常采用一些戒断药物，但这些药物或仍存在局限性。

例如，在阿片类药物所造成的成瘾的情况，常采用的方式有：(i)替代疗法，用美沙酮替代是目前最常用的戒毒方法；(ii)阿片受体拮抗剂，纳曲酮或纳洛酮进行催促戒断；(c)非阿片类药物治疗，用可乐定和洛非西定来抑制戒断症状。虽然这些方式可以使得成瘾对象在停用成瘾物质不再表现出生理上的不适(例如寒战、呕吐、震颤等)，但是研究表明，这些药物并不能降低成瘾对象的精神依赖(或心理依赖)。

又例如，已测试了不同类别药物(如纳曲酮、阿坎酸、昂丹司琼、双硫仑、Y-羟基丁酸(GHB)和托吡酯)对酒精成瘾的潜在治疗效果。这些药物治疗剂中的几种如纳曲酮、阿坎酸和双硫仑被证实有一定作用并被批准用于治疗酒精中毒。这些药物中，纳曲酮目前被认为是药理学较佳的选择。然而，尽管有一些有希望的结果，但是这些药物(包括纳曲酮)中没有一种在酒精中毒方面足够有效并且预后仍较差。

据此，在抗物质成瘾领域，存在着开发对安全有效的药物的强烈需求，以为物质成瘾及其复发提供更丰富、更佳的治疗或预防策略。

发明内容

为达到上述目的，发明人对成瘾的分子机制进行大量研究，发现针对一种新的多肽能够破坏D2受体与NMDA受体的相互作用。

具体而言，DA受体是通过其相应的膜受体发挥作用的一种位于生物体内的受体。DA受体可分为五种：D1、D2、D3、D4和D5。D2受体(D2R)在脑内表达广泛。

NMDA受体(NMDAR)不仅在神经系统发育过程中发挥重要的生理作用，如调节神经元的存活、调节神经元的树突、轴突结构发育及参与突触可塑性的形成等；而且对神经元回路的形成，多种神经精神疾病的发病中亦起着关键的作用，有资料表明NMDA受体是学习和记忆过程中一类至关重要的受体。NMDAR主要由3种不同的亚基构成，分别为NR1、NR2和NR3。其中NR2亚基有4种不同的亚单位，即NR2A、NR2B、NR2C和NR2D。

发明人证实本发明的多肽能够有效治疗成瘾物质的成瘾并抑制或治疗复发，从而完成本发明。

据此，在第一方面，本发明提供了一种多肽，其由如SEQ ID NO:1所示序列中的至少11个连续氨基酸残基组成，并且含有SEQ ID NO:2所示的序列。此外，还提供了本发明的多肽在制备用于预防和/或治疗物质成瘾的药物中的用途。

如本文所使用的，术语“治疗”是指在患者中引起希望的或有益的作用，所述希望的或有益的作用可包括减少疾病一个或更多个症状的频率或严重性，或者阻抑或抑制疾病、病症或失调的进一步发展。

如本文所使用的，术语“预防”是指防止或延缓疾病的发生，或者防止其临床或亚临床症状的出现。

如本文所使用的，“物质成瘾”是指以物质使用失控、对物质的强迫性寻觅和渴求、不顾不良后果坚持使用以及对物质的身体和/或心理上的依赖为特征的慢性、复发性疾病。物质成瘾可例如为首次因该物质导致的成瘾，或指物质成瘾的形成和/或表达。

在示例性的实施方式中，本发明的多肽由如SEQ ID NO:1所示序列中的至少11个、至少12个、至少13个、至少14个或至少15个连续氨基酸残基组成。

在示例性的实施方式中，本发明的多肽的序列由SEQ ID NO:1(KIYIVLRRRRKRVNT)中的第1-15位、第1-14位、第1-13位、第2-15位、第2-14位、第2-13位、第3-15位、第3-14位或第3-13位组成。

在具体的实施方式中，本发明的多肽的序列如SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3或SEQID NO:4所示。

