一种快速高效的烟草毛状根诱导和扩繁的方法

技术领域

本发明涉及一种快速高效的烟草毛状根诱导和扩繁的方法，属于农业应用生物技术领域。

背景技术

烟草的根系是烟草生长及品质的基础，目前，对烟草根系的研究方兴未艾，但烟草根系在土壤内无法直接了解，如何能够直观的研究根系，是一个难点。烟草毛状根作为人工诱导生成的生物反应器，能直观的观测根的生长，直接对根系进行研究。

目前，对烟草毛状根的诱导，多采用无菌苗的形式。其中，相关文献报道多采用无菌苗进行处理，无菌苗成本较高，且对菌体污染和烟苗生长要求很高，需要相关仪器设备，不利于研究和生产，从而制约了毛状根的诱导效率。近年来，相关文献报道了发根农杆菌(A4、R1000、R1601)可以诱导烟草无菌苗发根，但并未有相关文献报道土培苗可以直接诱导毛状根方法。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术中的不足，提供一种快速高效的烟草毛状根诱导和扩繁的方法，通过直接诱导烟草土培苗，实现土培苗烟草毛状根快速、高效的诱导，适用于多种烟草品种的毛状根的诱导。

为解决上述技术问题，本发明是采用下述技术方案实现的：

本发明提供一种快速高效的烟草毛状根诱导和扩繁的方法，所述方法包括如下步骤：

将烟草土培苗的外植体用活化的发根农杆菌侵染液侵染；

将经侵染后的外植体接种于共培养的培养基上暗培养24～48h；

将经暗培养的外植体转移至发根诱导培养基上诱导培养；

将经诱导培养产生的毛状根进行继代培养和扩增培养。

作为一种优选实施方式，所述侵染液采用50mL OD值(600)0.8发根农杆菌进行离心，用等体积MS液体进行重悬制得。

作为一种优选实施方式，所述发根农杆菌包括A4、R1000、R1601中的任意一种。

作为一种优选实施方式，将烟草土培苗的叶片剪成(1～2)cm×(1～2)cm，加入侵染液中，侵染5～10min后，进行共培养。

作为一种优选实施方式，将经侵染后的外植体在暗培养结束后，转移至含有50mg/mL头孢MS固体培养基中，培养2～3周。

作为一种优选实施方式，所述诱导培养基组分如下：

20×大量元素母液：NH

200×微量元素母液：KI 0.166g，H

200×铁盐母液：FeSO

200×有机母液：肌醇20.0g，烟酸0.1g，VB

20×钙盐母液：CaC1

所述诱导培养基的制备方法如下：

组分称量后，使用去离子水溶解并定容到1L，之后121℃高温灭菌15min备用；

MS液体培养基的配制：

20×大量元素母液50mL，200×微量元素母液5mL；

200×铁盐母液5mL，20×Ca盐母液50mL；

200×有机母液5mL，调pH到5.8-6.2。

作为一种优选实施方式，所述烟草土培苗为4周龄土培苗。

与现有技术相比，本发明所达到的有益效果：

1、本发明提供的一种快速高效的烟草毛状根诱导和扩繁的方法，所述方法包括如下步骤：将烟草土培苗的外植体用活化的发根农杆菌侵染液侵染；将经侵染后的外植体接种于共培养的培养基上暗培养24～48h；将经暗培养的外植体转移至发根诱导培养基上诱导培养；将经诱导培养产生的毛状根进行继代培养和扩增培养，利用发根农杆菌诱导烟草土培苗产生毛状根。

2、本发明提供的一种快速高效的烟草毛状根诱导和扩繁的方法，通过研究发现，侵染液采用50mL OD值(600)0.8发根农杆菌进行离心，并用等体积MS液体进行重悬制得，所述发根农杆菌(A4、R1000、R1601)的在OD值在0.8时，能够高效诱导出毛状根，且A4农杆菌诱导效率最高，可以达到70％的诱导率，诱导的毛状根可以持续生产，作为生化反应器进行相关实验探究。

3、本发明提供的一种快速高效的烟草毛状根诱导和扩繁的方法，适用于多种烟草品种的毛状根的诱导，具有取材方便、诱导速度快、遗传稳定及节约成本等优点，通过诱导烟草土培苗，实现土培苗烟草毛状根快速、高效的诱导和扩繁。