在一些实施方式中，成瘾物质例如可选自以下项组成的组：吗啡、尼古丁、酒精、可卡因、可待因、双氢可待因、氢吗啡酮、羟考酮、美沙酮、吗啡、芬太尼和哌替啶。

在第二方面，本发明提供了本发明的多肽在制备用于预防和/或治疗物质成瘾复发的药物中的用途。

如本文所使用的，“复发”，在合适的情况下也称为“复吸”，是指成瘾者在戒断后，又开始使用戒断前所使用的成瘾物质。复发可因环境(场合)、成瘾物质和/或应激(压力)因素而引发。

在示例性的实施方式中，本发明中的复发是由环境因素引起的。

在示例性的实施方式中，本发明中的复发是由成瘾物质因素引起的。

在示例性的实施方式中，本发明中的复发是由应激因素引起的。

本发明人意外地发现本发明的多肽能够阻断D2R/NR2B复合物的结合，能够消除成瘾物质的形成。

再者，本发明的多肽能够消除由环境、成瘾物质、应激因素引起的成瘾复发，甚至在高/低剂量的成瘾物质诱导的情况下均产生统计学意义上的显著效果，具有很好的临床开发价值。

在第三方面，本发明提供了一种核酸分子，其编码本发明的多肽。此外，还提供了本发明的核酸分子在制备用于治疗和/或预防物质成瘾的药物中的用途，或者本发明的核酸分子在制备用于治疗和/或预防物质成瘾复发的药物中的用途。

本发明的核酸分子用于生产本发明的多肽，根据所采用的表达系统，本领域技术人员能够适当地对核酸分子的序列进行调整。

在示例性的实施方式中，所述核酸分子具有如SEQ ID NO:5所示的序列。

在第四方面，本发明提供了一种表达载体，其包含本发明的核酸分子。此外，还提供了本发明的表达载体在制备用于治疗和/或预防物质成瘾的药物中的用途，或者本发明的表达载体在制备用于治疗和/或预防物质成瘾复发的药物中的用途。

可以利用多种已知方法将本发明的核酸序列插入到表达载体中。例如，可将核酸分子插入适当的限制性内切核酸酶位点。用于克隆、分离、扩增及纯化的标准技术，及操作中涉及DNA连接酶、DNA聚合酶、限制性内切核酸酶等的酶学反应以及各种分离技术，属于本领域技术人员已知并常用的技术。

在第五方面，本发明提供了一种宿主细胞，其包含本发明的核酸分子或表达载体。此外，还提供了本发明的宿主细胞在制备用于治疗和/或预防物质成瘾的药物中的用途，或者本发明的宿主细胞在制备用于治疗和/或预防物质成瘾复发的药物中的用途。

可以使用多种表达系统，如原核表达系统和真核表达系统中的表达载体和宿主细胞来生产本发明的多肽。接下来以哺乳动物表达系统为例进行说明，宿主细胞可包括猴肾成纤维细胞的COS-7细胞系以及能够表达相容性载体的其它细胞系，如C127、3T3、CHO、Hela和BHK细胞系。哺乳动物表达载体应包含复制起点、合适的启动子和增强子以及任何必需的核糖体结合位点、聚腺苷酸化位点、剪接供体和受体位点、转录终止序列以及5’侧翼非转录序列。源自例如SV40剪接和聚腺苷酸化位点的DNA序列可以用于提供所需的非转录性遗传元件。可以通过本领域技术人员熟悉的多种方法，包括但不限于例如磷酸钙转染、DEAE-葡聚糖介导的转染或电穿孔，将表达载体引入宿主细胞中。

在第六方面，本发明提供了一种复合体，其包括本发明的多肽及连接于其上的用于通透血脑屏障的(转运)载体。

在示例性的实施方式中，用于通透血脑屏障的载体可以是：HIV-1Tat蛋白、胰岛素、阳离子化白蛋白、抗大鼠转铁蛋白受体的单抗(OX26)、人胰岛素受体鼠源性单抗(HIRMAb)、Penetratin、Tat蛋白的转导结构域、Pep-1肽、S4

本发明的多肽可通过适当的连接技术与用于通透血脑屏障的载体连接。示例性的连接技术可以是亲和素-生物素技术、基于聚乙二醇(PEG)的空间臂技术、融合蛋白技术等。例如，在使用HIV-1Tat蛋白的转导结构域作为通透血脑屏障的载体的情况下，可以通过融合蛋白技术，直接将本发明的多肽与Tat蛋白的转导结构域相连。

在一些实施方式中，使用融合蛋白技术的情况下，也可以使用连接子(Linker)将本发明的多肽与用于通透血脑屏障的载体相连。示例性的连接子可以是带有甘氨酸的柔性连接子，如G、GSG、GSGGSG、GSGGSGG、GSGGSGGG、GGGGSGGG、GGGGS和SGG等。

附图说明

图1示出了小鼠海马组织进行免疫共沉淀的结果；

图2示出了实施例3中所涉及的片段在D2R上的位置；

图3示出了实施例3各片段GST-pulldown实验的结果；

图4示出了经KT多肽处理的CPP小鼠和BS小鼠海马组织的免疫共沉淀结果；

图5示出了实施例5的实验方案设计；

图6示出了实施例5的CPP评分结果；

图7示出了实施例6的实验方案设计；

图8示出了实施例6的CPP评分结果；A：第10天各组测量结果；B：TAT-D2R-KT组第11天与第10天的比较结果；

图9示出了实施例7的实验方案设计；

图10示出了实施例7第10天的CPP测量结果；

图11示出了实施例7测试1的CPP测量结果；

图12示出了实施例7测试2的CPP测量结果；

图13示出了实施例7测试3的CPP测量结果；

图14示出了实施例7测试4的CPP测量结果；

图15示出了实施例8的实验方案设计；

图16示出了实施例8测试1的BS测量结果；A：测试1的BS移动距离结果；B：测试2的BS移动距离结果；C：测试3的BS移动距离结果；

图17示出了实施例9中制备的不同多肽对吗啡所致小鼠CPP的影响，其中，n＝12；##：P<0.01，相对于生理盐水组；**：P<0.01，相对于吗啡组；

图18示出了实施例9中制备的不同多肽对可卡因所致小鼠行为敏化的阴性，其中，n＝10；*：P<0.05，**：P<0.01，相对于veh组；

图19示出了实施例9中制备的不同多肽对酒精所致小鼠行为敏化的阴性，其中，n＝10；##：P<0.01，相对于生理盐水组；**：P<0.01，相对于酒精组。

具体实施方式

目前，如何消除物质成瘾或防止其复发从而避免其给个体、家庭和社会带来重大负担，已成为全球关心的医学和社会问题。其中，令人感兴趣的是，Liu等(Modulation ofD2R-NR2B Interactions in Response to Cocaine,Neuron 52,897–909,December 7,2006)报道了由可卡因带来的多巴胺刺激增强了体内新纹状体中D2R和NMDA受体NR2B亚基之间的异受体复合物的形成；通过研究D2R与NR2B相互作用，发现D2R中负责形成D2R-NR2B复合物的区域位于IL3；进一步的竞争实验表明含有IL3中含有十个残基的基序(TKRSSRAFRA，T225-A234)是阻碍D2R与NR2B结合的关键。

值得注意的是，Liu等对来自D2R的IL3的多种多肽进行了测试，结果表明(见该文献中图3M和3N)：仅在含有上述基序T225-A234的情况下，多肽(P1、P2、P3和P5)成功阻碍了D2R与NR2B结合；而在缺少这一基序的情况下，多肽(P4，I210-K226)无阻碍效果；同时，将含有该基序的多肽P5的序列打乱所得到的对照多肽P6同样不能阻碍D2R与NR2B结合。据此，Liu等认为结合是序列特异性的，TKRSSRAFRA是潜在的结合基序。

然而，本发明人在研究中却意外地发现：与Liu等的报道不同，D2R的IL3区域中多肽K211-T225(其与被认定为不能阻碍D2R与NR2B结合多肽P4相比，缺失N端和C端各一个残基；同时不包含关键基序TKRSSRAFRA)成功减少了D2R与NR2B的相互作用。

在进一步研究工作的基础上，本发明人确证D2R的IL3区域中多肽K211-T225及其N末端和C末端缺失变体能够在成瘾模型中逆转成瘾行为变化。

在整个说明书中，除非另有特别说明，本文使用的术语应理解为如本领域中通常所使用的含义。因此，除非另有定义，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域技术人员的一般理解相同的含义。若存在矛盾，本说明书优先。