附图说明

图1是本发明实施例提供的采用一种快速高效的烟草毛状根诱导和扩繁的方法对土培苗外植体的诱导过程示意图；

图中：A、烟草土培苗；B、用发根农杆菌接种预培养的受伤烟草外植体；C、发根农杆菌；D、受伤烟草外植体伤口处出现毛状根；E、毛状根被切除，在MS固体培养上培养。

具体实施方式

下面将对本发明作进一步描述。以下实施例仅用于更加清楚地说明本发明的技术方案，而不能以此来限制本发明的保护范围。

以下实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，下述实施例中所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

一、快速高效的烟草毛状根诱导和扩繁的方法

实施例1

步骤一：将土培苗的烟草外植体用野生型A4发根农杆菌侵染液侵染。

具体地，将4周龄的烟草土培苗的外植体剪成1×1cm的叶片，即将烟草土培苗的叶片，加入侵染液中，侵染5min，需要说明的是，所述侵染液采用50mL OD值(600)0.8发根农杆菌进行离心，用等体积MS液体进行重悬制得。

步骤二：本实施例中，在25℃的条件下，将经侵染后的外植体接种于共培养的培养基上暗培养48h，所述共培养的培养基为MS培养基，暗培养48h后，此时，外植体分化形成毛状根。

步骤三：将经暗培养的外植体转移至发根诱导培养基上诱导培养，剪去3cm毛状根在加入50mg/mL头孢MS固体培养基上进行筛选培养，3周后，筛选出生长速度快的烟草毛状根。

步骤四：将经诱导培养产生的毛状根进行继代培养和扩增培养，获得大量烟草毛状根。

本实施例中，将所述烟草毛状根放置于50mg/mL头孢的MS固体培养基上进行继代培养，继代培养2-3次以后，得到脱毒的烟草毛状根。需要说明的是，将剪去3cm毛状根加入MS液体培养基上进行扩大培养，能够使得毛状根生长得更快，除了在温度为25℃的环境下，还需要在光源下进行培养。

实施例2

步骤一：将土培苗的烟草外植体用野生型R1000发根农杆菌侵染液侵染。

具体地，将4周龄的烟草土培苗的外植体剪成1×1cm的叶片，即将烟草土培苗的叶片，加入侵染液中，侵染10min，需要说明的是，所述侵染液采用50mL OD值(600)0.8发根农杆菌进行离心，用等体积MS液体进行重悬制得。

步骤二：本实施例中，在25℃的条件下，将经侵染后的外植体接种于共培养的培养基上暗培养24h，所述共培养的培养基为MS培养基，暗培养24后，此时，外植体分化形成毛状根。

步骤三：将经暗培养的外植体转移至发根诱导培养基上诱导培养，剪去2cm毛状根在加入50mg/mL头孢MS固体培养基上进行筛选培养，2周后，筛选出生长速度快的烟草毛状根。

步骤四：将经诱导培养产生的毛状根进行继代培养和扩增培养，获得大量烟草毛状根。

本实施例中，将所述烟草毛状根放置于50mg/mL头孢的MS固体培养基上进行继代培养，继代培养2-3次以后，得到脱毒的烟草毛状根。需要说明的是，将剪去3cm毛状根加入MS液体培养基上进行扩大培养，能够使得毛状根生长得更快，除了在温度为25℃的环境下，还需要在光源下进行培养。

实施例3

步骤一：将土培苗的烟草外植体用野生型R1601发根农杆菌侵染液侵染。

具体地，将4周龄的烟草土培苗的外植体剪成1×1cm的叶片，即将烟草土培苗的叶片，加入侵染液中，侵染10min，需要说明的是，所述侵染液采用50mL OD值(600)0.8发根农杆菌进行离心，用等体积MS液体进行重悬制得。

步骤二：本实施例中，在25℃的条件下，将经侵染后的外植体接种于共培养的培养基上暗培养48h，所述共培养的培养基为MS培养基，暗培养48h后，此时，外植体分化形成毛状根。

步骤三：将经暗培养的外植体转移至发根诱导培养基上诱导培养，剪去2-3cm毛状根在加入50mg/mL头孢MS固体培养基上进行筛选培养，3周后，筛选出生长速度快的烟草毛状根。