下面将结合实施例对本发明的实施方式进行详细描述，本发明的优点和各种效果将由此更加清楚地呈现。本领域技术人员应理解，这些具体实施方式和实施例是用于说明本发明，而非限制本发明。

实施例中未注明具体条件的，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产产商的，为可以通过商购获得的常规产品。

除另有说明外，实施例中所使用的实验动物为成年C57/BL6J雄性小鼠(8周龄，体重25-30g)，购买自中国广州医学实验动物中心。小鼠饲养条件为12小时光照/12小时黑暗循环，在整个过程中可以自由获得饮食和水。在实验操作前，所有小鼠在动物室适应一周。

实施例中采用ImageJ和图像实验室软件(ImageJ1.30)对条带和形态学数据进行分析，采用GraphPadPrism8软件进行统计分析。样本量的选择如前所述(Arifin和Zahiruddin，2017；Mead等，2012)。所有实验均独立重复三次。未采用随机化方法/盲法。数据以平均±SEM表示。不同组采用单因素或双因素方差分析，随后进行posthoc Tukey多重比较检验。P<0.05认为具有显著性。除非另有说明，*：p<0.05，**：p<0.001，***：p<0.0001，且****：p<0.000001。

实施例1体内形成D2R/NR2B复合物的确认

使用来自海马组织的蛋白质样本(100-500μg的蛋白质)进行共免疫沉淀。NR2B和D1R或D2R分别使用抗NR2B和D2R、D2R或NR2B和25μl蛋白A/G+琼脂糖珠浆(SantaCruz生物技术，sc-2001)沉淀。

随后蛋白质在8％的SDS-PAGE凝胶上分离，并用抗NR2B和D2R的小鼠抗体进行检测。采用HRP偶联的二抗和增强化学发光法检测蛋白。使用图像实验室软件对条带进行密度分析。

为了评估D2R和NR2B是否可以形成蛋白复合物，首先按照上述共免疫沉淀方法，并检测了D2R和NR2B在正常小鼠海马组织中可能的相互作用，结果如图1所示。

由图1可知，D2R抗体成功地从海马蛋白混合物中沉淀了NR2B，而D1R抗体未沉淀NR2B，表明D2R/NR2B蛋白偶联。

实施例2复合物病理意义的验证

接下来，为了确定了D2R和NR2B的相互作用状态是否与物质成瘾有关，按照实施例1中的方法，以吗啡诱导的位置偏爱(CPP)和行为敏化(BS)的小鼠海马组织为样本进行免疫共沉淀实验，结果如图1所示。

由图1可知，在CPP和BS的小鼠海马组织中，D2R和NR2B偶联均显著增加，证实D2R/NR2B复合物的形成可能在物质成瘾中起病因性作用。

实施例3复合物相互结合位点的探寻

为了寻找D2R和NR2B之间的物理相互作用位点，首先，通过D2R全长cDNA克隆(Genbank登录号：M29066.1)获得D2R的CT区域(T428-C443)和D2R的第三胞内环(IL3)区域(K211-Q373)的cDNA片段。将这些片段亚克隆到pGEX-4T-3质粒(优宝，货号VT1255)的BamH1/EcoR1或BamH1/Xho1位点。适当时加入起始蛋氨酸残基和终止密码子。对所有构建物都进行了重测序以确认适当地实现了剪接融合。使用E.coli BL21活性细胞(康体健康生命技术公司，no：KTSM104L)进行表达，并从细菌裂解液中纯化得到含有D2R的IL3区域的GST融合蛋白(GST-D2R-IL3)、含有D2R的CT区域的GST融合蛋白(GST-D2R-CT)。其中，IL3区域和CT区域的编码序列在D2R上的具体位置如图2所示。

将溶解的海马提取物500μg用1×PBS/0.1％Triton X-100稀释，与仅饱和有GST蛋白或所制备的15μg GST融合蛋白的20μl蛋白GST树脂(转基因生物技术，货号N21220，中国北京)在4℃孵育过夜。用1×PBS/0.1％Triton X-100洗涤珠子1-8次。结合蛋白用2×上样缓冲液洗脱，SDS-PAGE分离，用各自的抗体进行免疫印迹，结果如图3中A所示。