步骤四：将经诱导培养产生的毛状根进行继代培养和扩增培养，获得大量烟草毛状根。

本实施例中，将所述烟草毛状根放置于50mg/mL头孢的MS固体培养基上进行继代培养，继代培养2-3次以后，得到脱毒的烟草毛状根。需要说明的是，将剪去3cm毛状根加入MS液体培养基上进行扩大培养，能够使得毛状根生长得更快，除了在温度为25℃的环境下，还需要在光源下进行培养。

实施例4

步骤一：将土培苗的烟草外植体用野生型A4发根农杆菌侵染液侵染。

具体地，将4周龄的烟草土培苗的外植体剪成1×1cm的叶片，即将烟草土培苗的叶片，加入侵染液中，侵染5min，需要说明的是，所述侵染液采用50mL OD值(600)0.7发根农杆菌进行离心，用等体积MS液体进行重悬制得。

步骤二：本实施例中，在25℃的条件下，将经侵染后的外植体接种于共培养的培养基上暗培养24h，所述共培养的培养基为MS培养基，暗培养24h后，此时，外植体分化形成毛状根。

步骤三：将经暗培养的外植体转移至发根诱导培养基上诱导培养，剪去3cm毛状根在加入50mg/mL头孢MS固体培养基上进行筛选培养，3周后，筛选出生长速度快的烟草毛状根。

步骤四：将经诱导培养产生的毛状根进行继代培养和扩增培养，获得大量烟草毛状根。

本实施例中，将所述烟草毛状根放置于50mg/mL头孢的MS固体培养基上进行继代培养，继代培养3次以后，得到脱毒的烟草毛状根。需要说明的是，将剪去3cm毛状根加入MS液体培养基上进行扩大培养，能够使得毛状根生长得更快，除了在温度为25℃的环境下，还需要在光源下进行培养。

实施例5

步骤一：将土培苗的烟草外植体用野生型A4发根农杆菌侵染液侵染。

具体地，将4周龄的烟草土培苗的外植体剪成1×1cm的叶片，即将烟草土培苗的叶片，加入侵染液中，侵染5min，需要说明的是，所述侵染液采用50mL OD值(600)0.8发根农杆菌进行离心，用等体积MS液体进行重悬制得。

步骤二：本实施例中，在25℃的条件下，将经侵染后的外植体接种于共培养的培养基上暗培养24h，所述共培养的培养基为MS培养基，暗培养24h后，此时，外植体分化形成毛状根。

步骤三：将经暗培养的外植体转移至发根诱导培养基上诱导培养，剪去3cm毛状根在加入50mg/mL头孢MS固体培养基上进行筛选培养，3周后，筛选出生长速度快的烟草毛状根。

步骤四：将经诱导培养产生的毛状根进行继代培养和扩增培养，获得大量烟草毛状根。

本实施例中，将所述烟草毛状根放置于50mg/mL头孢的MS固体培养基上进行继代培养，继代培养3次以后，得到脱毒的烟草毛状根。需要说明的是，将剪去3cm毛状根加入MS液体培养基上进行扩大培养，能够使得毛状根生长得更快，除了在温度为25℃的环境下，还需要在光源下进行培养。

实施例6

步骤一：将土培苗的烟草外植体用野生型A4发根农杆菌侵染液侵染。

具体地，将4周龄的烟草土培苗的外植体剪成1×1cm的叶片，即将烟草土培苗的叶片，加入侵染液中，侵染5min，需要说明的是，所述侵染液采用50mL OD值(600)0.9发根农杆菌进行离心，用等体积MS液体进行重悬制得。

步骤二：本实施例中，在25℃的条件下，将经侵染后的外植体接种于共培养的培养基上暗培养24h，所述共培养的培养基为MS培养基，暗培养24h后，此时，外植体分化形成毛状根。

步骤三：将经暗培养的外植体转移至发根诱导培养基上诱导培养，剪去3cm毛状根在加入50mg/mL头孢MS固体培养基上进行筛选培养，2周后，筛选出生长速度快的烟草毛状根。

步骤四：将经诱导培养产生的毛状根进行继代培养和扩增培养，获得大量烟草毛状根。

本实施例中，将所述烟草毛状根放置于50mg/mL头孢的MS固体培养基上进行继代培养，继代培养3次以后，得到脱毒的烟草毛状根。需要说明的是，将剪去3cm毛状根加入MS液体培养基上进行扩大培养，能够使得毛状根生长得更快，除了在温度为25℃的环境下，还需要在光源下进行培养。