由图3中A可知，D2R的IL3区域亲和沉淀了NR2B，表明D2R的IL3区域参与了相互作用。

接下来，为了进一步挖掘D2R与NR2B之间的相互作用序列/位点，将该IL3区域分割为：D2R的KVC(K211-V270)区域、D2R的ES(E271-S321)区域和D2R的PQ(P322-Q373)区域，这些区域在D2R上的具体位置如图2所示。

按照本实施例中的方法，使用含有D2R的KVC区域的GST融合蛋白(GST-D2R-KVC)、含有D2R的ES区域的GST融合蛋白(GST-D2R-ES)、含有D2R的PQ区域的GST融合蛋白(GST-D2R-PQ)进行pulldown分析，免疫印迹结果如图3中B所示。

由图3中B可知，D2R的KVC区域亲和沉淀了NR2B，表明D2R的KVC区域参与了相互作用。

进一步地，将该KVC区域分割为：D2R的KT(K211-T225)区域、D2R的KL(K226-L240)区域、D2R的KV(K241-V255)区域和D2R的IV(I256-V270)区域，这些区域在D2R上的具体位置如图2所示。

按照本实施例中的方法，使用含有D2R的KT区域的GST融合蛋白(GST-D2R-KT)、含有D2R的KL区域的GST融合蛋白(GST-D2R-KL)、含有D2R的KV区域的GST融合蛋白(GST-D2R-KV)和含有D2R的IV区域的GST融合蛋白(GST-D2R-IV)进行pulldown分析，免疫印迹结果如图3中C所示。

令人意外地，由图3中C表明：D2R的KL区域(K226-L240)不能沉淀NR2B，而D2R的KT区域(K211-T225，下文称为KT多肽)亲和沉淀了NR2B。

实施例4多肽在体内阻止复合物的偶合

为了验证D2R的KT多肽在体内对D2R/NR2B复合物的作用，将区域(K211-T225)C端与HIV-1型Tat蛋白的转导结构域(如SEQ ID NO:6所示，下文称为TAT)的N端融合，得到可以通透血脑屏障的融合蛋白，命名为TAT-D2R-KT。

使用TAT-D2R-KT分别对CPP小鼠和BS小鼠进行处理，仅TAT处理的小鼠用作对照(处理方式均为单次腹腔给药，10ml/kg体重，药物浓度3nmol/g)。处理1小时后，按照实施例1中免疫共沉淀方法进行分析，结果如图4所示。

由图4可知，本发明的KT多肽竞争性地破坏了CPP小鼠和BS小鼠海马组织中D2R/NR2B的相互作用。

实施例5多肽干扰吗啡诱导的CPP形成

为了评价本发明的多肽是否影响吗啡成瘾，在吗啡诱导CPP的形成阶段，用TAT-D2R-KT、TAT测量CPP评分。

CPP设备和测试系统如下：

实验中使用的CPP设备具有两个等体积的室(15厘米×15厘米×37厘米)，中间有可移动的门。小鼠在测试期间能在室之间自由穿梭，或是在训练期间将小鼠限制在室的一侧。一个室内部是黑色的且底板为条纹状，而另一个室是白色的且底板是格子状。所有的行为测试包括活动距离和时间均用摄像机记录，并使用SMART视频跟踪系统(第2.5版；Panlab生物检索技术，西班牙)进行计算。

实验设计如图5所示，在第1天，小鼠被允许自由探索两个室15min，无需任何处理(测试前)。第2、4、6、8天，对照组(生理盐水组)和模型组(吗啡组)分别接受生理盐水(10mL/kg)和吗啡(10mg/kg)。TAT组(3nmol/g)和TAT-D2R-KT组(3nmol/g)在吗啡注射前1小时注射(腹腔给药，10ml/kg体重)。注射药物后，所有小鼠在白色室内训练40min。第3、5、7、9天，所有小鼠给予生理盐水，然后立即置于黑色室40min；第10天，所有小鼠自由探索15min后)测试结束，CPP评分(小鼠活动时长)如图6所示。

由图6可知，与TAT处理的受试者相比，TAT-D2R-KT处理显著降低了CPP评分，表明TAT-D2R-KT能够干扰吗啡诱导的CPP的形成。

实施例6多肽对吗啡诱导的CPP表达阶段的影响

为了进一步评估本发明的多肽对吗啡诱导的CPP表达阶段的特异性影响，使用实施例5中的CPP设备，按照图7中的实验设计进行测试。其中模型组(吗啡组)在第10天注射生理盐水，而TAT-D2R-KT组(吗啡+TAT-D2R-KT)在第10天用TAT-D2R-KT(单剂量)处理CPP小鼠，1小时后测量CPP评分，实验结果如图8中A所示。

由图8中A所示，在第10天使用TAT-D2R-KT处理并没有显著降低CPP评分。

尽管如此，通过在第11天重复CPP试验我们却发现：与第10天相比，第11天TAT-D2R-KT组的CPP评分显著降低(图8中B)，这表明TAT-D2R-KT可能消除第10天吗啡成瘾记忆再现时的相关记忆。

实施例7多肽消除吗啡诱导的复吸

为了验证本发明的多肽能够消除成瘾记忆再现时的相关记忆，并检验其对吗啡CPP复吸的长期影响，我们设计了如图9所示的CPP小鼠自然戒断和复吸实验，并进行了多项测试，其中生理盐水组作为对照。

根据图9所示条件在第10天时，吗啡成功诱导了小鼠CPP，结果如图10所示。

随后小鼠归笼饲养三周。在第32天，TAT组和TAT-D2R-KT组小鼠分别接受TAT、TAT-D2R-KT(3nmol/g)处理；1小时后，小鼠自由探索15min进行测试1，结果如图11所示。

由图11可知，与TAT组小鼠相比，TAT-D2R-KT组小鼠的CPP评分显著降低，表明本发明的多肽能够消除由环境引发的复吸。

为了进一步探索多肽对成瘾药物诱导的复吸的可能影响，在测试1后，各组继续归笼饲养三周，并于第54天给TAT组和TAT-D2R-KT组注射吗啡(5mg/kg)，所有小鼠立即置入试验室自由探索15min进行测试2，结果如图12所示。

由图12可知，与TAT组小鼠相比，TAT-D2R-KT组小鼠的CPP评分再次显著降低。

为了排除剂量效应，在测试2后各组归笼饲养两周，并于第69天给TAT组和TAT-D2R-KT组小鼠注射更高剂量的吗啡(15mg/kg)，然后所有小鼠自由探索15分钟进行测试3，结果如图13所示。

令人惊讶的是，更高剂量的吗啡仍然不能逆转TAT-D2R-KT显著降低CPP评分的效果，这表明TAT-D2R-KT可以消除低剂量/高剂量成瘾物质诱导的复吸。

为了进一步探索TAT-D2R-KT对压力诱导的复吸的影响，在测试3后各组归笼饲养一周，并于在第77天给予TAT组和TAT-D2R-KT组小鼠育亨宾(α2-肾上腺素受体拮抗剂，2mg/kg，购自MCE，货号18735)后测试15分钟，记为测试4，结果示于图14中。

由图14可知，TAT-D2R-KT组小鼠与对照组的CPP评分没有显著差异，表明本发明的多肽成功阻断了应激引发的复吸。

实施例8使用行为致敏模型对抗成瘾相关行为进行验证

为了进一步验证本发明多肽对吗啡成瘾相关行为的影响，使用吗啡诱导的行为致敏小鼠(BS)模型对上述结果进行了验证。

按照图15所示的方案进行实验，在第1天，所有小鼠习惯试验室1小时。然后，给予小鼠生理盐水(对照组)或5mg/kg吗啡(TAT组和TAT-D2R-KT组)，并进入试验室(具有白色表面和平坦底面，尺寸50cm×50cm×35cm

随后所有小鼠回笼饲养1周，于第9天，在使用吗啡(1mg/kg)前1小时给予小鼠TAT或TAT-D2R-KT(3nmol/g)，随后所有小鼠进入试验室进行测试以评估药物的影响(记为测试2)。图16中B所示的结果显示，TAT-D2R-KT组小鼠60分钟的运动活动显著减少。

测试2后，所有小鼠回笼饲养一周(戒断)，随后再次进入试验室进行测试(记为测试3)。图16中C所示的结果表明，1周的戒断后TAT-D2R-KT组中仍可以检测到运动活动的显著减少，这进一步表明通过多肽能够消除吗啡诱导的复吸。