实施例7

步骤一：将土培苗的烟草外植体用野生型A4发根农杆菌侵染液侵染。

具体地，将4周龄的烟草土培苗的外植体剪成1×1cm的叶片，即将烟草土培苗的叶片，加入侵染液中，侵染5min，需要说明的是，所述侵染液采用50mL OD值(600)1.0发根农杆菌进行离心，用等体积MS液体进行重悬制得。

步骤二：本实施例中，在25℃的条件下，将经侵染后的外植体接种于共培养的培养基上暗培养24h，所述共培养的培养基为MS培养基，暗培养24h后，此时，外植体分化形成毛状根。

步骤三：将经暗培养的外植体转移至发根诱导培养基上诱导培养，剪去3cm毛状根在加入50mg/mL头孢MS固体培养基上进行筛选培养，3周后，筛选出生长速度快的烟草毛状根。

步骤四：将经诱导培养产生的毛状根进行继代培养和扩增培养，获得大量烟草毛状根。

本实施例中，将所述烟草毛状根放置于50mg/mL头孢的MS固体培养基上进行继代培养，继代培养3次以后，得到脱毒的烟草毛状根。需要说明的是，将剪去3cm毛状根加入MS液体培养基上进行扩大培养，能够使得毛状根生长得更快，除了在温度为25℃的环境下，还需要在光源下进行培养。

本领域技术人员应当理解，所述烟草土培苗也可以选用3周龄，本发明在此不做限制。

需要说明的是，所述诱导培养基组成如下：

20×大量元素母液：NH

200×微量元素母液：KI 0.166g，H

200×铁盐母液：FeSO

200×有机母液：肌醇20.0g，烟酸0.1g，VB

20×钙盐母液：CaC1

具体地，所述诱导培养基的制备方法如下：

组分称量后，使用去离子水溶解并定容到1L，之后121℃高温灭菌15min备用；

MS液体培养基的配制：

20×大量元素母液50mL，200×微量元素母液5mL；

200×铁盐母液5mL，20×Ca盐母液50mL；

200×有机母液5mL，调pH到5.8-6.2。

本实施例中，MS固体培养基(1L)的配制如下：

在MS液体培养基的基础上，加入3g植物凝胶，应当理解，需要先将MS液体培养基调pH至5.8后，再加入植物凝胶。

二、诱导结果

本发明实施例1～3为采用50mL OD值(600)0.8发根农杆菌进行离心，发根农杆菌(A4、R1000、R1601)直接诱导烟草土培苗的结果。其中，不同菌种的总侵染株数均为100株，诱导结果请参见表1。

表1实施例1～3中发根农杆菌(A4、R1000、R1601)直接诱导烟草土培苗的结果

根据表格1可知，发根农杆菌A4、R1000、R1601直接诱导烟草土培苗的诱导率均达到60％以上，具有较好的诱导效果。

本发明实施例4～7为采用A4发根农杆菌，在不同OD值(600)时，对烟草土培苗的诱导及扩繁的测试结果。不同OD值(600)下，A4发根农杆菌的总侵染株数均为100株，其诱导结果请参见表2。

表2不同OD值(600)时，对烟草土培苗的诱导及扩繁的测试结果

通过研究发现，侵染液采用50mL OD值(600)0.8发根农杆菌进行离心，并用等体积MS液体进行重悬制得，所述发根农杆菌A4在OD值在0.8时，能够高效诱导出毛状根，且A4农杆菌诱导效率最高，可以达到70％的诱导率，诱导的毛状根可以持续生产，作为生化反应器进行相关实验探究。

由此可知，本发明提供的一种快速高效的烟草毛状根诱导和扩繁的方法，能够利用发根农杆菌诱(A4、R1000、R1601)导烟草土培苗产生毛状根，其适用于多种烟草品种的毛状根的诱导，具有取材方便、诱导速度快、遗传稳定及节约成本等优点，通过直接诱导烟草土培苗，实现土培苗烟草毛状根快速、高效的诱导。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和变形，这些改进和变形也应视为本发明的保护范围。