实施例9多肽变体的设计与制备

以KT多肽为基础(记为Pep1)，分别设计并合成了N端缺失变体Pep2、C端缺失变体Pep3、中段RRR突变为GGG的变体Pep4，以及中段RKR突变为GGG的变体Pep5，具体如下表1所示：

表1

随后将Pep1至Pep5的C端分别与TAT的N端融合得到可以通透血脑屏障的融合肽。

实施例10验证不同多肽对吗啡所致小鼠CPP的影响

小鼠给予吗啡(1mg/kg)或生理盐水8天，第10天通过腹腔注射(10ml/kg)将实施例9中的不同多肽(3nmol/g)分别给药至小鼠；在给药后的第2天根据实施例5中的CPP实验方法记录吗啡诱导的CPP的表达，结果如图17所示。

由图17可知，Pep1及截短型的Pep2和Pep3显著降低了吗啡CPP小鼠的活动距离；而中段经取代的Pep4和Pep5未能显著降低活动距离，提示多肽的关键基序位于Pep1的中段。

实施例11验证不同多肽对可卡因所致小鼠BS的影响

为了验证本发明多肽同样对可卡因引起的成瘾有效，进行了以下测试：

小鼠给予可卡因(15mg/kg)或生理盐水后测试30分钟，重复5天，随后暂停给予5天。在暂停的第6天给予可卡因前1小时通过腹腔注射(10ml/kg)将实施例9中的不同多肽(3nmol/g)分别给药至小鼠，进行药物诱发并进行测试，结果如图18所示。

由图18可知，与预期一致，Pep1及截短型的Pep2和Pep3显著抑制了敏化行为的表达；而中段经取代的Pep4和Pep5未能抑制敏化行为的表达。

实施例12验证不同多肽对酒精所致小鼠BS的影响

为了验证本发明多肽同样对酒精引起的成瘾有效，进行了以下测试：

训练期共10天，小鼠隔天给予酒精(2.2g/kg)或生理盐水后立即测试15分钟。在训练后第3天，小鼠在给予酒精前1小时通过腹腔注射(10ml/kg)将实施例9中的不同多肽(3nmol/g)分别给药至小鼠，进行药物诱发并进行测试，结果如图19所示。

由图19可知，与预期一致，Pep1及截短型的Pep2和Pep3显著抑制了敏化行为的表达；而中段经取代的Pep4和Pep5未能抑制敏化行为的表达。

序列表

<110> 深圳辰扬生物科技有限公司

<120> 多肽的抗成瘾及其复发的用途、复合体及多肽

<130> 2113764-I-CP-CYSW

<160> 8

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 15

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 1

Lys Ile Tyr Ile Val Leu Arg Arg Arg Arg Lys Arg Val Asn Thr

1 5 10 15

<210> 2

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 2

Tyr Ile Val Leu Arg Arg Arg Arg Lys Arg Val

1 5 10

<210> 3

<211> 13

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 3

Tyr Ile Val Leu Arg Arg Arg Arg Lys Arg Val Asn Thr

1 5 10

<210> 4

<211> 13

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 4

Lys Ile Tyr Ile Val Leu Arg Arg Arg Arg Lys Arg Val

1 5 10

<210> 5

<211> 2482

<212> DNA

<213> 智人

<400> 5

agagcctggc cacccagtgg ctccaccgcc ctgatggatc cactgaatct gtcctggtat 60

gatgatgatc tggagaggca gaactggagc cggcccttca acgggtcaga cgggaaggcg 120

gacagacccc actacaacta ctatgccaca ctgctcaccc tgctcatcgc tgtcatcgtc 180

ttcggcaacg tgctggtgtg catggctgtg tcccgcgaga aggcgctgca gaccaccacc 240

aactacctga tcgtcagcct cgcagtggcc gacctcctcg tcgccacact ggtcatgccc 300

tgggttgtct acctggaggt ggtaggtgag tggaaattca gcaggattca ctgtgacatc 360

ttcgtcactc tggacgtcat gatgtgcacg gcgagcatcc tgaacttgtg tgccatcagc 420

atcgacaggt acacagctgt ggccatgccc atgctgtaca atacgcgcta cagctccaag 480

cgccgggtca ccgtcatgat ctccatcgtc tgggtcctgt ccttcaccat ctcctgccca 540

ctcctcttcg gactcaataa cgcagaccag aacgagtgca tcattgccaa cccggccttc 600

gtggtctact cctccatcgt ctccttctac gtgcccttca ttgtcaccct gctggtctac 660

atcaagatct acattgtcct ccgcagacgc cgcaagcgag tcaacaccaa acgcagcagc 720

cgagctttca gggcccacct gagggctcca ctaaagggca actgtactca ccccgaggac 780

atgaaactct gcaccgttat catgaagtct aatgggagtt tcccagtgaa caggcggaga 840

gtggaggctg cccggcgagc ccaggagctg gagatggaga tgctctccag caccagccca 900

cccgagagga cccggtacag ccccatccca cccagccacc accagctgac tctccccgac 960

ccgtcccacc atggtctcca cagcactccc gacagccccg ccaaaccaga gaagaatggg 1020

catgccaaag accaccccaa gattgccaag atctttgaga tccagaccat gcccaatggc 1080

aaaacccgga cctccctcaa gaccatgagc cgtaggaagc tctcccagca gaaggagaag 1140

aaagccactc agatgctcgc cattgttctc ggcgtgttca tcatctgctg gctgcccttc 1200

ttcatcacac acatcctgaa catacactgt gactgcaaca tcccgcctgt cctgtacagc 1260

gccttcacgt ggctgggcta tgtcaacagc gccgtgaacc ccatcatcta caccaccttc 1320

aacattgagt tccgcaaggc cttcctgaag atcctccact gctgactctg ctgcctgccc 1380

gcacagcagc ctgcttccca cctccctgcc caggccggcc agcctcaccc ttgcgaaccg 1440

tgagcaggaa ggcctgggtg gatcggcctc ctcttcttag ccccggcagg ccctgcagtg 1500

ttcgcttggc tccatgctcc tcactgcccg cacaccctca ctctgccagg gcagtgctag 1560

tgagctgggc atggtaccag ccctggggct ggccccagct caggggcagc tcatagagtc 1620

ccccctccca cctccagtcc ccctatcctt ggcaccaaag atgcagccgc cttccttgac 1680

cttcctctgg ggctctaggg ttgctggagc ctgagtcagg gcccagaggc tgagttttct 1740

ctttgtgggg cttggcgtgg agcaggcggt ggggagagat ggacagttca caccctgcaa 1800

ggcccacagg aggcaagcaa gctctcttgc cgaggagcca ggcaacttca gtcctgggag 1860

acccatgtaa ataccagact gcaggttgga cccgagagat tcccaagcca aaaaccttag 1920

ctccctcccg caccccgatg tggacctcta ctttccaggc tagtccggac ccacctcacc 1980

ccgttacagc tccccaagtg gtttccacat gctctgagaa gaggagccct catcttgaag 2040

ggcccaggag ggtctatggg gagaggaact ccttggccta gcccaccctg ctgccttctg 2100

acggccctgc aatgtatccc ttctcacagc acatgctggc cagcctgggg cctggcaggg 2160

aggtcaggcc ctggaactct atctgggcct gggctaggga catcagaggt tctttgaggg 2220

actgcctctg ccacactctg acgcaaaacc actttccttt tctattcctt ctggcctttc 2280

ctctctcctg tttcccttcc cttccactgc ctctgcctta gaggagccca cggctaagag 2340

gctgctgaaa accatctggc ctggcctggc cctgccctga ggaaggaggg gaagctgcag 2400

cttgggagag cccctggggc ctagactctg taacatcact atccgatgca ccaaactaat 2460

aaaactttga cgagtcacct tc 2482

<210> 6

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 6

Tyr Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg

1 5 10

<210> 7

<211> 15

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 7

Lys Ile Tyr Ile Val Leu Gly Gly Gly Arg Lys Arg Val Asn Thr

1 5 10 15

<210> 8

<211> 15

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 8

Lys Ile Tyr Ile Val Leu Arg Arg Arg Gly Gly Gly Val Asn Thr

1 5 10 15